JPS63201507A - 層の厚さを測定する方法及びその方法を用いてある一定の相互作用を測定する方法及びその方法を実施するための手段 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、キャリヤー（担体）へ施与された薄層の厚さ
の変化及び／又は厚さを測定する方法に関する。この方
法においては薄層で被覆されたキャリヤーを平面偏光ビ
ームで照射して、キャリヤー及び層上での反射率を検出
し、その後検出された光の測定量を層厚及び／又は層厚
の変化へ換算する。本発明はまた、該方法を用いてタン
パク質／キャリヤー及びタンパク質／タンパク質の相互
作用を測定する方法及び該方法を実施するための手段に
関する。

前記のような方法及び表面上の免疫学的反応の定量化へ
の前記のような方法の適用は、アナリティ力ルバイオケ
ミストリ１４５（１９８５）、　　１０６〜１１２ペー
ジに記載された論文から公知である。この公知方法では
、（擬）ブルースター角に本質的に等しい角度の入射平
面において偏向された光がキャリヤーへあてられる。反
射光の強度が測定される。キャリヤー上への薄層の積み
重なり（ｂｕｉｄ−ｕｐ）に伴い反射率の反射値が変化
し、従って、強度が変化する。この強度の変化が薄層の
厚さの尺度になる。

公知の方法には、使用された光源の強度の変動に敏感で
あるという問題がある。その理由は、強度の変化が厚さ
又はその変化の直接的な尺度として使用されるからであ
る。この誤差の源は、例えば安定な波長で高強度を与え
るヘリウム−ネオンレーザ−のような信頼できるレーザ
ー光源の使用によって相当な程度まで除去することがで
きるけれども、必ずしも普遍的にヘリウム−ネオンレー
ザ−が適用できるとは限らないということを考慮すると
、強度依存性がこの方法に限界をもたらす。

また、測定感度を計算する公知の方法においては、光ビ
ーム及び反射の強度及び光通路中のすべての光学成分の
透過特性を知らなければならない。

本発明の目的は、使用される光源の強度にもはや敏感で
ない改良された方法を提供することである。これを目的
として、本発明は、キャリヤー及び薄層によって反射さ
れた光がｐ−偏光部とＳ−偏光部とに分割され、その後
それぞれの反射値Ｒ及びＲが二つの部分として同時に測
定さＳ れ、量 Ｒ十ｍＲ ｐ （式中、ｍは可変のパラメーターであり、そして量Ｍは
薄層の厚さの関数である。） が決定される方法を提供する。ｍの値は、Ｒの最大値が
ｍＲの最大値にほぼ等しくなるように選択されるのが好
ましい。

測定結果が基体によって反射される光の強度で直接的に
は変化しない層厚の測定方法自体は多くの出版物から公
知であることを付言すべきである。

しかしながら、それらの方法は常に楕円偏光解析性測定
の特別な態様である。そのような方法の欠点は、層厚の
測定毎に分析器を異なるようにセットして、別々の時刻
に行われる二つの測定が要求されるということである。

実際に、１９７３年１１月のアイビーエム（ＩＢＭ）ジ
エイ、　　（Ｊ、）レス（Ｒｅｓ、）デベロップ（Ｄｅ
ｖｅｌｏｐ、）、　　４７２〜４８９ページには、分析
器を回転させると二つの測定の時間の間隔を相当減少さ
せられるということが提案されている。しかし、まだ層
厚測定のためのコンピュータープログラムを必要とする
欠点が残っている。

米国特許明細舎弟２６６６３５５号は、通常の楕円偏光
測定器を使用する層厚の連続測定を開示している。それ
によるタンパク質層の成長の測定においては、各測定の
ための異なる測定セットの問題はなく、反射光の強度は
薄層の厚さの尺度であるように思われるが、そのような
方法は何らの利点を与えず、仮に利点があるとしてもア
ナリティカルバイオケミストリー中で論じられている前
記方法以上のいかなる利点をも提供するものでもない。

