JPS63309189A - 高度に精製したα−１−プロテイナーゼ阻害剤を製造する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、血漿、血漿画分及び血漿濃縮物から高Ｎ度α
−１−プロテイナーゼ阻害剤（ＰＩ）濃縮物を製造する
方法を目的とする。本発明の他の目的は後記する詳しい
説明が明らかとなるであろう。後記の詳しい説明におい
ては部及び百分率は特記しない限り重量による。

α−■−プロテイナーゼ阻害剤は５４，０００の分子量
を持った糖タンパク質である。このタンパク質は、幾つ
かのオリゴ糖単位が共有結合で結合している単一ポリペ
プチド鎖から成る。ヒトＰ■は内在性（ｅｎｄｏｇｅｎ
ｏｕｓ）セリンプロテアーゼによる組織破壊を制御する
役割を持っている。血漿中のトリズシン阻害能力の９０
％の割合を占めるＰＩの遺伝的欠損は肺気腫の早すぎる
発現と関連していることが示された。肺気腫と関連した
エラスチンの分解は、多分エラスチン分解酵素（ａｌａ
ｓｔｏｌｙｔｉｃ　ｅｎｚｙｍｅｓ）と天然に存在して
いる組織及び血漿プロテイナーゼ阻害剤の局所的不均衡
から生じる。ＰＩはヒト膵臓エラスターゼ及び白血球エ
ラスターゼを迅速に阻害する〔バイオケミカル・アンド
・バイオフィジカル・リサーチ・コミユニケージ３ン・
、第７２巻、第１号、３３−３９頁、１９７６、同書、
第８８巻、第２号、３４６−３５０頁、ｌ　９７９　（
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍ、、　Ｖｏｌ、　７２＋　Ｎｏ、Ｌ　ｐａｇｅ
ｓ　３３−３９　；　１ｂｉｄ、。

Ｖｏｌ、　８８．　Ｎｏ、　２．　ｐａｇｅｓ　３４６
−３５０．１９７９）。

血漿からＰＩを単離するのに使用される多数の方法が米
国特許第４．４３９．３５８号、第４，３７９．０８７
号及び第４．６５６，２５４号に記載されており、これ
らは引照により本明細書に加入する。

パネル等、バイオケミストリー、第１３巻、５４３９−
５４４５頁、（１９７４）　　［Ｐａｎｎｒｌｌ　ｅｔ
ａｌ　　、、　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　　Ｖｏ
ｌ、　　１３．　　ｐａｇｅｓ　　５４３９−５４４５
　（１９７４）］　は、］セファロースーブルーデキス
トランＳｅｐｈａｒｏｓｅ−Ｂｌｕｅ　Ｄｅｘｔｒａｎ
）吸着を使用し、次いでプールしそして固体硫酸アンモ
ニウムにより分画することより成る血漿からアルブミン
を除去する方法を教示している。

グレーザー（Ｇｌａｓｅｒ　ａｔ　ａｌ）、ＥＰ８２１
０３４７３は、ジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈ
ｒｅｉｔｏｌ）の如き還元剤を使用してスルフィド結合
を切断しそして５０％（Ｎ　Ｈ１）　！Ｓ　Ｏ４で塩析
することにより沈澱させて所望しないタンパク質を除去
することを教示している。

本発明は、アルブミンのジスルフィド結合全切断するの
に十分な温和な還元剤を加えそしてＰＩと温和な還元剤
を含有する溶液を加熱して、不安定化タンパク質が再結
合するのを防止することによって、ｐｔを含有する溶液
からアルブミンを除去することにより高度に精製したＰ
Ｉ濃縮物を製造する方法である。

好ましい態様においては、ファンの方法（ｃｏａｎｍｅ
ｔｈｏｄｓ）、米国特許第４，３７９．０８７号及び第
４．４３９，３５８号及び米国特許出願第７９３゜８０
７号、及び米国特許第４，６５６．２５４号、α−１−
プロテイナーゼ阻害剤の改良された製法、に記載の改良
に従って血漿又は血漿画分から分離される。ＰＩはジス
ルフィド結合を持っていないので、分離したＰＩの溶液
に前記還元剤を加えてＰＩを還元することなくタンパク
質のジスルフィド結合を切断することができる。使用で
きる還元剤は、ジチオトレイトール、ジチオエリトリト
ール、２−メルカプトエタノール、メルカプト酢酸、水
素化ホウ素ナトリウム及びシスティンである。

