JPS63302366A - Method and apparatus for cutting and collecting chromosome - Google Patents
Method and apparatus for cutting and collecting chromosomeInfo
- Publication number
- JPS63302366A JPS63302366A JP28151586A JP28151586A JPS63302366A JP S63302366 A JPS63302366 A JP S63302366A JP 28151586 A JP28151586 A JP 28151586A JP 28151586 A JP28151586 A JP 28151586A JP S63302366 A JPS63302366 A JP S63302366A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- chromosome
- cutting
- sample
- laser beam
- laser
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 title claims abstract description 71
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 62
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 22
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims abstract description 20
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 23
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 10
- -1 azide compound Chemical class 0.000 claims description 5
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 claims description 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 claims description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 2
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 claims description 2
- 208000037088 Chromosome Breakage Diseases 0.000 claims 4
- 230000005886 chromosome breakage Effects 0.000 claims 4
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 claims 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 claims 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 abstract description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 4
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102100039869 Histone H2B type F-S Human genes 0.000 description 3
- 101001035372 Homo sapiens Histone H2B type F-S Proteins 0.000 description 3
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 230000001443 photoexcitation Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 239000010408 film Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000000879 optical micrograph Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明はレーザービームを利用して染色体の選択的切断
を行うと共に、切断した染色体を選択的に回収するよう
にした染色体切断回収方法及び装置に関する。[Detailed Description of the Invention] [Industrial Application Field] The present invention provides a method and apparatus for selectively cutting chromosomes using a laser beam and selectively recovering the cut chromosomes. Regarding.
染色体はＤＮＡとヒストンが結合したものであり、両者
の相互作用がＤＮＡの機能発現に極めて重要である。こ
れを解析するためには染色体の特定部位を認識して切断
する技術が必要不可欠であり、現在各種酵素類を用いて
染色体の切断を行う研究が進められている。A chromosome is a combination of DNA and histones, and the interaction between the two is extremely important for the functional expression of DNA. In order to analyze this, technology that recognizes and cuts specific parts of chromosomes is essential, and research is currently underway to cut chromosomes using various enzymes.
このような酵素類による染色体の切断は、染色体が高度
に凝集した構造であるために、酵素の作用が立体的に阻
害されて詳細な解析が困難であり、レーザービームのよ
うな物理エネルギーを利用した切断方法が望まれている
が、現在のところレーザービームを使って染色体を選択
切断するシステムは見当たらず、またそれに伴う必要な
部分の回収もまた他に例を見ない。ただレーザービーム
を用いて染色体を切断する’ＡＭを構成する場合、レー
ザー光源、光偏光器、集光レンズ、及び制？１１装置を
正体とすることとなるため、類似のものがレーザービー
ム走査型顕微鏡の分類として学会で報告されている程変
である。Due to the highly aggregated structure of chromosomes, the action of the enzymes is sterically inhibited and detailed analysis is difficult when cutting chromosomes using such enzymes. However, there is currently no system that uses a laser beam to selectively cut chromosomes, and the associated recovery of the necessary parts is also unprecedented. However, when constructing an AM that cuts chromosomes using a laser beam, a laser light source, a light polarizer, a condensing lens, and a control lens are required. 11 device, similar devices are reported at academic conferences as classifications of laser beam scanning microscopes.
ところで、現在のレーザービーム走査型顕微鏡Ｗｆｆを
用いた微細加工または光励起などの手法は、細胞を対象
としたもので、さらに対象試料が小さくなると充分に機
能を発揮できないという欠点がある。例えば、レーザー
ビームを集光する場合試ネ４面での光スポツト径は集光
レンズの集光能力の限界付近まで絞らなければならず、
また広範囲に点在する試料を効率よく処理しなければな
らない。By the way, the current techniques such as microfabrication or optical excitation using a laser beam scanning microscope Wff target cells, and have the disadvantage that they cannot function satisfactorily when the target sample becomes smaller. For example, when condensing a laser beam, the diameter of the light spot on the four test surfaces must be narrowed down to near the limit of the condensing ability of the condensing lens.
In addition, samples scattered over a wide area must be efficiently processed.
また試料が染色体のようなものでは、光学顕微鏡として
充分な画像が得られなければ目的が達せられない。Furthermore, if the sample is something like a chromosome, the objective cannot be achieved unless a sufficient image can be obtained using an optical microscope.