最後に、ソリッド　ステート　エレクトロニクス、第１
２巻、　Ｎｏ、ｌＯ，１９６７年１０月、ペルガモン　
プレス（Ｐｅｒｇａａ＋ｏｎ　Ｐｒｅｓｓ）　、　　７
６５〜７７４ページにスミス等による論文がある。その
中には本発明の場合のようにｐ−及びＳ−偏光ビームの
分離用偏光ビームスプリッタ−が述べられているが、そ
れは本発明の方法によって意図されるものから全く異な
っている。その理由は、該公知の方法は単に分析器をセ
ットすることによって等しい強度の二つの光ビームを容
易に得ることを目的としているからである。入射光へ同
じ方法を適用し、そして４５°を通って検出器アセンブ
ラを回転することによって楕円率パラメーターΔ及び４
を分析器の異なる角位置から決定することかできる。従
って、この方法を層厚の連続的な測定に使用することは
できない。

ｐ−偏光光の反射及びＳ−偏光光の反射の両方を本発明
の方法によって測定することによって、及び１ワられた
測定データを巧みに組合せることによって、得られた信
号は放射光源の強度に敏感でなくなる。本発明の方法は
層厚の変化に対するより大きな感度を有しそして広い線
形測定範囲で実施することができるという利点もある。

タンパク質層の成長の測定において、測定結果は前もっ
てキャリヤーへ施与された層の屈折率及び厚さに対し広
い範囲で独立である。

薄層の厚さの関数である吊Ｍの式において、可変のパラ
メーターｍは入射ｐ−偏光光れた光の強度対入射Ｓ−偏
光された光の強度の比を構成している。この比は、入射
の面での平面偏光された光の偏光方向の角度を変化させ
ることによって変えることができる。光源がレーザーで
ある場合には、これはレーザーをその軸の回りに回転さ
せることによって容易に達成される。

本発明の方法は、平面偏光レーザービームをブルースタ
ー角で基体へあて、反射ビーム中に偏光化ビームスプリ
ッタ−をおき、それがｐ−偏光及びＳ−偏光を分割する
ことによって行われる。

従って、二つの別々の光検出器を使用してｐ−反射及び
Ｓ−反射を同時に測定することができる。

この二つの反射間の差は、それらの合計で電子的に割ら
れる。この最後の信号が基体上の層の厚さの尺度である
。

本発明の方法は、有機物質の層の変化の決定又は層厚の
測定に特に適している。本発明の方法の好ましい実施態
様において、量Ｍと前もって施与された薄層上に作られ
た有機層の厚さとの間にほぼ直線的な関係があるような
厚さの透明な無機物質又は有機ポリマーの薄層で前もっ
て被覆されたキャリヤーが、キャリヤー上の有機層の成
長の程度を測定するために使用される。ここでは、適当
な方法で約０．１５λ／ｎの厚さの有機ポリマーの薄層
を被覆しであるキャリヤーを使用し、但しλは光の波長
であり、そしてｎはポリマーの屈折率である。

ある一定の厚さの値から本発明によって測定された量Ｍ
と基体−ヒに存在する層の厚さとの間の関係が相当広い
範囲にわたってほぼ直線的であるこ°とがわかった。本
発明の方法を有機層、例えばタンパク質溶液からのタン
パク質層が形成されているか否かを測定するために使用
する場合には、測定は前記直線域において行われるのが
測定の正確性のために好ましい。これはシリコン又はガ
ラススライドのような基体へまず石英のような無機物質
の薄層又はポリスチレンやナイロンのような有機ポリマ
ーの薄層を適用することによって行なわれる。４０ｎｍ
以上、例えば約５０ｎｍのポリスチレン層の厚さを有す
るポリスチレンを使用し、そして光源としてＨｅ−Ｎｅ
レーザー（波長６３２．８ｎｍ）を使用すると、量Ｍと
ポリスチレン上に形成している別の層の厚さとの間に好
ましい直線関係を生じる。