約２ｍＭ乃至８ｍＭの濃度で還元剤を存在させる。

還元剤の濃度は、ＰＩを含有する溶液の種類及び還元剤
の選択に依存して変わる。還元剤の量は、ＰＩ又は他の
回収されるべきタンパク質を変性又は損傷することなく
ジスルフィド結合を還元するのに十分なものでなければ
ならない。ＰＩ及び還元剤を含有する溶液のｐＨを調節
して反応の速度を最適化しそして反応を停止させること
もできる。

還元されたタンパク質の熱変性は、約３５℃又はそれよ
り高い温度に上昇させることにより達成することができ
る。

熱変性は熱処理ウィルス不活性化工程と組み合わせて行
うこともできる。米国特許第４．４７０゜９６８号には
、熱安定化又は低温殺菌安定化量のポリオール及びクエ
ン酸イオンのソースと混合することによって約６０℃−
１００℃の温度で低温殺菌又は加熱する間の熱に対して
凝固因子■、■、■及びＸを安定化させる方法が開示さ
れている。

これらの凝固因子の低温殺菌された組成物は、通常水性
媒体に懸濁又は可溶化した低温殺菌されていないタンパ
ク質組成物、ポリオール及びクエン酸イオンのソースの
混合物を加熱することによって得られた。低温殺菌又は
熱処理に続いて、慣用の方法によりタンパク質組成物か
ら所望により完全に又は部分的にポリオール及びクエン
酸イオンを除去しそして低温殺菌されたタンパク質組成
物をその最終の治療学的使用のために慣用の方法に従っ
て処理する。限定ではなく説明として、米国特許第４，
４７０．９６８号の方法（川魚により本明細書に加入す
る）又は熱不活性化のためのこの特許に記載の先行技術
の方法を使用することができる。

本発明の１つの利点は、所望されないタンパク質を除去
するのに硫酸アンモニウムの添加を必要としない本質的
に純粋なＰＩ調製物が得られることである。

本発明の他の利点は、熱不活性化工程により所望されな
いタンパク質を除去する工程の導入である。熱不活性化
の前にいつでも水性溶液に温和な還元剤を加えることが
できそして、低温殺菌されたタンパク質組成物を最終の
治療学的使用のために慣用の技術に従って処理すると所
望されないタンパク質を除去することができる。

還元剤及び変性されたタンパク質は、塩析工程を追加す
ることなく限外ろ過及びアニオン交換法により除去する
ことができる。

血漿からＰＩを得るための最近の方法は出発物質として
、コーン画分（ｃｏｈｎ　Ｆｒａｃｔｉｏｎ）ＩＶ及び
■−１を使用し、そして他のタンパク質が最初に除去さ
れているこれらの両分の再生物（ｒｅｗｏｒｋｓ）、コ
ーン流出液（ｃｏｈｎ　Ｅｆｆｌｕｅｎｔ）Ｉ［＋　Ｉ
［［及びコーン流出液■及び冷凍上澄溶液（ｃｒｙｏｓ
ｕｐｅｒｎａＬａｎｔ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）を包含する
。血漿をコーン（ｃｏｈｎ）のエタノール分画方法又は
その改変方法［例えば、コーン等、ジャーナル・オン・
アメリカン・ケミカル・ソサイエティー・、６８，４５
９、（１９４６）（ｃｏｈｎ　ａｔ　ａｌ、、　Ｊ、　
Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、、　６８，４５９゜（１
９４６）　；オンクレイ（Ｏｎｃ　１ｅｙ）等、同書、
７１，５４１　（１９４９）；米国特許第２．３９０．
０７４号；“血漿タンパク質”、第２編、第３巻、５４
８−５５０頁、アカデミツク・プレス、ニューヨーク州
、ニューヨーク市（“Ｔｈｅ　Ｐｌａｓｍａ　Ｐｒｏｔ
ｅｉｎｓ″。

５ｅｃｏｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ、　Ｖｏｌ、　ｍ　、　
ｐａｇｅｓ　５４８−５５０．　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐ
ｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｎ、　Ｙ、）］に従
って分画してＰＩを含有するコーン画分を得る。ジスル
フィド結合を含有するタンパク質を除去するためのこの
方法は、遺伝子工学的に作り出されたＰＩににおいて、
組織培養培地又は他の溶離液の如きＰＩを含有する溶液
がアルブミンの如きジスルフィドタンパク質も含有する
状況で適用することができる。