本発明は上記問題点を解決するためのもので、レーザー
ビームを用いて染色体の一部分の選択的切り出しを容易
に行うことができると共に、高効率で多数の同一試料を
回収することができる染色体切断回収方法及び装置を提
供することを目的とする。The present invention is intended to solve the above-mentioned problems, and it is possible to easily selectively excise a portion of a chromosome using a laser beam, and to recover a large number of identical samples with high efficiency. The purpose is to provide a recovery method and device.
そのために本発明は、光プローブにより染色体試料切断
位置を決定し、決定した切断位置でレーザービームによ
り選択切断した染色体試料に光アフィニティー試薬を含
んだン容ン夜を加え、該ン容７夜が加えられた染色体試
料の前記切断位置にレーザービームを照射してその周囲
の光アフィニティー試薬を染色体に結合させ、不要な試
薬洗浄後、光アフィニティー試薬のイオン解離を行って
染色体断片に電荷を与えて選択的に回収する染色体切断
回収方法、及び出力光強度可変のレーザービーム発生手
段と、レーザービームにより染色体試料の載置された試
料台上の試料面を走査する走査手段と、試料面の観察手
段と、試料面の走査により得られる画像データ、選択決
定された染色体切断位置等を記憶する記憶手段と、前記
切断位置の選択時は弱いレーザービームで走査させ、記
憶手段に記憶された選択位置における切断時は強いレー
ザービームを照射させると共に、染色体切断片回収時は
、光アフィニティー試薬を含んだ溶液が加えられた試料
の前記選択切断位置にレーザービームを照射させるよう
に前記レーザー発生手段及び走査手段を制御する制御手
段とを備えた染色体切断回収装置を特徴とする。To this end, the present invention determines the cutting position of a chromosome sample using an optical probe, adds a solution containing a photoaffinity reagent to the chromosome sample that has been selectively cut using a laser beam at the determined cutting position, and A laser beam is irradiated to the cut position of the added chromosome sample to bind the surrounding photoaffinity reagent to the chromosome, and after washing unnecessary reagents, ion dissociation of the photoaffinity reagent is performed to impart an electric charge to the chromosome fragment. A chromosome cutting and recovery method for selective recovery, a laser beam generating means with variable output light intensity, a scanning means for scanning a sample surface on a sample stage on which a chromosome sample is placed with a laser beam, and a sample surface observation means and a storage means for storing image data obtained by scanning the sample surface, the selected chromosome cutting position, etc., and when selecting the cutting position, the cutting position is scanned with a weak laser beam, and the selected position stored in the storage means is scanned. The laser generating means and the scanning means are configured to irradiate a strong laser beam during cutting, and to irradiate the laser beam to the selected cutting position of the sample to which a solution containing a photoaffinity reagent is added when recovering chromosome cut fragments. The chromosome cutting and recovery device is characterized by a control means for controlling the chromosome cutting and recovery device.
本発明は、光プローブにより染色体試料切断位置を決定
し、決定した切断位置でレーザービームにより選択切断
した染色体試料に光アフィニティー試薬を含んだ溶液を
加え、該溶液が加えられた染色体試料の前記切断位置に
レーザービームを照射してその周囲の光アフィニティー
試薬を染色体に結合させ、不要な試薬洗浄後、光アフィ
ニティー試薬のイオン解離を行って染色体断片に電荷を
与えて選択的に回収することにより、染色体の一部分の
選択的切り出しを容易に行うことができると共に、高効
率で多数の同一試料を回収することが可能となる。The present invention involves determining the cutting position of a chromosome sample using an optical probe, adding a solution containing a photoaffinity reagent to the chromosome sample that has been selectively cut with a laser beam at the determined cutting position, and cutting the chromosome sample to which the solution has been added. By irradiating the position with a laser beam to bind the surrounding photoaffinity reagent to the chromosome, and after washing unnecessary reagents, the photoaffinity reagent is ionically dissociated to impart an electric charge to chromosome fragments and selectively recover them. Selective excision of a portion of a chromosome can be easily performed, and a large number of identical samples can be collected with high efficiency.
以下、実施例を図面に基づき説明する。 Examples will be described below based on the drawings.
