JPS63228070A - 化学反応を段階的に行う装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は化学反応を段階的に行う装置に関し、特にタン
パク質またはペプチド類の配列解析を行う（ｓｅｑｕｅ
ｎｃｉｎｇ）装置に関する。

〔従来技術とその問題点〕

タンパク質中のアミノ酸の配列構造、すなわち、個々の
アミノ酸が直線鎖状（ｌｉｎｅａｒ　５ｕｃｃｅｓｓｉ
ｏｎ）になっているものはタンパク質の生物学的機能を
決定する高次構造の決定基準とされている。従って、タ
ンパク質の配列解析（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｏｆ　ｐ
ｒｏ−ｔｅｉｎｓ）は例えば遺伝工学など生物学的研究
及び産業において極めて重要である。以下の説明におい
て、タンパク質、ペプチド類、ポリペプチド類の間の差
はなく、「タンパク質」という用語を使う場合はこれら
の物質全てを包含した部類を意味するものとする。

タンパク質中のアミノ酸の配列を自動的に決定するタン
パク質配列解析（ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎａｔｏ
ｒ）Ｐ、Ｅｄｍａｎ　とＧ、Ｂｅｇｇらによって、ヨー
ロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリイ（Ｅ
ｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ）　、第１巻、１９６７年第８０−９１頁に
記載されている。この配列解析装置はイソチオシアン酸
フェニル分解反応（ｄｅｇｒａｄａｔｉ。

ｎ）の原理により作動する。この分解反応過程により、
遊離のＮ−末端α−アミノ基がまず塩基性環境下でイソ
チオシアン酸フェニル（ＰＩＴＣ）とのカップリング工
程においてチオ尿素フェニル（ＰＴＣ）誘導体に変換さ
れる。チオ尿素二エニル誘導体は強酸性環境下で分割さ
れ、チアゾリノン誘導体導体に変えられる。鎖状のアミ
ノ酸中の連続するアミノ酸のα−アミノ基はしたがって
、遊離されヤ　１ｉ１ 使用するより周定される。

Ｅｄｍａｎ及びＢｅｇｇによる前述の記事から周知の配
列解析装置はＵＳ−Ａ−３（米国特許出願番号）　７２
５０１０にも記載されていて、決定するタンパク質の分
解をする反応容器及び試薬や溶媒を貯蔵する複数の貯蔵
器から成る。該貯蔵器は一定の圧力下にあり、適当なバ
ルブを開けることにより液体流またはガス流が該反応容
器に供給される。反応容器は縦軸にそって連続的に急速
回転する円筒状のガラスのカップである。タンパク質は
カップの内壁に薄膜状に塗布（ａｐｐｌｙ）される。カ
ップの底部にある供給ラインを通って導入された試薬と
溶媒は遠心力により内壁をよじ登り、カップの上縁の近
くにある環状の溝に蓄積される。蓄積された液体は底部
パイプを通して排出ラインに排出される。

この周知のアミノ酸配列解析装置において、タンパク質
層の塗布及びこのタンパク質層の上を伝って行く試薬及
び溶媒の液状膜は余り正確ではなく比較的多量のタンパ
ク質及び液体が充分満足の行くほどの反応収量を得るた
めには必要である。

さらに、タンパク質を溶解する試薬は容器の縁にある環
状の溝に向ってタンパク質層の上を滑るように移動して
いくにつれ次第に該タンパク質を洗い流してしまうこと
もある。

タンパク質が溶媒や試薬によって洗い流されるのを防ぐ
工夫をこらしたタンパク質の配列解析を行う装置につい
てＵＳ−Ａ−３（米国特許出願番号）８９２５３１及び
ｔｌｓ−Ａ−４（、米国特許出願番号）　０６５４１２
に記載されている。これらの装置では、タンパク質が例
えば紙ストリップ（ｐａｐｅｒ　５ｔｒｉｐ）またはガ
ラス繊維状膜（ｗｅｂ）などの多孔性表面にディポジッ
トされ、試薬は蒸気状で与えられる。しかしながら、反
応速度や反応の完了度合はＥｄｍａｎ法の液状に比較し
て気体状または蒸気状（ｖａｐｏｒ　５ｔａｔｅ）の試
薬を使用する場合は減少する。さらにタンパク質は多孔
性材料の穴に集まりタンパク質試料の表面積を減少させ
、これは特定のタンパク質の緒特性及びタンパク質が多
孔性表面でどのように拡がるか、予測不可の多数の要因
に依存する。従って、タンパク質が集塊する領域が存在
し、試薬や溶媒のアクセス度合が減少する。これに反し
て他の領域ではほとんどあるいは全くタンパク質が存在
せず、その結果試薬は反応せずに通過してしまう。