ＰＩは、ファン等、ボックス・サンギニス・４８：３３
３−３４２．１９８５　（ｃｏａｎ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｖｏｘ　Ｓａｎｇ、　４８　：　３３３−３４２．１９
８５）　；米国特許第４゜３７９．０８７号及び第４．
４３９．３５８号に記載の方法及び？−ラー（５ｈｅａ
ｒｅｒ）等により米国特許第４．６５６，２５４号に記
載された改良法に従って製造された。

ジチオトレイトールを５ｍＭの濃度のファンの精製され
たカラム溶離物（ｃｏａｎ’ｓ　　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　
　ｃｏｌｕｍｎ　ｅｌｕａｔｅ）に加え、ｐＨを８．０
−８．２に調節した。溶液を２０分間混合せしめそして
ｐＨを６．５に調節することによって反応を停止させた
。

温和な還元剤を含有するこのＰＩ溶液を、ファン及びミ
トラ、ボックス・サンギニス・４６：１４２　１４８　
（１９８４）　（ｃｏａｎ　ａｎｄ　Ｍｉｔｒａ、　Ｖ
ｏｘＳａｎｇ、　４６：　１４２−１４８　（１９８４
））により指示された如くスクロース及びクエン酸塩の
存在下に６０℃で１０時間熱処理して、溶液がウィルス
を含まないようにした。熱処理溶液をｐＨ６，５の０．
０２５Ｍリン酸ナトリウムと平衡化されたＤＥＡＥセフ
ァロースカラムに加えることにより変性タンパク質を除
去した。ｐＨ６，５のＯ，ＩＭへのリン酸塩勾配を使用
してＰＩを取り出した。このＰＩは特異的活性（ｍ　ｇ
　　Ｐ　Ｉ　／　Ａ　２ｍ、）、ＣＡ　Ｅ及びＨＰＬＣ
によりほぼ１００％純度であることが見出だされた。対
照的に、ファン／シーラーの先行技術の方法では約６０
％のＰ！線純度得られた。

σ−１−プロテイナーゼ阻害剤を含有する血漿タンパク
質の混合物から所望されないタンパク質を除去する上記
の方法は、 （ａ）α−１−プロテイナーゼ阻害剤を含有する血漿タ
ンパク質の混合物に温和な還元剤を加え、該還元剤はａ
　−１−プロテイナーゼ阻害剤を還元することなくジス
ルフィド結合を還元するのに十分な濃度とし、 （ｂ）工程（ａ）の組成物を水性媒体中でスクロース又
は還元糖から選ばれるポリオール及びクエン酸イオンの
ソースと共に混合し、該ポリオール及びクエン酸イオン
を低温殺菌の間タンパク質□を安定化させるのに十分な
量存在させ、（ｃ）前記組成物を低温殺菌するのに十分
な時間及び温度で前記混合物を加熱すること、を含む工
程により行うことができる。

一般に、工程（ｂ）の混合物中のポリオール及びクエン
酸イオンの量は重量対容量基準でポリオール約２０％な
いし飽和量及び約０．１−１．０モルのクエン酸イオン
／溶液ＩＱである。

熱変性は、ＰＩ及びジスルフィド結合を還元するのに十
分な温和な還元剤を含有する溶液の温度を３５℃以上の
レベルに上昇させることによってウィルス不活性化工程
とは無関係に行うことができる。還元剤は限外ろ過によ
り回収することができる。ＰＩは適当なアニオン交換媒
体を使用するカラムクロマトグラフィーにより前記熱処
理された溶液から回収することができる。

本発明の主なる特徴及び態様は以下のとおりである。

１、（ａ）α−１−プロテイナーゼ阻害剤を含有する血
漿タンパク質の混合物に温和な還元剤を加え、該還元剤
はα−１−プロテイナーゼ阻害剤を還元することなくジ
スルフィド結合を還元するのに十分な濃度とし、 （ｂ）工程（ａ）の溶液の温度を３５℃以上に上昇させ
、そして （ｃ）前記溶液からα−１−プロテイナーゼ阻害剤を回
収すること、 を特徴とする血漿タンパク質の混合物から高度に精製し
たａ　−１−プロテイナーゼ阻害剤を製造する方法。

２、温和な還元剤がジチオトレイトール、ジチオエリト
リトール、水素化ホウ素ナトリウム、β−メルカプトエ
タノール及びシスティンから成る群より選ばれる上記ｌ
に記載の方法。