第１図は本発明によるレーザー光走査型ｆ！ｌ￥微鏡を
用いた染色体切断及び回収システムを示す図である。図
中、１は光学顕微鏡、２はハーフミラ−１３は集光レン
ズ、４は試料台、５はＡｒレーザー、６は音響光学変調
器、７．８はミラー、９はビームエキスパンダ、１０は
音響光学変調器用ドライバ、１１１２はＸ、Ｙスキャ−
１−１１３はン＋ −／夕、１４は走査ユニット、１５
．１６はガルバノメーターミラー、１７はオートフォー
カス装置、１８は自動Ｘ−Ｙステージ、１９はインター
フェース、２０は制御用計算機、２１はフレームメモリ
、２２はＣＣＤカメラ、２３はテレビモニタである。FIG. 1 shows a laser beam scanning type f! according to the present invention. 1 is a diagram showing a chromosome cutting and recovery system using a microscope. In the figure, 1 is an optical microscope, 2 is a half mirror, 13 is a condensing lens, 4 is a sample stage, 5 is an Ar laser, 6 is an acousto-optic modulator, 7.8 is a mirror, 9 is a beam expander, and 10 is an acoustic Optical modulator driver, 1112 is X, Y scan
1-113 han+-/event, 14 is scanning unit, 15
．． 16 is a galvanometer mirror, 17 is an autofocus device, 18 is an automatic X-Y stage, 19 is an interface, 20 is a control computer, 21 is a frame memory, 22 is a CCD camera, and 23 is a television monitor.
図において、Ａｒレーザー５から出た光ビームは音響光
学変調器（以下ＡＯＭと言う）６を透過する。このＡＯ
Ｍ６は、ＡＯＭ用ドライバ１０により駆動されてレーザ
ービームの出力を変化させ、レーザービームを試料切断
位置の決定用光プローブとするか、或いは切断用光ビー
ムとするかの使い分けに使用する。即ち、光プローブ用
としては、ＡＯＭ出力強度を抑え、切断用としては出力
強度を大きくするようにＡ「レーザー５からのレーザー
ビームを変調している。ＡＯＭ６を透過した光ビームは
、ミラー７．８で反射され、ビームエキスパンダー９に
よってビーム径を拡大し、これによりビーム広がり角を
小さくすると共に、エネルギー分布をなだらかにする。In the figure, a light beam emitted from an Ar laser 5 passes through an acousto-optic modulator (hereinafter referred to as AOM) 6. This AO
M6 is driven by the AOM driver 10 to change the output of the laser beam, and is used to determine whether the laser beam is used as an optical probe for determining the sample cutting position or as a cutting light beam. That is, the laser beam from the AOM laser 5 is modulated so that the AOM output intensity is suppressed for optical probe use and the output intensity is increased for cutting use.The light beam transmitted through AOM 6 is modulated by mirror 7. 8, the beam diameter is expanded by a beam expander 9, thereby reducing the beam spread angle and making the energy distribution gentle.
ビームエキスパンダー９の出力光ビームはガルバノメー
ターミラー１５．１６からなる走査ユニット１４で２次
元的に走査され、この偏向走査された光ビームは無限遠
鏡筒系の顕微鏡内の中間に位置したハーフミラ−２によ
り集光レンズ３に導かれ、集光レンズ３の集光能力に近
いビーム径までに絞られて試料台４上の試料面に集光さ
れる。The output light beam of the beam expander 9 is two-dimensionally scanned by a scanning unit 14 consisting of galvanometer mirrors 15 and 16, and this deflected and scanned light beam is sent to a half mirror located in the middle of the microscope with an infinity lens barrel system. 2, the light is guided to a condenser lens 3, focused to a beam diameter close to the condensing ability of the condenser lens 3, and condensed onto a sample surface on a sample stage 4.
なお、レーザー光源は、Ａｒレーザーを使用したが目的
に応じて変更すればよく、Ａｒレーザー５に代えてＹＡ
Ｇレーザーなどのパルスレーザ−を使用することも可能
であり、この場合は光プローブとしてＨｅ −Ｎ ｅレ
ーザーをＹＡＧレーザーの光軸に合わせて使用し、選択
位置探索はＨｅ−Ｎｅレーザービームで行い、切断はＹ
ＡＧレーザ−ビームにより行うようにすることが望まし
い。Although an Ar laser was used as the laser light source, it may be changed depending on the purpose.
It is also possible to use a pulsed laser such as a G laser. In this case, a He-Ne laser is used as an optical probe, aligned with the optical axis of the YAG laser, and the selected position search is performed with the He-Ne laser beam. , cutting is Y
It is preferable to use an AG laser beam.
