JPS63245699A - 新規ｃＤＮＡプロ−ブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 ヒトの主要組織適合性複合体である白血球膜抗原（ＨＬ
Ａ）は、臓器等の移植に重要なかかわりをもつ。本発明
は、このＨＬＡの型判別法に関するものである。

〈従来の技術〉　。

ＨＬＡの型判別法は、従来血清学的または細胞学的方法
により行われている。即ち、ＨＬＡのクラス■抗原であ
るＡ、Ｂ、Ｃ及びクラス■抗原のうちＤＲ，ＤＱの各抗
原は血清学的方法、換言すれば特異抗体と補体を用いた
リンパ球障害テストにより型別の判定が行われている。

またクラス■抗原のうちＤ抗原は、Ｍ　Ｌ　Ｃ（Ｍｉｘ
ｅｄ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔａＣｕｌｔｕｒｅ）法で、Ｄ
Ｐ膜抗原Ｐ　Ｌ　Ｔ　（ＰｒｉｍｅｄＬｙｍｐｈｏｃｙ
ｔｅ　Ｔｙｐｉｎｇ）法でそれぞれ判定されている。

〈発明が解決しようとしている問題点〉従来の方法のう
ちで、特に細胞学的な方法であるＭＬＣ法およびＰＬＴ
法は、判定に要する時間および手間が大きくまた判定の
精度も必ずしも満足すべきものではなかった。

最近、ＨＬＡに関する研究が進展し、ＨＬＡの遺伝子の
同定、更には遺伝子のクローニングが行われるようにな
った。ＨＬＡは高度の遺伝的多型性を持つ抗原であるの
で、クローニングされた遺伝子を−プローブとして用い
、遺伝子ＤＮＡの制限酵素切断パターンの違いからＨＬ
Ａ型の判定をする試みがなされた（例えば、ＨＬＡクラ
スＩＩＤＲ抗原に対して試みた特許出願公開　昭５８−
１３００００）。ＨＬＡクラス■抗原にはＤＲのみなら
ず、ＤｓＤＱ、ＤＰ、Ｄｏ、等の抗原が含まれるが、こ
れらの型のＤＮＡ上の多型性を利用した判別法は未だ確
立されるに到っていない。

く問題点を解決するための手段〉 本発明は、ＨＬＡクラスＩＩＤＰ抗原の型判別をＤＮＡ
の多型性に基づく制限酵素切断パターンの違いにより判
定することを特徴とする。そのために、多型性を検出す
るためのプローブＤＮＡの取得と、試料ＤＮＡの切断に
際して適切な制限酵素を選択することが必要である。

ＤＰ膜抗原遺伝子対するｃＤ　Ｎ　Ａのクローニングと
塩基配列の決定を以下のように行った。ＤＰ膜抗原関し
てＣｐ　６３型をホモ接合体としてもつことが判明して
いるヒト由来の細胞株ＡＫｆＢ＾（Ｈ，ｉｇｏｒＯら、
Ｐｒｅｓｅｎｔ　ａｎｄ　　ｆｕｔｕｒｅ　ｄｅｖｅｌ
ｏｐｍｅｎｔ　ｏｆｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、
東海大学出版、１９８５）から以下に記す方法でｃＤＮ
Ａライブラリーを作製し、ＤＰ膜抗原β鎖に対するｃＤ
　Ｎ　Ａを含むクローンを単離した。即ち、ＲＢウィル
スで形質転換し、株化したへＲＩＢ＾細胞を１０％ウシ
胎児血清を加えたＲＰＭ　Ｉ　１６４０培地で培養し、
細胞を凍結保存した。約１０ｓ個の凍結細胞を液体窒素
下で破砕し、緩衝液（Ｑ、１Ｍ　）リス−塩酸、ｐＨ９
，０，１％ＳＤＳ、２５ａＭＥＤＴＡ、　ｌ　ｍＭ　Ｄ
ＴＴ、　０．１Ｍ　ＮａＣ１，２００５Ｍバナジル・リ
ボヌクレオシド複合体を含む）と混合する。この混合液
と等量の０．１Ｍ　　トリス緩衝液で飽和したフェノー
ル液を加え、よく撹拌してたんばく質を変性除去する。

この操作を数回繰返した後、全ＲＮＡ画分を取得する。

オリゴ（ｄＴ）カラムを用いて、全ＲＮＡよりＰ　ｏｌ
ｙ（Ａ　）’″ＲＮＡを分取し、更に、シロ糖密度勾配
遠心により目的とするｍＲＮ　Ａを多く含む両分を分取
する。このＲＮＡ画分に、ブライマーとしてオリゴ（ｄ
Ｔ）を加え、逆転写酵素によりｃＤ　Ｎ　Ａを合成せし
める。