３、前記還元剤の濃度が約２ｍＭ乃至約８ｍＭの範囲に
ある上記２に記載の方法。

４、前記還元剤が５ｍＭのジチオトレイトールである上
記３に記載の方法。

５、前記溶液を約７．９乃至約８．５の範囲のｐＨで約
５分乃至約９５分間混合す上記２に記載の方法。

６、前記温度範囲が３５℃以上である上記５に記載の方
法。

７、前記溶液を約２５℃の温度で約８．０乃至約８．２
の範囲のｐＨで約２０分間混合する上記４に記載の方法
。

８、ｐＨを７．６以下に調節することによって前記反応
を停止させる上記２に記載の方法。

９、ｐ）（を約６．５に調節する上記８に記載の方法。

１０、工程（ｃ）から得られたσ−１−ズロテイナーゼ
阻害剤の前記水性溶液を、感染性微生物を不活性化させ
そして感染性微生物の感染性を減少させるように処理し
てα−１−プロテイナーゼ阻害剤をこのような感染性微
生物に非感染性とし、それによりα−１−プロテイナー
ゼ阻害剤を治療及び予防の目的に有用ならしめる更なる
工程を含む上記ｌに記載の方法。

１ｍ、（ａ）σ−１−プロテイナーゼ阻害剤を含有する
血漿タンパク質の混合物に温和な還元剤を加え、該還元
剤はσ−１−プロテイナーゼ阻害剤を還元することなく
ジスルフィド結合を還元するのに十分な濃度とし、 （ｂ）工程（ａ）の組成物を水性媒体中でスクロース又
は還元糖から選ばれるポリオール及びクエン酸イオンの
ソースと共に混合し、該ポリオール及びクエン酸イオン
を低温殺菌の間タンパク質を安定化させるのに十分な量
存在させ、（ｃ）前記組成物を低温殺菌するのに十分な
時間及び温度で前記混合物を加熱すること、を特徴とす
る血漿タンパク質の混合物から高度に精製したσ−１−
プロテイナーゼ阻害剤を製造する方法。

１２、工程（ｂ）の混合物中のポリオール及びクエン酸
イオンの量が、それぞれ、Ｍｆｊｋ対容量基準でポリオ
ール約２０％乃至飽和量及び溶液ｌＱ当たりクエン酸イ
オン約０．１−１．０モルである上記１１に記載の方法
。

１３、前記混合物を工程（ｃ）で約６０℃−１００℃の
温度に加熱する上記１１に記載の方法。

１４、前記混合物を約１−１０時間加熱する上記１１に
記載の方法。

１５、工程（ｃ）の混合物からポリオール及びクエン酸
イオンを除去する工程を更に含む上記１１に記載の方法
。

１６、工程（ｃ）の前記混合物を定容ろ過（ｄｉａｆ　
ｉ　ＩＬｒａｔ　１ｏｎ）に付すことにより工程（ｃ）
の混合物からポリオール及びクエン酸イオンを除去する
上記１５に記載の方法。

１７、工程（ｃ）の前記混合物を透析又はイオン交換ク
ロマトグラフィーに付すことにより工程（ｃ）の混合物
からポリオール及びクエン酸イオンを除去する上記１５
に記載の方法。

１８、クエン酸イオンの濃度が約０．３Ｍ乃至約０．５
Ｍである上記ＩＩに記載の方法。

１９、スクロースの濃度が３７％（ｗ／ｖ）であり、ク
エン酸イオンの濃度が０．３８Ｍである上記１１に記載
の方法。

２０、ａ−１−プロテイナーゼ阻害剤を含有する血漿タ
ンパク質の水性溶液が、コーン画分ＩＶ　−１、コーン
画分■、コーン画分■及びＩＶ−１の再生物（ｒｅｗｏ
ｒｋｓ）、コーン流出液ｎ＋ｍ；コーン流出液Ｉ及び冷
凍上澄溶液から成る血漿画分の群より選ばれる上記ｌに
記載の方法。

２１、σ−１−プロテイナーゼ阻害剤を含有する血漿タ
ンパク質の水性溶液が、コーン画分■−１、コーン流出
液ＩＶ、コーン流出液■十ｍ及びコーン流出液■から成
る血漿画分の群より選ばれる上記ｌに記載の方法。