溶液からの層の成長の測定に本発明の方法を使用するた
めに、いくつかの実施態様を行うことができる。第１の
実施態様においては、基体をテストすべき溶液を入れで
あるセル中に置き、そしてセルの壁を通してレーザービ
ームを基体へ望ましい角度であてる。反射光をセルの外
で受け、前記方法で処理する。この第１の実施態様は濁
った液における直接的な測定に対して十分には満足な結
果を与えない。そのような場合には本発明の方法の第２
の実施態様を行うのが好ましい。第２の実施態様におい
ては、キャリヤーとして又は基体としてプリズムを使用
し、そして光、例えばレーザービームを、それが側面を
通して入り、側面を通して出て、かつ薄層が存在する基
部面で反射するようにプリズムへあてる。基体がセル中
に置かれる第１の実施態様では、光源としてヘリウムネ
オンレーザ−が、そして基体としてシリコンスライドが
適当な方法で使用される。シリコンはヘリウムネオンレ
ーザ−の放射線に対して不透過性であるので第２の実施
態様はそのようなレーザー及びシリコンプリズムを用い
て行うことはできない。

そのレーザーの代わりに別のレーザー、例えば１．５３
ｎｍで放射線を放出する半導体レーザーを使用すること
ができる。また、好ましく可能な最も高い屈折率を有す
るガラスプリズムを使用することができる。

本発明の方法は、成る相互作用、例えばタンパク質／キ
ャリヤー及びタンパク質／タンパク質相互作用の測定に
適用するのに好都合である。すなわち、本発明の方法は
、異なるタンパク質溶液を順次用いて多数回適用される
。本発明の方法を適用する実験において、あらかじめ約
５０ｎｍのポリスチレンの薄層で被覆された基体を三つ
のタンパク質溶液、すなわち抗ＨＣＧ、ＢＳＡ及びＨＣ
Ｇに順次接触させた。ポリスチレンの薄層上で抗ＨＣＧ
の成長が起ったことが見られた。ＢＳＡを有する溶液に
おいては層厚の変化が生じるのを見出せなかったが、Ｈ
ＣＧを有する溶液においては層厚の増加が生じた。従っ
て、既知のＨＣＧ溶液ではな（てＨＣＧを含むかどうか
疑われている溶液を使用する場合に、ＨＣＧの存在を証
明することができる。本発明の方法の前記適用において
使用する適当な手段は、平面形又はプリズム形のキャリ
ヤーであって、その一つの表面が少くとも４０ｎｍの厚
さの有機ポリマー物質、例えばポリスチレンで被覆され
ているものである。そのようなキャリヤーを使用すると
、前記直線的な測定範囲でこの方法を実施することがで
きる。

以下、添付図面を参照して、本発明をさらに説明する。

図１は、窓２及び３を備えたセル１を含む概略的に表わ
した測定配置の平面図である。窓２及び３はセル１の側
壁を構成している。セル１中には液体、例えばタンパク
質溶液が含まれ、該セル及び液体中に基体４が置かれる
。基体４は、例えば約６０ｎｍのポリスチレン層で被覆
されたシリコンスライドであることができる。レーザー
源５、例えばヘリウムネオンレーザ−から、偏光された
ビーム６が窓２を通して基体４へあてられる。ビーム６
が実質的にブルースター角で基体４にあたるようにセッ
トされる。ビーム６は基体４及び、薄層が基体上に存在
する場合にはその薄層で反射され、そして窓３からセル
１を出る。反射ビーム１０６は適当なフィルター７を通
って偏光化ビームスプリッタ−８にあたり、そのスプリ
ッター８によってｐ−偏光ビーム９及びＳ−偏光ビーム
１０に分離される。これらのビーム９及び１０は次にそ
れぞれ検出器１１及び１２によって受は取られる。それ
らの検出器は概略的に示した電子的処理ユニット１３へ
接続されている。ユニット１３は量Ｍ＝（Ｒ−ｍ　Ｒ）
　／　（Ｒ＋　ｍ　Ｒｐ　）を検出器の信号からＳ 誘導する。反射されたｐ−偏光とＳ−偏光との間の比が
平衡状態にあるために、平面偏光されたレーザービーム
６の偏光方向はｐ−偏光ビーム９とＳ−偏光ビーム１０
との強度の比が３＝１であるように選択される。その場
合に、電子ユニット１３によって測定された測定値はＭ
＝（Ｒ−３Ｒｐ）／　（Ｒｓ十３Ｒ，）に対応している
。この状態が得られるのは、レーザービーム６の偏光方
向が入射の平面に対して３０°の角度である場合である
。この量Ｍは強度に依存し、基体４上にある層の厚さの
関数である。ビーム６がブルースター角で基体にあたる
ので、基体上に層が存在しない場合にはＲ＝０及びＭ＝
１である。層厚とＭとの間の関係は、約４０ｒ＋ｍから
の層厚でほぼ直線的であると考えられる。従って、比較
的薄いタンバク質層の成長の研究のためには、基体４が
約５０ｎｍのポリスチレンの層で被覆されていることが
望ましい。これは例えばスピンコーティングによって行
われることが出来る。