以上がこのような気相方法の反応収量が比較的低い主な
理由である。

（発明の目的） これまで述べた従来技術にかんがみて、本発明の目的は
、さらに高い反応収量を上げ、反応過程の制御を改良し
、試料、試薬、溶媒の使用量を減らし、簡単な構造を有
することを特徴とする段階的に化学反応を行う装置を提
供することである。

〔発明のイ既要〕

本発明に係る化学反応を段階的に行う装置はその軸の回
りを急速回転するカップ形状の反応容器、反応容器に連
続的に各種の試薬や溶媒を導入する供給系、反応生成物
及び過剰な生成物を取り除く取り出し系から成り、供給
系は供給管を含み供給管の開口部は反応容器の内壁に接
近していて試薬や溶媒が試料物質に与えられるように配
置され、取り出し系は反応生成物及び過剰の生成物を反
応容器の底部から取り出すだめの取り出し管から成る。

本発明は例えば分析されるタンパク質などの試料物質の
上に試薬を膜状にしてディポジットすることが可能であ
る。従って、試料物質と試薬の間でタンパク質を洗い流
すような連動的な動きを防ぐことができる。タンパク質
と試薬は相互に液状の膜として与えられるので、広い接
触面積を有し、よって、高い反応収量が得られる。

さらに均一な液状膜を生成するために、供給管は回転す
るカップの壁土に膜を与える間上下に動かすことができ
る。

供給管としても取り出し管としても同じピペットを使用
することが可能である。反応容器の回転速度を溶媒が壁
に供給されている間減少させることができ、反応生成物
または反応溶液は壁を伝ってらせん状に流れ落ち容器の
底部に集まる。これはタンパク質の配列解析過程におい
て反応過剰生成物を洗い流しＡＴＺアミノ酸を抽出する
ために行われる。反応容器の回転が停止すると、望めら
れた液体を容易に底部から取り出せることができる。

液体を反応容器に導入したり反応容器から液体を排出し
たりするだめのピペットは管系一方の端部を形成し、反
対側の端部は可逆ポンプに連結しピペットを通じて液体
を吸い込んだり放出したり操作できる。このようにして
試薬及び溶媒の正確な計量ができるので明確に定義され
る反応条件を確実にする。管系は軸の回りを回転するア
ームを形成し、ピペットが描く円は反応容器の中心の第
１点、反応容器の周辺近くの第２点、貯蔵器が放置され
る位置上の第３点から構成される。

貯蔵器、廃棄物容器、及び他の容器は１つの基はピペッ
トを容器の中に浸せるような位置に配置される。この結
果、装置の設計は節単になり自動化が容易である。

本発明はさらに溶媒及び試薬が移動可能な部材やシール
と接触せずに極めて短い距離で反応容器や他の容器に到
達するという利点を有する。従って、送り込まれた物質
が供給管の表面やバルブの移動可能な部材と接触しそこ
に吸収されて時間的に後の時点をおける管の中を流入す
る液体の汚染あるいは漏出することになるような従来技
術の問題を回避することができる。さらに、本発明は少
量の液体を正確に計量することができ、例えば１００ピ
コモル以下のタンパク質など非常に少量の試料物質を使
用することが可能である。試料及び溶媒の必要量及び過
剰生成物の量が少なくなる。

一方の試料物質と他方の試薬及び溶媒との強力な接触に
より反応時間は短く、行われる反応回数が例えばタンパ
ク質の配列解析等と同様の極めて多い場合は特に有利で
ある。本発明に係る化学反応を段階的に行う装置の設計
は部用であることより、さらに複雑な従来技術より欠点
が少ない。

本発明のさらにもう１つの利点は、本装置で行われる反
応の初期の収量及び繰返し得られる収量反応生成物はほ
とんど不純物を含有しない濃縮しまた状態で得られるの
で、続いて行われるクロマトグラフィ分析の検出限界を
低くすることができる。

本願発明では、タンパク質の分析ばかりでなく例えばオ
リゴヌクレオヂド類またはペプチド類の合成などの他の
逐次化学反応過程にも使用できることは明らかである。

〔発明の実施例〕

本発明に係る一実施例を以下に詳述する。本実施例では
、タンパク質の分解などの化学反応を起こす反応容器１
を備える。一般的に円筒型の反応容器１はモータ３によ
って駆動される回転シャフト２に固定される。反応容器
１の詳細は第２図を参照して以下に説明する。反応容器
１はその上部と底部を密封したシリンダ４によって形成
されるチャンバ内に配置される。