さらに、ＹＡＧレーザーはビームパターンの形状が理想
的ではないため、空間フィルターをビームエキスパンダ
ー９の前に置きビーム整形するようにするのが良い。Furthermore, since the shape of the beam pattern of the YAG laser is not ideal, it is preferable to place a spatial filter in front of the beam expander 9 to shape the beam.
以上説明した部分が、試料面上に非常によく集光された
光ビームを２次元的に走査させるための基本部分であり
、実際に効率よく試料を切断するにあたり、制御用計算
機２０により、全体を制御■して各部のタイミングを合
わせるようにしている。The parts explained above are the basic parts for two-dimensionally scanning a highly focused light beam on the sample surface, and in order to actually cut the sample efficiently, the control computer 20 The timing of each part is adjusted by controlling ■.
次に、顕微鏡視野１内における光スポットの制御方法に
ついて説明すると、例えば制御用計算機２０におけるマ
ウスのディジタイジング８ｇ能を用い、２次元の位置情
報をＸ軸、Ｙ軸走査用のミラー１５．１６のドライバー
のＸスキャナ、Ｙスキャナにそれぞれ与えることにより
ランダムスキャンを行うことができる。即ち、Ａ ＯＭ
を制御して得られる出力を抑えたＡｒレーザー光もしく
はＨｅ−Ｎｅレーザー光をプローブとして試料探索し、
ハーフミラ−２を通してＣＣＤカメラ２２によりＴＶモ
ニタτ２３上に映しだされる試料の任意の場所にレーザ
ービームを持っていくことができ５、こうして切断した
い場所を光プローブで位置決めし、そのときのアドレス
情報を計算機２０内のメモリに入れておく。そして、高
出力レーザーで切断する際、メモリ内のアドレス情報を
読み出し、それにより自動的に切断位置を照射すること
ができ、その結果、高出力レーザーによる無用な散乱光
がハーフミラ−２を介してＴＶモニター２３に映し出さ
れるのを防止することができる。ンヤソタ１３はこうし
た切断場所以外での高出力レーザーによる散乱光が入る
のを防止し、ＣＣＤカメラの保護をしている。Next, a method of controlling the light spot within the microscope field of view 1 will be explained. For example, using the 8g digitizing function of the mouse in the control computer 20, two-dimensional position information is transferred to the mirrors 15 and 16 for X-axis and Y-axis scanning. A random scan can be performed by applying the signals to the X scanner and Y scanner of the driver. That is, AOM
The sample is searched using Ar laser light or He-Ne laser light with suppressed output obtained by controlling the
Through the half mirror 2, the laser beam can be brought to any location on the sample that is displayed on the TV monitor τ23 by the CCD camera 22.5, the location to be cut is positioned with the optical probe, and the address information at that time is is stored in the memory of the computer 20. When cutting with a high-power laser, the address information in the memory is read and the cutting position can be automatically irradiated using it. As a result, unnecessary scattered light from the high-power laser is transmitted through the half mirror It is possible to prevent the image from being displayed on the TV monitor 23. Nyasota 13 protects the CCD camera by preventing scattered light from entering the high-power laser outside of the cutting location.
自動Ｘ−Ｙステージ１８は、試料探索の際、随時顕微鏡
視野外の試料を視野内に持っていくときに使用され、ま
たオートフォーカス装置１７は、集光されるレーザービ
ームの焦点距離と光学顕微鏡の焦点距離との差に違いが
生ずる時、切断時と試料探索時のピント面を自動補正す
る。The automatic X-Y stage 18 is used to bring a sample outside the field of view of the microscope into the field of view at any time during sample search, and the autofocus device 17 is used to adjust the focal length of the focused laser beam and the optical microscope. When there is a difference between the focal length of
また染色体のようなバンド構造を見る時、光学顕微鏡の
画像では充分でない場合、レーザスキャニング顕微鏡と
して使用すれば、画像補正として利用できる。In addition, when looking at band structures such as chromosomes, if an optical microscope image is not sufficient, it can be used as a laser scanning microscope to correct the image.
また、試料を透過したレーザー光量を図示しない光検出
器で検出することにより、その位置における強度の変調
度が分り、従ってレーザービームをラスタースキャンし
、その透過光量を図示しない光検出器で検出し、フレー
ムメモリ２１に書き込んでいくことにより染色体試料の
画像データが得られ、染色体を正確に効率よく切断する
ことが可能となる。In addition, by detecting the amount of laser light that has passed through the sample with a photodetector (not shown), the degree of modulation of the intensity at that position can be determined.Therefore, the laser beam can be raster scanned and the amount of transmitted light can be detected with a photodetector (not shown). By writing into the frame memory 21, image data of the chromosome sample can be obtained, and the chromosome can be cut accurately and efficiently.