図１の測定配置を使用して満足な結果が得られるが、濁
った液又は吸収性液体の場合には、それを使用して測定
することはほとんど不可能である。

さらに、この方法は比較的多ｎの溶液を必要とする。こ
れらの欠点は、基材を通る反射を測定することによって
回避することができ、従って光はもはや溶液を通過しな
い。このためにセットされた測定配置が図２に概略的に
描かれている。図２及び図１中の類似部分は同じ数字に
よって表わされている。

図２の基体１４は、例えばヘビープリントガラス（ｎＤ
＝　１．７８４）で作られることができる等辺プリズム
である。プリズム１４の対等な面１５及び１６は反射防
止被膜を有している。基底面はポリスチレン（厚さ約５
０ｎｏ＋）の薄層１７で被覆されている。

そのような層はスピンコーティングによって得ることが
できる。

プリズム１４は、側面へ直角に入射する光がガラス−水
の界面に対してブルースター角（３７’　）で基底面に
あたるようにカットされている。反射ｐ−偏光と反射Ｓ
−偏光との間の比が平衡状態にあるために、ヘリウムネ
オンレーザ−５の平面偏光されたビーム６の偏光方向を
、ｐ−偏光ビーム９とＳ−偏光ビーム１０との強度の比
が５０＝１になるように配置する。その場合に、電子ユ
ニット１３によって測定された値Ｍは Ｍ−（Ｒ−５ＯＲ）　／　（Ｒ＋５ＯＲ，）である。

Ｓ　　　　　　ｐ　　　　　　　　Ｓ ただしレーザービーム６の偏光方向は入射の平面に対し
て８．０５°の角度である。

セルとしてのリング１８がプリズム１４の基底面上に置
かれている。このリング１８はポリスチレンで製造する
ことができる。適当なリングは内径５ｍｍ。

外径１０ａｕ＋＋及び高さ５＋＋ｍのものである。リン
グ１８の下側とプリズム１４との間に１滴のトルエンを
置いてリングをプリズムへ接着することができる。試験
溶液は、測定配置からプリズムを動かすことなしにセル
１８へ入れられ、そしてそれから吸取られる。図２にお
いては溶液１９がセル中に存在する。

リング又は類似の形状のセルを使用する代わりに、試験
液の数滴を層１７へ直接的に施与して測定を行うことも
当然可能である。

実施例 図２に描いたテスト装置を、いくつかのタンパク溶液の
試験に用いた。下記の三つのタンパク質溶液を順次、測
定配置のセル中に導入した。

ａ、抗ＨＣＧ１４７　ｂ１００＋ｗｇ／　ｆｌｂ、ＢＳ
Ａ　　　　　　　　　　　　１００■ｇ／Ｎｃ　、　Ｈ
ＣＧ　　　　　　　　　　　　１００ｍｇ／Ｎ溶液はリ
ン酸塩緩衝溶液、ｐＨ７，５であった。別　４の溶液を
導入する前に、セルを純緩衝液ですすいだ。試験の結果
は図３のグラフに与えられている。