さらに、モータ６の手段によって回転するカル−セル（
ｅａｒｒｏｕｓｅｌ）　７の十に配置された試薬及び溶
媒の供給貯蔵器５ａ、５ｂを備える。供給貯蔵器５ａ、
５ｂはカル−セルフと共にシリンダ８、基板９、中心板
１０で形成された密封チャンバ内に置かれる。貯蔵器５
ａ、５ｂはまた洗浄又はすすぎ液を容れるためにもある
いは廃棄物の容器としても使用できる。

マイクロピペット１１は移動可能なキャピラリ管１２を
介してよりモータＩ４によって作動するポンプ１３と接
続する。ポンプ１３は、例えばシリンジであることが可
能である。ピペット１１とキャピラリ管１２とポンプ１
３は液体を吸引したり計量したりできる分配系を形成す
る。ピペット１１はキャピラリ管１２と共に軸２３の周
りを回転し、上下に移動できるピペット・ホールダ１５
に取付けられる。駆動素子１６はこれらの動きを行うた
めに備えられる。ピペット１１はボア１７を通って貯蔵
器５ａ、５ｂの１つに下降するか（ｄｉｐ　１ｎｔｏ）
またはボア１８を通って反応容器１の中央に下降する。

反応容器１を被う基板の第２のボア１９は反応容器１の
中央より外側でその壁側付近に位置する。ボア１７．１
８．１９は軸２３の周りを回転するときピペット１１の
先端部によって描かれる単一円周上に位置する。従って
、本実施例では、ボア１９はボア１７と１８を含む断面
に正確に位置しておらず幾分該断面の外側にある。本実
施例のピペット１１の内径は０．８ｍＴ１１、外径は１
．６鵬である。

ピペット１１が中心を外れたボア１９を通って下降する
と、ピペット１１の先端部は反応容器１の内壁に接触せ
ずに非常に接近する。このようにして、液体とその中で
溶解している物質は反応容器ｌの壁部に直接ディポジッ
トされる。ピペット１１の先端部によって描かれる円周
上にさらに例えば変換を 容器（ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ　ｖｅｓｓｅｌｓ）または
フラクション・コレクタなど、別の容器へアクセスする
ための付加的な開口部を設けることも可能である。この
ような開口部は適当な錠を有する。各チャンバには不活
性ガスで連続的に浄化できる（ａ　ｃｏｎｔｉｎｕ−ｏ
ｕｓ　ｐｕｒｇｅ）連結部がある。この方法によりまた
装置自体の本質的な密封解除によりチャンバ内の周囲空
気の出入を禁止し、装置の種々の領域の間における物質
の交換を最小に減少させる。実際にタンパク質の配列解
析においては、反応の中には酸素や水に極めて敏感なも
のがあるので、全反応系は不活性ガスの雰囲気内で行わ
れる必要がある。

さらに、タンパク質の配列解析に必要とされる試薬は腐
食性があり（ｐＨ（ｉｉ　：　ｏ　〜９　）悪臭（ｉｌ
ｌ　ｓｍ−ｅｌｌｉｎｇ）がするので、その貯蔵容器及
びタンパク質配列解析装置のチャンバの密封は重要であ
る。

反応容器ｌの一実施例を第２図にさらに詳細に示す。反
応容器１は円筒状上部３０と底部で細くなる下部から成
るカップ状の形を有する。カップの底部は半球状体３１
の形状を有し、最底部には液が貯まり、ピペット１１に
アクセス可能なみぞ３２を備える。反応容器１は、その
下方部を回転シャフト２に固定する（第１図参照）、操
作において、反応容器１は軸３３の周りを回転する。反
応容器１は例えばガラスまたはセラミックス等より成る
。実際的な側としては、カップの内径は１５胴、カップ
の底部から上部リム４３までの高さは２２．５ｍｍであ
る。

本発明による装置の操作を第３Ａ図から３Ｃ図に基づい
て詳述する。第３Ａ図により、分析されるタンパク質は
反応容器であるカップ１が急速に回転しているときピペ
ット１１の手段により内壁４０上に移される（ｐｉｐｅ
ｔｔｅｄ　ｏｎｔｏ）。典型的な回転速度は例えば１分
あたり６０００回転である。ピペット１１の先端部４１
は内壁上に容易にタンパク質を与えることを確実にする
ため、図示の如く傾斜している。得られたタンパク質ス
トリップは、幅数朧で簡単にアクセス可能で、極めて均
一な膜を形成する。タンパク質を供給する間、ピペット
が上下に動かすとき、得られた膜はさらに均一なものと
なされる。