次に切断した染色体の選択的回収について説明する。Next, selective recovery of cut chromosomes will be explained.
原理としては光アフィニティー試薬を光励起することに
より特定の染色体の場所のヒストン蛋白質に共有結合さ
せた化合物をつくり、その化合物をイオン化して他のＮ
Ｗｒをもたない染色体と区別しようとするものである。The principle is that a photoaffinity reagent is photoexcited to create a compound that is covalently bound to histone proteins at a specific chromosomal location, and that compound is ionized to bind other N.
This is to distinguish it from chromosomes that do not have Wr.
例として光アフィニティー試薬にアジド化合物を用いた
場合の光励起反応を第２図に示す。As an example, FIG. 2 shows a photoexcitation reaction when an azide compound is used as a photoaffinity reagent.
アジド化合物（ＲＮ、）は光を照射することにより、図
示するようにカル−、ン（ＲＮ：）と窒素（Ｎ２）に分
かれる。このカルヘンは染色体の主構成要素であるヒス
トン蛋白質と共有結合を起こす。またアジド化合物にカ
ルボキシル％ （Ｃｏ。When the azide compound (RN:) is irradiated with light, it is separated into carbon (RN:) and nitrogen (N2) as shown in the figure. This calhene forms a covalent bond with histone proteins, which are the main components of chromosomes. In addition, carboxyl% (Co) is added to the azide compound.
Ｈ）などを含ませておくと、水ン容液のｐＨを変えるこ
とでイオン解離すなわち−ＣＯＯ−とＨ゛とすることが
でき特定部分のみ電荷を与えることができる。If H) is included, by changing the pH of the water solution, ion dissociation, that is, -COO- and H' can be achieved, and only a specific portion can be charged.
そこで、前述のようにして染色体を切断した後、回収し
たい部分の位置を計算機１内のメモリにアドレスしてお
く。全試料切断後、試料台４上の試料に光アフィニティ
ー試薬の溶液を投与する。その後アドレスした番地に基
づき、計算機２０によりオートステージ１８を制御して
顕微鏡視野内に導キ、アドレスコントロールのプログラ
ムニ従って回収したい部分にレーザビームを照射し反応
を起こさせる。そして、必要な試料全て終えたならば、
試料をすべてスライドガラスより剥がす作業をする。こ
れはあらかじめスライドガラス上に有機薄膜を張ってお
き、その上に試料をのせて置くため、薄膜を溶かすこと
により容易に試料を剥がすことが可能となる。有機薄膜
材質として、アセトンに７容解するメタクリレート膜、
または４０ ’Ｃの温水に溶解するアガロースなどが適
している。Therefore, after cutting the chromosome as described above, the location of the portion to be recovered is addressed in the memory within the computer 1. After cutting all the samples, a solution of a photoaffinity reagent is administered to the sample on the sample stage 4. Thereafter, based on the addressed address, the autostage 18 is controlled by the computer 20 to guide it into the field of view of the microscope, and a laser beam is irradiated on the part to be recovered according to the address control program to cause a reaction. Once all the necessary samples have been completed,
Peel all the samples from the glass slides. In this method, an organic thin film is spread on a slide glass in advance and the sample is placed on top of it, so that the sample can be easily peeled off by melting the thin film. As an organic thin film material, a methacrylate film that is soluble in acetone,
Alternatively, agarose that dissolves in 40'C warm water is suitable.
剥離した染色体を含む溶液のｐｉ（を操作し、回収した
い染色体の微少断片に電荷をもたせるようにし、その後
電気泳動法によって電荷を持つものと持たないものとに
分けることにより高効率の回収を行うことができる。Highly efficient recovery is achieved by manipulating the PI of the solution containing detached chromosomes so that the minute fragments of chromosomes to be recovered are charged, and then separated into those with and without charges by electrophoresis. be able to.
第３図は染色体の切断と回収の様子を示す図で、図中、
３０は染色体、３１は切断部分、３２は切断片であり、
前述したように各染色体の切断部分３１を探索して切り
出し、これら同一切断片３２の試料を回収して集め、必
要な処理を行っている。Figure 3 is a diagram showing how chromosomes are cut and recovered.
30 is a chromosome, 31 is a cut part, 32 is a cut piece,
As described above, the cut portions 31 of each chromosome are searched for and cut out, and samples of these same fragments 32 are collected and subjected to necessary processing.
