JPS63179250A - 液体クロマトグラフ用カラム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ！゛〔産業上の利用分野〕 本発明は、液体クロマトグラフ用カラムに係り、特に高
速に成分分離するクロマトグラフィーに適用するに好適
な液体クロマトグラフ用カラムに関する。

〔従来の技術〕

液体クロマトグラフ用カラムに関する第１の従来技術は
、特開昭５９−２２２７６３号に記載されている。

この例では、充填剤を充填したクロマト管の端部に孔径
の小さな内側フィルタと孔径の大きな外側フィルタを設
け、外側フィルタに送液管を直結する構造となっている
。

また第２の従来技術は、「日本分析化学会関東支部編、
高速液体クロマトグラフィーハンドブック、第８７頁、
（丸善）昭和６０年１１月１５日発行」に記載されてい
る。この例では、クロマト管の端部にセラミックスフィ
ルタを設け、その外側に四弗化エチレンネットのリング
を配置し、これ；′に送液管を接続する構造となってい
る。

！ ・′：（発明が解決しようとする問題点〕上述した従来
技術のいずれも、クロマト管内の充填剤の粒径が１０μ
ｍ以上であることを考慮して作られている。

本発明者らは、従来より一層の高速化をはかるために粒
径が３μｍ以下の充填剤を用いることを試みた。これに
伴い、液体クロマトグラフの送液管も内径が従来よりは
るかに小さい０．１　ｗｎのものを用いる必要がある０
発明者らの実験によれば、送液管内径を小さくすること
によｐて試料成分ピークの拡がりをある程度低減できた
が、従来の構成に基づく分離カラムをそのまま適用した
のでは。

充填剤粒径を小さいものに変更したことに基づく期待さ
れたほどの分離性能が得られなかった。

本発明の目的は、クロマト管内の充填剤として粒径が３
μｍ以下のものを用いた場合でも、試料成分の不適正な
拡がりを抑えて充填剤層に基づくカラム効率を効果的に
引き出すことができる液体クロマトグラフ用カラムを提
供することにある。

（問題点を解決するための手段〕 本発明の特徴は、充填剤を充填したクロマト管の端部に
充填剤流出防止用フィルタを設け、このクロマト管に向
けて漏斗状に開口した剛体座を上記フィルタの外側に設
け、これらフィルタおよび剛体座を被うように可塑性を
有するシールを配置し、この可塑性シールをクロマト管
の方へ押さえつける送液管接続用接続部材を設けたこと
にある。

〔作用〕

本発明では、クロマト管の端部を充填剤流出防止用フィ
ルタで閉じ、このフィルタを漏斗状に開口した剛体座で
抑圧可能とすることにより、フィルタの周縁部は押しつ
けるがフィルタにおける充填剤存在領域に対応する領域
は押しつけずに済むので、フィルタが膜状フィルタであ
ったとしてもフィルタを異常変形させることなく装着す
ることができ、また、送液管とクロマト管の接続部付近
における試料液がクロマト管から流出する状態に関し試
料成分バンドが不適正に拡散する状態となることを防止
できる。この構成は、接続部付近のデッドスペースを極
力小さくでき、微小内径の送液管とそれより大きな内径
を有するクロマト管をスムースにつなぎ、両者間で発生
する流体の乱れを低減し得る。換言すれば、剛体座の開
口形状を送液管からクロマト管に向かって開口する漏斗
状とすることにより、剛体座は成分バンドの拡がりを極
力小さくするように作用する。接続部付近の液漏れ防止
は、可塑性シールでもってフィルタと剛体座を被い、こ
れを送液管接続用接続部材で押しつけることによって達
成することができる。

〔実施例〕

本発明に基づく望ましい実施例では、クロマト管が大口
径のカラムホルダ内に挿入されており、送液管接続用の
コネクタがカラムホルダにネジ込み接続されているが、
このような構成は本発明の適用の一例にすぎず、カラム
ホルダがない場合でも、コネクタがクロマト管自体に接
続する態様であってもよい。

本発明の望ましい実施例では、可塑性シールが円筒状の
エンドシールから形成されており、そのエンドシール内
に、クロマト管の内径より大きな直径の円盤状フィルタ
と中央点を中心とした漏斗状開口を有する剛体の円盤状
座とを収容する構成となっている。この漏斗状開口の開
口角度は、クロマト管の内径が２．３ｍであって送液管
の内径が０．１　ｔｔｍである場合に、１５０〜１７６
度にするのが好適である。剛体座の漏斗状開口の端部直
径は、クロマト管の内径とほぼ等しいように形成される
。

剛体座は、漏斗状開口とそれに通じる貫通細孔を有する
が、この貫通細孔の直径は０．６　ｍ以下であることが
好適である。また、剛体差の厚さは０．５−〜２．０閣
であることが試料成分の不均一拡散を防止するのに有効
である。剛体座の外周直径は、エンドシールの内径と等
しいか、それよりわずかに小さく形成され、クロマト管
の内径よりは大きく形成される。この剛体座の外周直径
は、円盤状フィルタの直径とほぼ等しい。

送液管として０．１　ｗａ程度の細い管を使用し、粒径
が３μｍ以下の充填剤を用いる場合には、従来から考慮
されていたインジェクターと送液管とフローセルの容量
で決まるカラム外効果だけで試料成分バンドの拡がりを
低減することが困難であり、従来無視されていたカラム
の出入口の形状すなわち送液管とクロマト管の接続の状
態に基づく試料成分の拡がりを考慮しなければならなく
なる。

送液管の内径を従来の０．２５　ｍから０．１　ｍに細
くすると、移動相の送液流量が従来と同じであれば、送
液管からの流出時の線速度は従来の約６倍になる。この
ため、送液管とクロマト管のつなぎの状態によって成分
バンドの拡がりが左右される。

本発明の望ましい実施例では、クロマト管の出口付近の
構造を中心に説明するが、出口側の成分バンドの拡がり
はクロマト管の入口付近の接続状態に基づく試料の拡が
りによっても影響される。

従って、入口側と出口側の両方に本発明を適用するのが
最も望ましい、しかし、これらの片方であっても拡がり
を減縮する効果は得られる。

クロマト管内には充填剤を充填する都合上、送゛、＼ 竺管と同様の内径０．１　閣程度の内径のクロマト警を
採用することが困難であり１通常１〜５＋ｗｗ＋程度の
内径のクロマト管を用いることになる。ところが、送液
管からクロマト管へ試料を流入する場合には、仮に送液
管をクロマト管に直接的に接続し移動相を送液すると、
移動相は内径０．１＋ｌｌ１１の送液管から急激に内径
数■のクロマト管に拡がり。

送液中の試料は充填層の中心部に早く送り込まれ。

充填層の外周部付近はど試料の移動が遅くなる。

このため、試料のバンドの拡がりが大きくなり。

結果としてクロマト管から流出するときの分離された成
分バンド（ピーク）の対称性が悪化する。

本発明に基づけば、送液管とクロマト管の接続部におけ
る半径方向への試料の均一な分散が可能となる。

次に、第１図〜第３図を参照して１本発明の一実施例の
構成を説明する６図において、液体クロマトグラフ用カ
ラム２９は、粒径が２μｍの充填剤４を充填した金属製
円管状クロマト管１と、このクロマト管１を収納する円
筒状カラムホルダ７紀；′弾性変形し難いセラミックス
フィルタ（厚さ０．２ｍｍ）又はステンレス焼結フィル
タなどの硬質円板状フィルタ３と、厚さ０．５〜２．０
Ｉの耐蝕性金属例えばステンレス鋼からなる剛体座５と
、二弗化エチレンや四弗化エチレンなどの耐薬品性物質
からなる可塑性エンドシール２と、このエンドシール２
をクロマト管１の方向へ押し付けるようにカラムホルダ
７にネジ込み接続される送液管接続用コネクタ８とを備
えている。エンドシール２の内側には、３つの孔径の異
なる領域が形成されており、空孔径領域には台座５と充
填剤流出防止用フィルタ３とが収納され、大孔径領域す
なわち接続部１５にはクロマト管１の端部が嵌合される
。

エンドシール２の底部付近に形成された空孔径領域であ
る開口部１４は、クロマト管１の外径より小さくクロマ
ト管１の内径よりは大きくなっている。さらにエンドシ
ール２は端部中心部に小孔径領域である貫通孔１３があ
けられている。また、中心部に貫通細孔６を有する台座
５とフィルタ３はエンドシール２の開口部１４に内接す
るように開口部１４とほぼ同じ直径を有し、それらはエ
ンドシール２とクロマト管１の間の開口部１４に設置さ
れる。該クロマト管１はエンドシール２の接続部１５の
底部まで挿入してシール部を形成する。