２２、ａ−１−プロテイナーゼ阻害剤を含有する血漿タ
ンパク質の水性溶液がコーン画分■−１である上記１に
記載の方法。

２３、（ａ）α−１−プロテイナーゼ阻害剤を含有する
血漿及び血漿画分の群の１つの水性溶液を、該水性溶液
の容量を基準として、ポリエチレングリコール及びポリ
プロピレングリコールから選ばれる重縮合したポリアル
キレングリコール約８％乃至約２３％（ｗ／ｖ）と、約
２℃乃至約５０℃の温度で約０．２−２４時間接触させ
て、α−１−プロテイナーゼ阻害剤を沈澱させることな
く前記溶液から所望しないタンパク質を選択的に沈澱さ
せて所望しないタンパク質を含まないσ−１−プロテイ
ナーゼ阻害剤を含有する混合物を得る工程と、 （ｂ）工程（ａ）から前記混合物を回収する工程と、 （ｃ）工程（ａ）で回収された混合物からα−１−プロ
テイナーゼ阻害剤をカラムクロマトグラフィーにより分
離してα−■−プロテイナーゼ阻害剤を含有する溶離物
を得る工程を含んで成る、σ−１−プロテイナーゼ阻害
剤を含有する血漿タンパク質の水性溶液からσ−１−プ
ロテイナーゼ阻害剤を分離する方法において、 （ｉ）ａ−１−プロテイナーゼ阻害剤を含有する血漿タ
ンパク質の混合物に温和な還元剤を加え、該還元剤はα
−１−プロテイナーゼ阻害剤を還元することなくジスル
フィド結合を還元するのに十分な濃度とし、 （ｉｉ）工程（ａ）の溶液の温度を３５℃以上に上昇さ
せ、そして （ｉｉｉ）前記溶液からα−１−プロテイナーゼ阻害剤
を回収する工程を含むことを特徴とする方法。

２４、（ｉ）使用する血漿又は血漿画分の重量当たり２
０乃至１００容量の緩衝液に溶解した血漿及び血漿画分
の１つの水性溶液を工程（ａ）で使用するために提供し
、 （ｉ）工程（ａ）で使用する前に、前記緩衝液及び工程
（ｉ）からの血漿及び血漿画分の得られる水性溶液の１
つを、生じる溶液のｐＨが９．０乃至１１．０となるよ
うに調節する工程を更に含む上記１に記載の方法。