第４図は水浸系対物レンズを用いた他の実施例を示す図
、第５図は第４図の実施例に使用するレーザー構成を示
す図で、図中、４１は対物レンズ、４２は水、４３は試
料、４４はスライドグラス、５１はインターフェース、
５２はＹＡＧレーザ、５３はＣＷ（連続波）Ａｒ” レ
ーザ、５４はＡＯＭ、５５はミラー、５６はハーフミラ
−である。FIG. 4 is a diagram showing another embodiment using a water immersion objective lens, and FIG. 5 is a diagram showing a laser configuration used in the embodiment of FIG. water, 43 a sample, 44 a slide glass, 51 an interface,
52 is a YAG laser, 53 is a CW (continuous wave) Ar'' laser, 54 is an AOM, 55 is a mirror, and 56 is a half mirror.
試料４３を覆う水滴状の水４２には光アフィニティー試
薬が含まれ、これに対物レンズ４１が浸っており、切断
にはＣＷのＡｒ” レーザ５３を使用し、その後直らに
光励起用のＹＡＧパルスレーザ５２により切り出した切
片に照射し、これを必要な数だけ繰り返し行う。なおＹ
ＡＧパルスレーザ５２は、インターフェース５１を介し
て制御用計算機からのＴＴＬ信号により外部同３ＩＪｌ
駆動される。The droplet-shaped water 42 covering the sample 43 contains an optical affinity reagent, and the objective lens 41 is immersed in it.A CW Ar'' laser 53 is used for cutting, and then a YAG pulsed laser for optical excitation is used immediately. 52, and repeat this process as many times as necessary.
The AG pulse laser 52 is connected to an external device by a TTL signal from a control computer via an interface 51.
Driven.
以上のように本発明によれば、レーザービームを用いて
染色体の切断したい部分の選択と切り出しを容易に行う
ことができ、さらに光アフィニティー試薬を加えて光励
起し、染色体の選択切断部分のヒストン蛋白質に共有結
合させた化合物をつくり、その化合物をイオン化して他
の電荷をもたない染色体と区別することにより高効率で
多数の同一試料が得ることが可能となる。As described above, according to the present invention, it is possible to easily select and cut out a portion of a chromosome to be cut using a laser beam, and further, by adding a photoaffinity reagent and photoexciting, the histone protein of the selected cut portion of the chromosome can be easily selected and cut out. By creating a compound that is covalently bound to chromosomes and ionizing the compound to distinguish it from other uncharged chromosomes, it becomes possible to obtain a large number of identical samples with high efficiency.
第１図は本発明による染色体切断装置のブロック構成図
、第２回は光アフィニティー試薬にアジド化合物を用い
た場合の光励起反応を示す図、第３図は染色体の切断と
回収を説明するための説明図、第４図は水浸系対物レン
ズを用いた他の実施例を示す図、第５図は第４図の実施
例に使用するレーザー構成を示す図である。
１・・・光学顕微鏡、２・・・ハーフミラ−１３・・・
集光レンズ、４・・・試料台、５・・・Ａｒレーザー、
６・・・音響光学変調器、７．８・・・ミラー、９・・
・ビームエキスパンダ、ｌＯ・・・音響光学変調器用ド
ライバ、ｌ１１１２・・・Ｘ、Ｙスキャナ、１３・・・
シャッタ、１４・・・走査ユニット、１５．１６・・・
ガルバノメーターミラー、１７・・・オートフォーカス
装置、１８・・・自動Ｘ−Ｙステージ、１９・・・イン
ターフェース、２０・・・制御用計算機、２１・・・フ
レームメモリ、２２・・・テレビモニタ、３０・・・染
色体、３１・・・切断部分、３２・・・切断片、４１・
・・対物レンズ、４２・・・水、４３・・・試料、４４
・・・スライドグラス、５１・・・インターフェース、
５２・・・ＹＡＧレーザ、５３・・・ＣＷのＡｒ” レ
ーザ、５４・ＡＯＭ、５５・・・ミラー、５６・・・ハ
ーフミラ−である。Figure 1 is a block diagram of the chromosome cutting device according to the present invention, Part 2 is a diagram showing a photoexcitation reaction when an azide compound is used as a photoaffinity reagent, and Figure 3 is a diagram for explaining chromosome cutting and recovery. The explanatory diagram, FIG. 4, is a diagram showing another embodiment using a water immersion objective lens, and FIG. 5 is a diagram showing a laser configuration used in the embodiment of FIG. 4. 1... Optical microscope, 2... Half mirror 13...