該グラフにおいては構成されたタンパク質層の厚さく　
ｒ＋ｍ）を時間ｔ　（分）に対してプロットしである。

１＝０の前の曲線２０の部分は純緩衝液によるすすぎに
関係している。１＝０で、抗ＨＣＧ１４７ｂがセル中に
導入される（グラフ中矢印ａ）。

１分間以内に約４ｎｍの層が作られるのが認められた。

この厚さは、ｔ＝４付近での洗浄にもかかわらずほぼ一
定に保たれる。ｔ＝６で、ＢＳＡ溶液がセル中に導入さ
れる（グラフ中矢印すによって示される）。これは、す
でに存在する層の厚さに影響しないことが判った。ｔ＝
７付近でのすすぎの後、ＨＣＧ溶液をｔ＝８の直後にセ
ル中へ導入した。すると極めて短時間で層の厚さはほと
んど６ｎｍに増加した。

実施例は、本発明の方法が、あるタンパク質の存在を証
明するため非常に適していることを示している。

【図面の簡単な説明】

図１は本発明の方法の第１の実施態様を行うための測定
配置を示す略図である。 図２は本発明の方法の第２の実施態様を行うための測定
配置を示す略図である。 図３は本発明の方法の第２の実施態様を行った場合につ
いて、層厚の増加を時間に対してプロットしたグラフで
ある。 ｆｉｇ、１ ｆｉｇ、２ 一一一うシｎｍ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、キャリヤーへ施与された薄層の厚さ及び／又は厚さ
   の変化を測定する方法であって、薄層で被覆されたキャ
   リヤーに平面偏光された光ビームを照射しそしてキャリ
   ヤー及び層上での反射を検出し、その後検出された光の
   測定量を層厚及び層厚の変化に換算する方法において、
   キャリヤー及び薄層によって反射された光をｐ−偏光部
   分とｓ−偏光部分とに分離し、その後各々の反射値Ｒ＿
   ｐ及びＲ＿ｓを二つの部分として同時に測定し、そして
   量 Ｍ＝Ｒ＿ｓ−ｍＲ＿ｐ／Ｒ＿ｓ＋ｍＲ＿ｐ （式中、ｍは可変のパラメーターでありそして量Ｍは薄
   層の厚さの関数である。） を決定することを特徴とする方法。 ２、キャリヤー上の有機層の成長の度合を測定するため
   に、量Ｍと前もって施与された薄層上に構成された有機
   層の厚さとの間にほぼ直線関係があるような厚さの透明
   な無機物質又は有機ポリマーの薄層で前もって被覆され
   たキャリヤーを使用することを特徴とする特許請求の範
   囲第１項の方法。 ３、量Ｍと前もって施与された薄層上に構成された有機
   層の厚さとの間にほぼ直線関係があるような厚さの透明
   な無機物質又は有機ポリマーの薄層で被覆されているキ
   ャリヤーを使用することを特徴とする特許請求の範囲第
   ２項の方法。 ４、使用されるキャリヤーがプリズムであり、光が該プ
   リズムへ各側面を通して入り、そして出て、かつ薄層が
   存在する基底面上で反射されるように光があてられるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第３項のいず
   れか１項に記載の方法。 ５、タンパク質／キャリヤー及びタンパク質／タンパク
   質の相互作用を測定する方法であって、特許請求の範囲
   第１項乃至第４項のいずれか１項に記載の方法が、異な
   るタンパク質溶液を順次用いて多数回適用されることを
   特徴とする方法。 ６、少くとも４０ｎｍの厚さの有機ポリマー又は透明な
   無機物質の薄層で被覆された一つの面を有する平板形又
   はプリズム形キャリヤーを含む特許請求の範囲第５項の
   方法を行うための手段。