２５、血漿及び血漿画分の１つの重量当たり２０乃至５
０容量の緩衝液を工程（ｉ）で使用する上記２４に記載
の方法。

２６、血漿及び血漿画分の１つの重量当たり２０乃至３
０容量の緩衝液を工程（ｉ）で使用する上記２４に記載
の方法。

２７、血漿及び血漿画分の１つの重量当たり２４容量の
緩衝液を工程（ｉ）で使用する上記２４に記載の方法。

２８、緩衝液及び得られる水性溶液の１つのｐＨを、生
じる溶液のｐＨが９．０乃至１０．５となるように調節
する上記２５に記載の方法。

２９、緩衝液及び得られる水性溶液の１つのｐＨを、生
じる溶液のｐＨが９．０乃至１Ｏ０５となるように調節
する上記２６に記載の方法。

３０、緩衝液及び得られる水性溶液の１つのｐＨを、生
じる溶液のｐＨが９．０乃至１０．５となるように調節
する上記２７に記載の方法。

３１、前記ｌに記載の方法により製造したプロテアーゼ
阻害有効量のα−１−プロテイナーゼ阻害剤及び製薬学
的に許容しうる担体を含有して成る薬剤組成物。

３２、前記１１に記載の方法により製造したプロテアー
ゼ阻害有効量のσ−１−プロテイナーゼ阻害剤及び製薬
学的に許容しうる担体を含有して成る薬剤組成物。

３３．前記１４に記載の方法により製造したプロテアー
ゼ阻害有効量のα−１−プロテイナーゼ阻害剤及び製薬
学的に許容しうる担体を含有して成る薬剤組成物。

３４、前記２３に記載の方法により製造したプロテアー
ゼ阻害有効量のび−１−プロテイナーゼ阻害剤及び製薬
学的に許容しうる担体を含有して成る薬剤組成物。　　
　　′ ３５、前記２４に記載の方法により製造したプロテアー
ゼ阻害有効量のα−１−プロテイナーゼ阻害剤及び製薬
学的に許容しうる担体を含有して成る薬剤組成物。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）α−１−プロテイナーゼ阻害剤を含有する血
   漿タンパク質の混合物に温和な還元剤を加え、該還元剤
   はα−１−プロテイナーゼ阻害剤を還元することなくジ
   スルフィド結合を還元するのに十分な濃度とし、 （ｂ）工程（ａ）の溶液の温度を３５℃以上に上昇させ
   、そして （ｃ）前記溶液からα−１−プロテイナーゼ阻害剤を回
   収すること、 を特徴とする血漿タンパク質の混合物から高度に精製し
   たα−１−プロテイナーゼ阻害剤を製造する方法。 ２、（ａ）α−１−プロテイナーゼ阻害剤を含有する血
   漿タンパク質の混合物に温和な還元剤を加え、該還元剤
   はα−１−プロテイナーゼ阻害剤を還元することなくジ
   スルフィド結合を還元するのに十分な濃度とし、 （ｂ）工程（ａ）の組成物を水性媒体中でスクロース又
   は還元糖から選ばれるポリオール及びクエン酸イオンの
   ソースと共に混合し、該ポリオール及びクエン酸イオン
   を低温殺菌の間タンパク質を安定化させるのに十分な量
   存在させ、 （ｃ）前記組成物を低温殺菌するのに十分な時間及び温
   度で前記混合物を加熱すること、 を特徴とする血漿タンパク質の混合物から高度に精製し
   たα−１−プロテイナーゼ阻害剤を製造する方法。 ３、（ａ）α−１−プロテイナーゼ阻害剤を含有する血
   漿及び血漿画分の群の１つの水性溶液を、該水性溶液の
   容量を基準としてポリエチレングリコール及びポリプロ
   ピレングリコールから選ばれる重縮合したポリアルキレ
   ングリコール約８％乃至約２３％（ｗ／ｖ）と、約２℃
   乃至約５０℃の温度で約０．２−２４時間接触させて、
   α−１−プロテイナーゼ阻害剤を沈澱させることなく前
   記溶液から所望しないタンパク質を選択的に沈澱させて
   所望しないタンパク質を含まないα−１−プロテイナー
   ゼ阻害剤を含有する混合物を得る工程と、 （ｂ）工程（ａ）から前記混合物を回収する工程と、 （ｃ）工程（ｂ）で回収された混合物からα−１−プロ
   テイナーゼ阻害剤をカラムクロマトグラフィーにより分
   離してα−１−プロテイナーゼ阻害剤を含有する溶離物
   を得る工程を含んで成る、α−１−プロテイナーゼ阻害
   剤を含有する血漿タンパク質の水性溶液からα−１−プ
   ロテイナーゼ阻害剤を分離する方法において、 （ｉ）α−１−プロテイナーゼ阻害剤を含有する血漿タ
   ンパク質の混合物に温和な還元剤を加え、該還元剤はα
   −１−プロテイナーゼ阻害剤を還元することなくジスル
   フィド結合を還元するのに十分な濃度とし、 （ｉｉ）工程（ａ）の溶液の温度を３５℃以上に上昇さ
   せ、そして （ｉｉｉ）前記溶液からα−１−プロテイナーゼ阻害剤
   を回収する工程を含むことを特徴とする方法。 ４、（ｉ）使用する血漿又は血漿画分の重量当たり２０
   乃至１００容量の緩衝液に溶解した血漿及び血漿画分の
   １つの水性溶液を工程（ａ）で使用するために提供し、 （ｉｉ）工程（ａ）で使用する前に、前記緩衝液及び工
   程（ｉ）からの血漿及び血漿画分の得られる水性溶液の
   １つを、生じる溶液のｐＨが９．０乃至１１．０となる
   ように調節する工程を更に含む特許請求の範囲第１項記
   載の方法。 ５、特許請求の範囲第１項記載の方法により製造したプ
   ロテアーゼ阻害有効量のα−１−プロテイナーゼ阻害剤
   及び製薬学的に許容しうる担体を含有して成る薬剤組成
   物。 ６、特許請求の範囲第２項記載の方法により製造したプ
   ロテアーゼ阻害有効量のα−１−プロテイナーゼ阻害剤
   及び製薬学的に許容しうる担体を含有して成る薬剤組成
   物。 ７、特許請求の範囲第３項記載の方法により製造したプ
   ロテアーゼ阻害有効量のα−１−プロテイナーゼ阻害剤
   及び製薬学的に許容しうる担体を含有して成る薬剤組成
   物。 ８、特許請求の範囲第４項記載の方法により製造したプ
   ロテアーゼ阻害有効量のα−１−プロテイナーゼ阻害剤
   及び製薬学的に許容しうる担体を含有して成る薬剤組成
   物。