Condensing lens, 4... Sample stage, 5... Ar laser,
6... Acousto-optic modulator, 7.8... Mirror, 9...
・Beam expander, lO...driver for acousto-optic modulator, l1112...X, Y scanner, 13...
Shutter, 14...Scanning unit, 15.16...
Galvanometer mirror, 17... Autofocus device, 18... Automatic X-Y stage, 19... Interface, 20... Control computer, 21... Frame memory, 22... Television monitor, 30... Chromosome, 31... Cut portion, 32... Cut piece, 41.
...Objective lens, 42...Water, 43...Sample, 44
... slide glass, 51 ... interface,
52...YAG laser, 53...CW Ar'' laser, 54...AOM, 55...mirror, 56...half mirror.
Claims (12)
決定した切断位置でレーザービームにより選択切断した
染色体試料に光アフィニティー試薬を含んだ溶液を加え
、該溶液が加えられた染色体試料の前記切断位置にレー
ザービームを照射してその周囲の光アフィニティー試薬
を染色体に結合させ、不要な試薬洗浄後、光アフィニテ
ィー試薬のイオン解離を行って染色体断片に電荷を与え
て選択的に回収する染色体切断回収方法。(1) Determine the chromosome sample cutting position using an optical probe,
Add a solution containing a photoaffinity reagent to a chromosome sample that has been selectively cut with a laser beam at the determined cutting position, and irradiate the cut position of the chromosome sample to which the solution has been added with a laser beam to remove the photoaffinity reagent around it. A chromosome fragment recovery method that binds to chromosomes, washes unnecessary reagents, and then performs ion dissociation of a photoaffinity reagent to impart charge to chromosome fragments and selectively recover them.
色体断片の選択は、同一レーザービームを強度変調して
得られたビームにより行う特許請求の範囲第１項記載の
染色体切断回収方法。(2) The chromosome breakage and recovery method according to claim 1, wherein the determination of the chromosome breakage position, selective breakage, and selection of recovered chromosome fragments are performed using a beam obtained by intensity modulating the same laser beam.
と、該レーザの光軸に合わせた光プローブ用レーザによ
るビームにより行う特許請求の範囲第１項記載の染色体
切断回収方法。(3) The chromosome cutting and recovery method according to claim 1, wherein the determination of the cutting position and the selective cutting are performed using a pulsed laser and a beam from an optical probe laser aligned with the optical axis of the laser.
含ませたアジド化合物である特許請求の範囲第１項記載
の染色体切断回収方法。(4) The chromosome breakage recovery method according to claim 1, wherein the photoaffinity reagent is an azide compound containing a carboxyl group.
特許請求の範囲第１項記載の染色体切断回収方法。(5) The chromosome breakage recovery method according to claim 1, wherein the ionic dissociation is performed by changing the pH.
、電気泳動法により行う特許請求の範囲第１項記載の染
色体切断回収方法。(6) The chromosome fragmentation and recovery method according to claim 1, wherein the selective recovery of the charged chromosome fragments is performed by electrophoresis.
ーザービームにより染色体試料の載置された試料台上の
試料面を走査する走査手段と、試料面の観察手段と、試
料面の走査により得られる画像データ、選択決定された
染色体切断位置等を記憶する記憶手段と、前記切断位置
の選択時は弱いレーザービームで走査させ、記憶手段に
記憶された選択位置における切断時は強いレーザービー
ムを照射させると共に、染色体切断片回収時は、光アフ
ィニティー試薬を含んだ溶液が加えられた試料の前記選
択切断位置にレーザービームを照射させるように前記レ
ーザー発生手段及び走査手段を制御する制御手段とを備
えた染色体切断回収装置。(7) A laser beam generating means with variable output light intensity, a scanning means for scanning the sample surface on the sample stage on which the chromosome sample is placed with the laser beam, a sample surface observation means, and a sample surface observation means for scanning the sample surface. a storage means for storing the image data to be selected, selected chromosome cutting positions, etc., scanning with a weak laser beam when the cutting position is selected, and irradiating a strong laser beam when cutting at the selected position stored in the storage means; and a control means for controlling the laser generating means and the scanning means so as to irradiate the selected cutting position of the sample to which a solution containing a photoaffinity reagent has been added with a laser beam when recovering chromosome cut fragments. Chromosome cutting and recovery device.