更に、ＤＮＡポリメラーゼのＫ　ｌｅｎｏｗ−ｆｒａｇ
ｍｅｎｔを用い、二本鎖ＤＮＡとする。得られた二本鎖
ｃＤＮＡを８１ヌクレアーゼ処理してからｄＣ−ｔａｉ
ｌｉｎｇを行なう。一方、プラスミドｐ　Ａ　Ｔ　１５
３を制限酵素Ｐｓｔｌで切断後ｄＧ−ｔａｉｌｉｎｇし
たものを用意し、前記のｄＣ−ｔａｉｌｉｎｇしたｃＤ
　Ｎ　Ａとアニーリングする。得られたｃＤ　Ｎ　Ａ挿
入プラスミドを大腸菌　Ｘ１７７６に形質転換する。こ
のようにしてＤＰ膜抗原β鎖遺伝子ｃＤＮＡを含むプラ
スミドｐＤＡβ５を得た。このプラスミドＤＮＡについ
て、Ｍａｘａｍ−Ｇ　１ｌｂｅｒｔ法又はＳ　ａｎｇｅ
ｒ法に準じた方法に従うことにより塩基配列を決定した
。

ＴＧＣＡＧＣＡＣＣＴ　　ＡＴＴＴＣＣＡＡＴＴ　　Ｇ
ＴＧＴＡＴＧＧＣＣＴＣＧＡＧＴ入ＣＣＡＧＧＴＣＴＣ
ＧＣＣＴ　ＣＣＡＧＧＡＴＧＧＴ　ＣＣＴＧＣＡＧＧＴ
Ｔ　ＴＣＴＧＣＧＧＣＣＣＣＣＣＧＧＡＣＡＧＴ　（ｉ
（ｉＣＴＣＴＧＡＣＧ　ＧＣＧＴＴＡＣＴＧＡ　ＴＧＧ
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ＴＧＣＡＣＣＡＧＴ　ＴＡＣＧＧＣＡＧＧＡ　ＡＴＧＣ
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Ｔ　ＣＣＴＡＧＡＧＡＧＴ　ＴＡＣＡＴＣＴＡＣ＾＾Ｃ
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ＡＧＡＴＴＴＣＴ　ＡＣＣＣＡＡＧＣＡＧ　ＣＡＴＴＣ
ＡＡＧＴＣＣＧＡＴＧＧＴＴＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＡ
　ＧＧＡＧＧＡＡＡＣＡ　ＧＣＴＧＧＧＧＴＣＯＴＧＴ
ＣＣＡＣＣＡＡ　ＣＣＴＧＡＴＣＣＧＴ　ＡＡＴＧＧＡ
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ＧＴＧＧＡ　　ＧＣＡＣＡＣＣＡＧＣＣＴＧＧＡＣＡＧ
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ＣＡＣＡＧＴＣＴＧ　ＡＴＴＣＴＧＣＣＣＡＧＡＧＴＡ
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ＣＡＧＧＧＴＴＣＣＴＧＡＣＣＴＣＡＣＣＧ　　ＡＡＡ
ＡＧＡＣＴＡＡ　　ＴＧＴＧＣＣＴＴＡＧ　　ＡＡＣＡ
ＡＧＣＡＴＴＴＧＣＴＧＴＧＴＴＴ　　ＴＧＴＴＡＡＧ
ＴＡＧ　　ＴＧＧＴＴＣＣＡＧＧ　　ＡＣＡＧＡＣＣＣ
ＴＣＡＧＣＴＴＣＣＣＡＡ　　ＧＡＧＧＡＡＡＣＴＧ　
　ＣＴＧＣＣＡＡＧＡＡ　　ＧＴＴＧＣＴＣＴＧＡＡＧ
ＧＣＡＧ丁ＴＴＣＴＡＴＣＧＴＴＣＴＧ　　ＣＧＣＴＴ
ＴＧＡＴＴ　　ＣＡＡＡＧＣＡＣＴＧＴＴＴＣＴＣＴＣ
ＡＣＴＧＧＧＣＣＴＣＣＡ　　ＡＣＣＡＴＧＴＴＣＣＣ
ＴＴＣＴＴＣＴＴＡＧＣＡＣＣＡＣＡＡＡ　　ＴＡＡＴ
Ｃ＾＾＾ＡＣＣＣＡＡＣＡＴＡＡＧ　　ＴＧＴＴＴＧＴ
ＴＴＴＣＣＴＴＴＡＡＡＡＡ　　ＴＡＴＧＣＡＴ（ＪＡ
　　ＡＡＡＡ一方、ＨＬＡの型判別をＤＮＡの多量性を
利用して行なう場合、試料は通常判定すべき個人から採
取した血液を用いる。約２Ｘ１０’個の血球を集め、Ｐ
ＢＳに分散させたものに、３倍量の緩衝液（５０ＩＩＭ
　トリス−塩酸、ｐ　Ｈ８，０，２０ａＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ
　Ａ、　１００ｍＭ　Ｎ　ａＣｌ、　１％　５ＤＳ）を
加えて細胞を溶解させる。プロテアーゼ処理、フェノー
ル抽出により除たんばく後、リボヌクレアーゼ処理して
ＲＮＡを除く、これに２倍量の冷エタノールを添加して
不溶化した高分子ＤＮＡを得る。このＤＮＡを制限酵素
で切断して分析に供するが、この時適切な種類の制限酵
素を選定することが型判別を明瞭に行う上で必要である
。