次の工程において、ピペット１１は反応容器のカップ１
の上部リム４３の上に持ち上げられ、全ピペット管組み
立て体１１．１２．１５（第１図参照）は軸２３の回り
を回転するのでピペット先端部はボア１７の上に位置す
る（第１図参照）。この反応工程で必要とされる試薬の
貯蔵器はカル−セルフを回転させてボア１７より下に設
置された後、ピペット１１を下降させ、あらかじめ決め
られた量の液体をポンプ１３を適切な制御下で吸引させ
る。次にピペット１１を持ち上げ、その先端部がボアの
１９の上に位置するまで回転して戻し、反応容器のカッ
プ１の中に下降させる。そして、ポンプ１３をピペット
１１から壁部上に液体を放出するように制御する。この
ようにして、試薬は均一な層としてタンパク質膜上に置
かれる。所望により、前工程でタンパク質膜の供給と同
様にして試薬の放出中ピペットを上下に移動することが
可能である。この方法でタンパク質と試薬の間に連動的
な動きを生ずることなく試薬はタンパク質膜と接触する
ことは本発明の重要な特徴である。連動的な動きが存在
しないので、タンパク質を洗い流すことを避けることが
できる。これは試薬がタンパク質の上を流れてその一部
を洗い流してしまう従来技術と実質的に異なる点である
。従来技術とは反対に本発明によると試薬層はタンパク
質層上に設けられ２つの眉間の密接接触を確実にし、タ
ンパク質層を洗い流すことを防ぐことができる。

試薬層をタンパク質層の上に設けた後、これに含まれて
いる水分と揮発成分を蒸発によってタンパク質膜から除
去し、非揮性発成分は有機溶媒で洗い出す。余分の液体
を洗い流しＡＴＺアミノ酸を抽出するためにビペッ）１
１は再び持ち上がりボア１７の上に位置するよう回転し
、そして、ボア１７の下に設置され呑適切な溶媒の容器
中へ下降させる。

所望の量の溶媒を吸引した後該ピペットをボア１９の上
の位置まで回転して戻し、第３Ｂ図に示すように、タン
パク質膜の上側リムの上にピペットの先端部４１が位置
するまで下降させる。反応容器１の回転速度はタンパク
質膜の上に壁に対してピペットから移される溶媒がらせ
ん状経路でタンパク質膜上を横切り、最後には反応容器
の底部に集まるように減少させる。この工程の回転速度
は例えは１分間あたり６００回転である。

反応容器のカップ１が静止状態である場合、ピペット１
１が第３Ｃ図に示される位置の中央ボア１８を通って移
動した後、ＡＴＺアミノ酸または廃棄物を含有する溶媒
をピペットで吸引し変換容日または廃棄物容器のいずれ
かに供給する。分割されたアミノ酸の決定はアミノ酸の
種々の保持時間に基づいて液体クロマトグラフィを使っ
て行うことができる。次に前述の工程を繰り返してタン
パク質のアミノ酸鎖の次のアミノ酸を分割する。

反応容器１の内壁にディポジットされたタンパク質層は
過熱抵抗部材と接触せずに過熱される。

タンパク質層はそのすぐ近くのボートを通して供給され
る。不活性ガスで乾燥することが可能である。

〔発明の効果〕

以上述べたように、本願発明では、極めて正確で高い収
率をあげる化学反応を段階的に行うことが可能で、構成
が簡単な化学反応を段階的に行うとか可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の一実施例の概略図。 第２図は、本発明の一実施例である装置に含まれる反応
容器の詳細断面図。第３Ａ図から第３Ｃ図は、本発明の
一実施例の動作説明図。 に反応容器　　　　　２：回転シャフト３．６．１４：
モータ　　４ニジリンダ５ａ：５ｂ：供給貯蔵器 ７：カル−セル　　　　１１：ピペット１２：キャビラ
リ管　　　１６：駆動素子１７．１８．１９：ボア　　
　３１：半球状体３２：みぞ

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）その縦軸を周りを回転するカップ状の反応容器と
   種々の試薬及び溶媒を前記反応容器に連続的に供給する
   供給系と前記反応容器の内側壁部上に設けられた試料物
   質と反応させるため反応生成物及び過剰の生成物を除去
   するための取出し系から成る化学反応を段階的に行う装
   置において、前記供給系は前記試薬と前記溶媒を前記試
   料物質に添加するため、前記反応容器の内側壁部付近に
   位置する開口部を備える移動可能な供給管より成り、前
   記取出し系は前記反応生成物及び前記過剰の生成物を前
   記反応容器の底部から取除くための取出し管より成るこ
   とを特徴とする化学反応を段階的に行う装置。
2. （２）請求項第１項の化学反応を段階的に行う装置は、
   タンパク質の自動配列解析及びオリゴヌクレオチド類又
   はペプチド類の合成に使用することを特徴とする。