第１図の実施例では、フィルタ３がセラミックスフィル
タの如き硬質フィルタであるので、送液管９を接続完了
した状態であってもフィルタ３の周縁部がほとんど押し
つぶされず厚さが実質的に変わらない。

第４図には他の実施例を示すが、この例ではフィルタ３
′の材質が第１図の例とは異なるだけであって他の構成
はほぼ同じである。フィルタ３′としては、多孔性四弗
化エチレンなどからなる弾性フィルタを用いている。こ
の場合は、送液管９を接続完了するとフィルタ３′の周
縁部が押しつぶされることになるが、試料の分散は第１
図の例と同程度になる。

第１図および第４図の各実施例において、クロマト管１
の両端の接続構造は同じである。クロマト管はその両端
を送液管接続用コネクタ８によって挟み込まれ、このコ
ネクタ８とカラムホルダ７との間のネジ機構により押さ
えつけられる。この時、クロマト管１の端部がエンドシ
ール２の接続部１５の底部に押しつけられ、エンドシー
ル２が弾性体であれば両者の間では充分なシールが得ら
れる。このエンドシール２の開口部１４の段差をフィル
タ３と台座５の厚さの和よりわずかに高くすることで、
クロマト管１の端部を実質的にフイルタ３に接するまで
押しつけることができる。また、コネクタ８とエンドシ
ール２はその境界面で充分に押し付けられて、完全なシ
ールを構成する。

台座５は剛体であり、変形しない強度を有する。

この台Ｐ４５の貫通細孔６と接する送液管９はエンドシ
ール２の貫通孔１３に内接し、中空ボルト１０とフエラ
ル１１により固定され、コネクタ８と送液管９は充分に
シールされる。

第１図に示した実施例では、ステンレス鋼製のクロマト
管１として内径１〜４ｍ、外径２〜５１ｗ＋のものを用
いたが１台座５の直径、フィルタ３の直径、及びエンド
シール２の接続部１５．開口部１４を各々のクロマト管
の内径、外径に合わせることでカラムホルダ７、コネク
タ８は共用できる。

また、台座５は貫通細孔６の内径０．４ｍ、厚さＱが０
．６Ｉのステンレス鋼板を用いたが、この材料としては
通常クロマト管に用いられる金属であればよい、厚さは
充填層にかかる圧力を保持できる強度であれば良く、厚
すぎるとデッドボリウム増加の原因となるので０．５〜
２閣の範囲が良い、フィルタには厚さ０．２　ｍの繊維
状フィルタ板を使用し、これらを第１図に示すように組
み込み検討した結果、耐圧５００ｋｇ／ａ＃以上のシー
ルを構成できることが確認できた。

第５図は本発明のカラムの評価に使用した液体クロマト
グラフの構成を示す流路図である。この液体クロマトグ
ラフは溶離液２５．ポンプ２６゜試料注入バルブ２７．
注射器２８．カラム２９゜検出量３０により構成される
。また、配管には特に、試料注入バルブ２７から検出器
３０まで内径０．１　ａｍのステンレス鋼管を使用した
が、配管の長さは短い程良い結果が得られた。

第６図は第３図に示す台座５の漏斗状貫通開口部２４の
開口角度を１４０’から１８０°まで変えたときの検出
器３０で得られる成分ピークの拡がりをパリアンスσ２
　（μＱ２）で示したものである。測定条件は、ポンプ
：日立６５５型ポンプ。

充填剤二粒径２μｍシリカＯＤＳ　（シリカオクタデシ
ルシラン、試作品）、カラム：４＋＋＋ｍｉ、ｄ、Ｘ５
０ｍ、試料：ベンゼン、試料量二０．５μΩ、溶離液：
メタノール、流速：１．５ｍｎ／分、検出器：日立６５
５−５１型紫外分光光度計（波長＝２５４ｎｍ）、フロ
ーセル＝０．６　μΩ、配管：内径０．１ｍＸ３００ｍ
ｓである。

第６図により、台座５の漏斗状貫通開口部２４の開口角
度は１５０＠から１７６′付近までが比較的パリアンス
が小さい領域であることが明らかとなった。

第７図は第３図に示す台座の漏斗状貫通開口部２４の開
口角度を１７０＠として、その時の台座５の貫通細孔６
の内径すを０．２　ｍから０．８■まで変えた時のパリ
アンスを示したものである。

測定条件は第６図の場合と同様である。これにより、細
孔径は０．４■以下でパリアンスが小さくなることが明
らかである。

第８図は第２図に示す台座の漏斗状貫通開口部２４の開
口角度を１７０”、貫通細孔６の内径を０．４　ｍとし
、漏斗状貫通開口部の開口端の直径ａをクロマト管１の
内径の１７４〜１／１まで変えたときのパリアンスを示
したものである。これにより、漏斗状貫通開口部の開口
端の直径ａはカラムの内径と同等の時にパリアンスが小
さくなることが明らかである。

第９図は本発明の実施例と、第２の従来技術に基づくカ
ラムとの性能を比較したもので、流速の変化による成分
ピークの拡がりをパリアンスσ２（μＱ２−）で示した
ものである。ここで、本発明の実施例で用いたカラムは
内径４閣、長さ５０ｍ＋であり、台座には貫通細孔径０
．４ｎｏ、開口角度１７０°、開口端径４！Ｉ１１のも
のを用いた。従来カラムは、内径４■、長さ４４■であ
る。フィルタには両者とも厚さ０．２１１１ｆｉのセラ
ミックフィルタを使用した。他の測定条件は両者とも第
６図の説明で前記した通りである。第９図から本発明の
実施例のものは従来のカラムに比較し、パリアンスを２
／３に減少せしめたことが明確である。この時の本発明
カラムのカラム効率は、−理論段当りのカラム長さくＨ
ＥＴＰ）で４．５　μｍとなり。

充填剤粒径に対して約２．３倍であった。これは、粒径
の２倍と言われている理論的限界に極めて近いものであ
る、一方、従来例のＨＥＴＰは約７゛μｍと充填剤粒径
の３．５倍であった。またピーク非対称性因子（ＡＦ）
は第１表に示すように約２倍に改善され、リーディング
及びテーリングもほとんど見られない、これによってピ
ークの尖鋭度も改善され、ピーク高さは従来の１．３倍
高くなる。

第　　１　　表 ここで表わすピーク非対称性因子とは第１０図に示すよ
うに、ピーク高さの１０％でのピーク幅を、ピークの頂
点からベースラインにおろした垂線が区分する長さＡ、
Ｂに分割し、それらの比を用いる。すなわち、非対称性
因子：ＡＦ＝Ｂ／Ａで表わされる。この非対称性因子は
完全に左右対称のピークのときＡＦ＝１となり、理想的
なピークの形状となる。

第９図の測定のために用いたカラムでの高速分離クロマ
トグラムの例を第１１図に示す、第１１図の（イ）は本
発明に基づくカラムにより（ロ）は従来のカラムによる
ものを示す、試料はベンゼン５１、ナフタレン５２．ア
ントラセン５３である。

また、移動相流速は１本発明の実施例が２．０ｍ　ｍ　
／分であり、従来例ではカラム効率の最も良い１．０ｍ
ｊｌ／分とした。他の測定条件については両者とも第６
図の説明で前記した通りである。

この時のカラム効率は従来カラムの理論段数（Ｎ）が６
２００段であるのに対し、本発明の実施例では理論段数
Ｎ＝１００００段を得ることができ。

同一カラム長さで比較すると従来の１．４倍の性能が得
ら九た。また、本発明の実施例では２ｍＡＺ分という高
流速側でもカラム効率がほとんど低下しない、このこと
からピーク間（ベンゼン５１とナフタレン５２）の分離
度Ｒｓは、本発明の実施例では流速２ｍＱ１分において
もＲｓ＝３．０であった。一方、従来カラムでは、同程
度の分離度を得るためには流速１ｍρ／分以上は流せず
。

約２倍の分析時間を要した０以上のことから１本発明に
よるカラムは、充填層以外での分離性能低下がほとんど
なく、充填層が持つ分離性能をそのま車発揮していると
考えられ、高速分離に適している。

ここで表す分離度とは、第１２図に示すように。

第２図のピーク１０２と第１のピーク１０１の保持時間
の差（ｔｔｔｚ　−ｔＲｘ　）を第１のピークと第２の
ピークのピーク幅（時間）の和（Ｗｓ　＋Ｗｚ　）で割
った値を２倍にして、すなわち１分離度：Ｒａ＝　２　
（ｔＲｚ　−ｔｙｕ　）　／　（Ｗｚ　＋Ｗｘ　）で求
められる。この分離度は大きい程ピーク間の分離が良い
ことになる。

第１３図は、第９図の測定で用いたカラムを使用して、
ジゴキシンを服用している患者の血清を分離した時のク
ロマトグラムを示す、（イ）は本発明カラムを示しく口
）は従来カラムを示す０分析条件を第２表に示す０本発
明の実施例では従来、例に比較して成分ピークのリーデ
ィング及びテーリングがなくなり、分離とピークの尖鋭
度が著しく改善されていることが明確である。また、こ
れにより分析対象成分の検出感度及び定量精度が向上し
、本カラムを使用した血清のクロマトグラフィーはジゴ
キシンのように安全域のきわめて狭い薬物による治療を
行う上でより有効であった。

第　　２　　表 成分名　Ｄｌ　：ジゴキシゲニンモノジギトキソサイド Ｄ３　：ジゴキシン ＤＴ３：ジギトキシン 上述したように、本発明を適用した実施例においては、
エンドフィッティングの構造上生じることの多かったデ
ッドボリウムを最小とし、かつ、送液管とクロマト管の
間に漏斗状貫通開口部を有する台座を設けることで流体
の乱れを防止できるので、充填層以外での試料成分のカ
ラム内拡がりを最小にできる。これにより、カラムは極
めて高い分離性能を発揮できるため、従来カラムでは分
離不十分な成分であっても、それを完全分離することが
可能になり、また溶離液の流量を２倍に増しても従来カ
ラムより性能が良いため、分析時間を半分にできるとい
う効果がある。さらに１分離性能の向上と関係して、ピ
ーク対称性が著しく改善され、従来起こりがちであった
リーディング及びテーリングもほとんど出現しなくなる
。そのため、ピーク尖鋭度が高くなり、定量精度及び検
出感度も向上するという効果がある。このことは。

本発明の実施例によるカラムを用いて、生体液中の薬物
及びその代謝産物の監視を行えば、薬物療法実施の際に
極めて正確な情報が得られることを意味する。

〔発明の効果〕

本発明によれば、送液管とクロマト管との接続部付近の
構成を改良したことによって、小粒径の充填剤を用いた
場合のカラム効率を効果的に引き出すことができるので
、液体クロマトグラフィーにおける定量精度を向上でき
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例に用いたクロマトグラフ用カ
ラムを示す部分切欠断面図、第２図は第１図の実施例に
おけるエンドフィッティングの状態を示す要部断面図、
第３図は第１図の実施例における剛体床の形状を示す断
面図、第４図は本発明の他の実施例を示す要部切欠断面
図、第５図は本発明に基づく分離カラムの性能評価に使
用した液体クロマトグラフの流路図、第６図は第１図の
実施例における剛体床の漏斗状開口部の開き角度による
パリアンス変化を示す図、第７図は同じく剛体床の細孔
の径によるパリアンス変化を示す図、第８図は同じく剛
体床の漏斗状開口部の開口端直径によるパリアンス変化
を示す図、第９図は本発明に基づくカラムと従来のカラ
ムについての移動相流量によるパリアンス変化を示す図
、第１０図はピークの非対称性因子を説明する図、第１
１図は本発明に基づくカラムと従来のカラムを用いた場
合のクロマトグラムを示す図、第１２図は分離度を説明
する図、第１３図は本発明に基づくカラムと従来のカラ
ムを用いた場合の血清試料のクロマトグラムを比較した
図である。 １・・・クロマト管、２・・・エンドシール、３．３’
・・・フィルタ、５・・・剛体床、８・・・接続用コネ
クタ、２４・・・漏斗状開口部、２５・・・溶離液、２
７・・・試料子１区 も２図 も３図 帛Ｉ＋図 寓Ｓ図 來６図　　　　　　束１図 ｆ’−１ｏ　Ｐｕｔ　（＊）　　　　　　　　　　　　
　　釉１し＊　ＲｊＴｈ　（ｍｍ）第８図 ；側１収開ロブｌＩ仝（Ｖ力うム＆） 荊１０図 （呆ＲＭ　間（Ｓｅｃ　） 高１ｚ図 （イ　） ０丁３ 体衿吟間（ｍｉｎ）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、充填剤を充填したクロマト管の端部に充填剤流出防
   止用フィルタを設け、上記クロマト管に向けて漏斗状に
   開口した剛体座を上記フィルタの外側に設け、上記フィ
   ルタおよび上記剛体座を被うように可塑性を有するシー
   ルを配置し、上記可塑性シールを上記クロマト管の方へ
   押さえつける送液管接続用接続部材を設けたことを特徴
   とする液体クロマトグラフ用カラム。