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、こ
れは本発明の範囲を何ら制限するものではない。

〈実施例１〉 第１図の上側に記号をもって示された１４種類のヒト由
来細胞株のＨＬＡ型を調べた。これらの細胞のＨＬＡ型
は従来用いられているＰＬＴ法によれば６種類の型をホ
モまたへテロ接合体として有しているとされている。

試料細胞から高分子ＤＮＡを抽出し、制限酵素Ｔ　ａｑ
　ｌを用いて切断した後、アガロース・ゲル電気泳動に
より断片風による分別を行う。ゲルからナイロンメンブ
レンにＤＮＡ断片を移行させた後、ＨＬＡクラスｎ　　
ＤＰ抗原β鎖に対するｃＤＮＡをプローブとしてハイブ
リダイゼイシロンを行うと、第１図に示すようにそれぞ
れ６，９．５．０．３．０．２．０゜０．７　ｉ＋ｂｐ
の鎖長を有する５種類の断片の組合せによるパターンが
得られた。このパターンを整理すると５．Ｏｋｂｐ断片
の有無により、試料細胞群のＨＬＡ　　ＤＰ膜抗の型を
２群に大別できた。

〈実施例２〉 実施例１で用いたものと同じ試料ＤＮＡを制限酵素Ｐｓ
ｔｌで切断し、同じｃＤＮＡプローブとハイブリダイゼ
イシジンを行なうと、第２図に示すようにそれぞれ２８
．３．１．２．６．２．１．１．９、■、０ｋｂｐの鎖
長をもつ６種類の断片の組合せによるパターンが得られ
た。このパターンを整理すると３．１．２．６’、２．
１　ｋｂｐ断片の有無により試料細胞群のＨＬＡ　　Ｄ
Ｐ膜抗の型を３群に大別できた。

〈実施例３〉 実施例１で用いたものと同じ試料ＤＮＡを制限酵素Ｍｓ
ｐＩで切断し、同じｃＤ　Ｎ　Ａプローブとハイブリダ
イゼイションを行うと、第３図に示すようにそれぞれ４
．９．３．４．２．３．２．１．１．２．０．８．０．
５　ｋｂｐ鎖長をもつ７種類の断片の組合せによるパタ
ーンが得られた。このパターンを整理すると、４．９　
ｋｂｐの断片を除く他の６断片の有無によりて試料細胞
群のＨＬＡ　　ＤＰ膜抗の型を５群に大別できた。

〈発明の効果〉 ＨＬＡ　　ＤＰ膜抗の型判別は従来ＰＬＴ法と呼ばれる
方法で行われている。この方法は、あらかじめＤＰ抗原
型の判明している細胞を用意しておく必要があり、また
判定にはかなりの熟練を要するなど、判別法としては完
成度が低いと考えられている。

本発明で提供するＤＮＡの遺伝的多量に基づく制限酵素
切断片のパターンの多様性をＨＬＡ　　ＤＰ抗原遺伝子
に対する。ｃＤ　Ｎ　Ａをプローブとして解析する方法
は、その簡便性において従来の方法より優れている。実
施例において示したように、多数の試料に対しても一つ
のプローブＤＮＡを用いればよく、複数の制限酵素を用
いることにより判定の精度を高めることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、株化ヒト細胞より抽出したＤＮＡを制限酵素
Ｔａｑｌで切断し、ＤＰ膜抗β鎖ｃＤＮＡをプローブと
した時の断片分布を示す。 第２図は、株化ヒト細胞より抽出したＤＮＡを制限酵素
Ｐｓｔｌテ切断し、ＤＰ膜抗βｗｉｃＤＮＡをプローブ
とした時の断片分布を示す。 第３図は、株化ヒト細胞より抽出したＤＮＡを制限酵素
Ｍｓｐｌで切断し、ＤＰ膜抗β鎖ｃＤ　Ｎ　Ａをプロー
ブとした時の断片分布を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ＨＬＡクラスII　ＤＰ抗原（ヒト白血球抗原）をＤ
   ＮＡの多型性を利用して型判別する時に使用するｃＤＮ
   Ａプローブ。 ２、ＤＰ抗原のβ鎖遺伝子をコードするｃＤＮＡで下記
   の塩基配列の一部又は全部を含むことを特徴とする特許
   請求の範囲第１項記載のｃＤＮＡプローブ。 【遺伝子配列があります】 ３、特許請求の範囲第２項記載の塩基配列を含むプラス
   ミド。 ４、特許請求の範囲第１項記載のｃＤＮＡプローブを用
   いてＨＬＡ　ＤＰ抗原をＤＮＡの多型性を利用して型判
   別する時に制限酵素としてＰ　ｓｔＩ、Ｍ　ｓｐｌおよ
   びＴ　ａｑｌを用いること。