調器により変えられる特許請求の範囲第７項記載の染色
体切断回収装置。(8) The chromosome cutting and recovery device according to claim 7, wherein the output light intensity of the laser beam is changed by an acousto-optic modulator.
動Ｘ−Ｙステージにより位置制御される特許請求の範囲
第５項記載の染色体切断回収装置。(9) The chromosome cutting and recovery apparatus according to claim 5, wherein the position of the sample stage is controlled by an automatic X-Y stage controlled by the control means.
るオートフォーカス装置により焦点合せされる特許請求
の範囲第５項記載の染色体切断回収装置。(10) The chromosome cutting and recovery device according to claim 5, wherein the observation means is focused by an autofocus device controlled by the control means.
るシャッタにより弱いレーザービームによる走査時のみ
観察可能にされる特許請求の範囲第５項記載の染色体切
断回収装置。(11) The chromosome cutting and recovery apparatus according to claim 5, wherein the observation means is enabled to observe only when scanning with a weak laser beam is performed by a shutter controlled by the control means.
るフレームメモリを含む特許請求の範囲第７項記載の染
色体切断回収装置。(12) The chromosome cutting and recovery apparatus according to claim 7, wherein the storage means includes a frame memory for storing image data of the sample surface.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28151586A JPS63302366A (en) | 1986-11-26 | 1986-11-26 | Method and apparatus for cutting and collecting chromosome |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28151586A JPS63302366A (en) | 1986-11-26 | 1986-11-26 | Method and apparatus for cutting and collecting chromosome |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63302366A true JPS63302366A (en) | 1988-12-09 |
| JPH0513578B2 JPH0513578B2 (en) | 1993-02-22 |
Family
ID=17640257
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28151586A Granted JPS63302366A (en) | 1986-11-26 | 1986-11-26 | Method and apparatus for cutting and collecting chromosome |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS63302366A (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20030042231A (en) * | 2001-11-22 | 2003-05-28 | 정의창 | Operation method of laser microdissection system |
| JP2016525700A (en) * | 2013-07-01 | 2016-08-25 | ライカ ミクロジュステムス ツェーエムエス ゲーエムベーハー | Laser microscopic cutting system and inspection method for nucleic acid-containing sample |
-
1986
- 1986-11-26 JP JP28151586A patent/JPS63302366A/en active Granted
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20030042231A (en) * | 2001-11-22 | 2003-05-28 | 정의창 | Operation method of laser microdissection system |
| JP2016525700A (en) * | 2013-07-01 | 2016-08-25 | ライカ ミクロジュステムス ツェーエムエス ゲーエムベーハー | Laser microscopic cutting system and inspection method for nucleic acid-containing sample |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0513578B2 (en) | 1993-02-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3129471B2 (en) | Multi-beam particle operation method | |
| US5735276A (en) | Method and apparatus for scanning and evaluating matter | |
| US7968819B2 (en) | Microdissection apparatus and method | |
| JP5292640B2 (en) | Method for region of interest (ROI) scanning with high temporal resolution | |
| JPH0734012B2 (en) | Flow image cytometer | |
| JP4414722B2 (en) | Laser microscope | |
| JP2002156316A (en) | Laser microdisection method and device | |
| JP2008281720A (en) | Microscope device | |
| JP2003195174A (en) | Scanning laser microscope system | |
| JPS63302366A (en) | Method and apparatus for cutting and collecting chromosome | |
| JP3849176B2 (en) | Optical scanning microscope | |
| DE10347326B4 (en) | Arrangement with a microscope and a module | |
| JP4480976B2 (en) | Scanning optical microscope apparatus, control method therefor, and program | |
| JP2003057180A (en) | Fluorescent image measuring apparatus | |
| JPH08254654A (en) | Confocal point polarization microscope | |
| JPH11223773A (en) | Vertical fluorescent microscope | |
| JPWO2020055813A5 (en) | ||
| JPH01191046A (en) | Foreign matter inspecting device | |
| JP3405252B2 (en) | Biological sample observation device | |
| JPH0533985B2 (en) | ||
| JP3630027B2 (en) | Fine object capturing apparatus and method | |
| JPH095630A (en) | Optical scanning method | |
| JP3644318B2 (en) | Apparatus and method for operating fine object | |
| JP2005345764A (en) | Scanning optical device | |
| JP3068110B2 (en) | Particle image analyzer |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |