JPS63169998A - Ｎａｄｐｈの化学発光法による定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、化学発光法によるＮＡＤＰｌｌの定量法に関
する。

（従来の技術） グルタミン酸、グルコース−６−リン酸などは生体成分
として重要であり１例えば生化学的検査や病理学的研究
において血清や尿などの試料中のグルタミン酸、グルコ
ース−６−リン酸などをＮＡＤＰｌｌに変換し、このＮ
ＡＤＰｌｌを測定することにより、上記生体成分の定量
が広く行われている。ＮＡＡｌＩ３゜例えば、グルタミ
ン酸とＮＡ叶°とからグルタメートデヒドロゲナーゼの
働きにより、また、グルコース−６−リン酸とＮＡＤＰ
＋とからグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの働
きにより生成する。

Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｉ＋の定量は２通常、その物質が光照
射されたときに示す紫外部の吸収（３４０ｎｍ）を測定
することによりなされる。しかし、血清や尿などの試料
が濁度成分を含有する場合２例えば脂肪粒を含む血清で
あるような場合は、　　ＮＡＤＦ’１１が正確に測定さ
れにくい。ＮＡ口円１の紫外部の吸光度を測定する場合
の検出限界濃度は１０−’Ｍであり、感度が充分に高い
とはいえない。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明は、上記従来の欠点を解決するものであり、その
目的とするところは、試料中のＮＡＤＰｌｌを感度よく
、かつ節単に定量する方法を提供することにある。本発
明の他の目的は、化学発光法を用いてＮＡＤＰＨを定量
する方法を提供することにある。

（問題点を解決するための手段） 本発明方法は、旧黄色酵素を利用した化学発光法による
ＮＡＤＰＨの定量法であり、その手法は次の２種に大別
される。

本発明のＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈの定量法は、　　ＮＡＤＰ
ｌｌを含む試料に旧黄色酵素（ｏｌｄ　ｙｅｌｌｏｗ　
ｅｎｚｙｍｅ）を作用させ。

生成する過酸化水素を蓚酸ジエステルおよび螢光物質と
反応させ、生成する発光量を測定することを特徴とする
Ｎ　Ａ’Ｄ　Ｐ　１１の化学発光法による定量法である
。

本発明のＮＡＤＰｌｌの定量法は、　　Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ
　ＩＩを含む試料に旧黄色酵素（ｏｌｄ　ｙｅｌｌｏｗ
　ｅｎｚｙｍｅ）を作用させ。

生成する過酸化水素を酸化触媒の存在下で螢光物質前駆
体と反応させ、生成する螢光物質を酸イし触媒の阻害条
件下に蓚酸ジエステルおよび新たに加えた過酸化水素と
反応させ、生成する発光量を測定することを特徴とする
ＮＡＤＰＨの化学発光法による定量法である。

本発明の第１の方法は９次式により説明される。

１１□０□十蓚酸’ｉ　Ｎ　７５　Ｂ　＋螢光物質°ｈ
ν十螢光物質＋蓚酸シェフ、チル分解物　（２）この方
法により試料中のＮＡＤＰｌｌを定量するには。

例えば、まずＮＡＤＰｌｌを含む試料を適当な緩衝液で
希釈し、水系の試料溶液を？Ａ製する。これに旧黄色酵
素を加えて、酵素反応を行う。本発明におけるＮＡＤＰ
ｌｌを含む試料とは９血清または尿などの試料中に含ま
れる生体成分１例えばグルタミン酸。

グルコース−６−リン酸などから由来したＮＡＤＰｌｌ
を含む溶液を包含する。本発明に用いる旧黄色酵素（ｏ
ｌｄ　ｙｅｌｌｏｗ　ｅｎｚｙｍｅ）とは、別名ＮＡ叶
１１ジアホラーゼ、　　ＮＡＤＰＨ−フラビンレダクタ
ーゼであり。

Ｎ　Ａ　Ｄｒ　Ｉ＋脱水素酵素の一種である（Ｅ、　Ｃ
，１，６，９９゜■）。この酵素の存在下で、　　Ｎ　
Ａ　Ｄ　Ｐ　ＩＩは酸素と反応してＮＡＤＰ”と過酸化
水素を生成する（（１）式）。この酵素は１例えば、酵
母（Ｙｅａｓｔ）などが産生し　Ｅ。

ＩＩ　ａ　ａ　ｓらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ、２＋７１２〜７１９）に
より精製される。本発明において該酵素は　゛反応液約
１　ａｌｌあたり、１〜５００の濃度で使用される。酵
素反応時のｐｉは、６．５〜８．５が適当であり。

緩衝液としては２５〜１００ｍＭのリン酸緩衝液やトリ
ス緩衝液が好適に使用される。

次に、有機溶媒、好ましくは水と混合しうる有機溶媒（
例えばアセトニトリルなど）、蓚酸ジエステルおよび螢
光物質が上記酵素反応が終了した溶液に加えられる。蓚
酸ジエステルとしては、ビス（２，４，６−）リクロロ
フェニル）オキザレート（ＴＣＰＯトｌｌｌ＆する）、
ビス（２，４−ジニトロフェニル）オキザレートなどが
挙げられる。この蓚畔ジエステルの反応液中の濃度は、
０．１〜５０ｍＭである。上記螢光物質としては、フル
オレセイン、ペリレン。

８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸などが挙げら
れる。（１１式の反応によって生じた過酸化水素は、蓚
酸ジエステルと反応し、その結果、螢光物質は励起され
て発光する。発光後はもとの螢光物質に戻る。蓚酸ジエ
ステルは酸化されて分解し。

例えば、　ＴＣＰＯからは２．４．６−　）リクロロフ
ェノールが生成する。この（２）式の反応において生じ
た光を測定することによってＮＡＤＰｌｌの定量がなさ
れる。

光の一定は１通常の発光測定装置でなされ得る。

例えば、既知量のＮＡＤＰｌｌを用いて反応を行い、適
当なラグタイム（例えば１５秒間）の後、所定時間（例
えば１０秒間）の発光量を測定し、これを積分すると直
線性のよい検量線が得られる。光の測定は発光強度のピ
ーク値であってもよい。

本発明の第２の方法は１次式により説明される。

ｎｚｏｚ＋螢光物質前駆体 螢光物質＋蓚酸ジｔｘテ＋ｈ　＋ｕ□０□ｈシ＋螢光物
質十蓚酸シェス？Ｂ分解物（３）この方法における第１
段階の反応（（１）式）は。

前記第１の方法と同様である。ここで発生した過酸化水
素は（２）式において酸化触媒の存在下で螢光物質前駆
体と反応し、螢光物質を生じる。本発明に使用する螢光
物質前駆体とは、それ自体は螢光を発しない被酸化性の
物質であり、酸化を受けると変化して螢光を発するよう
になる化合物をさしていう。このような化合物としては
、ロイコフルオレセイン（フルオレシン）　、　　２’
、？’−ジクロロフルオレシンなどが挙げられる。螢光
物質前駆体は２反応液中にｏ、ｏｏｉ〜５ｍＭとなるよ
うに加えられる。このときにβ−シクロデキストリンが
存在すると螢光物質前駆体が自然酸化を受けることなく
安定化されるため好ましい。酸化触媒としては。

ペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ、ミエロペ
ルオキシダーゼ、ヘミン、ヘマチンなどが挙げられる。

このような酸化触媒の使用量は１通常１反応液約ｌ−あ
たり１〜１００ｕである。この（１１式および（２）式
の反応は、同一系内で同時に行われることが好ましい。

例えば、　　２’、７’−ジクロロフルオレシンジアセ
テートをアルカリ水溶液により脱アセチル化して螢光物
質前駆体である２゛、７“−ジクロロフルオレシンを調
製し、これに適当な緩衝液を加えてｐＨ６，５〜７．５
に調整する。緩衝液としては、２５〜１００ｍＭのリン
酸緩衝液やトリス緩衝液が使用される。螢光物質前駆体
を含む緩衝液に旧黄色酵素、酸化触媒および試料を加え
て３０℃前後で反応させると（２）式までの反応が完了
し、螢光物質前駆体は酸化されて螢光物質を生じる。こ
こまでは上記のように水系の溶媒中で行われる。（１１
式および（２）式の反応に関与する物質の添加順序には
特に制限はない。

次に有機溶媒系において（３）式の反応が行われる。

有機溶媒としては、前記第１の方法と同様に打機溶媒、
好ましくは水と混合しうる有機溶媒２例えばアセトニト
リルなどが用いられる。（２）式の反応が完了した系に
前記有機溶媒、蓚酸ジエステルおよび過酸化水素が加え
られる。有機溶媒中では酸化触媒２例えばペルオキシダ
ーゼなどは阻害される。蓚酸ジエステルとしては前記第
１の方法で使用される化合物がいずれも使用可能である
。過酸化水素は１通常、過酸化水素水として添加される
。

（３）式の反応の原理は第１の方法（２）式と同様であ
り。

ここでは新たに加えられた過酸化水素および蓚酸ジエス
テルが反応して、その結果、螢光物質が励起されて発光
する。この反応は有機溶媒系で行われるため、（２）式
の酸化触媒は失活し、そのため。

新たに加えられた過酸化水素と螢光物質前駆体とが反応
することはない。この（３）式の反応において生じた光
（ｈν）を測定することによりＮＡＤＰＨの定量がなさ
れる。光の測定には１通常の発光測定装置が用いられる
。例えば９発光ピークの強度を測定することにより精度
よく定量がなされる。既知濃度のＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　ＩＩ
を含む試料をこの第２の方法で測定するとＮ　Ａ　Ｄ　
Ｐ　Ｈｔａ度と発光強度のピーク値とは直線性を示す。

光の測定は所定時間の発光量の積分値を測定してもよい
。

（作用） 本発明によれば、旧黄色酵素をＮＡＤＰｌｌを含む試料
中のＮＡＤＰＨに作用させ、生じたＨ、０□を蓚酸ジエ
ステルを用いる化学発光法で測定することにより、該Ｎ
ＡＤＰ１１を定量することができる。化学発光による光
を測定するため、従来のＮＡＤＰＨの紫外部吸収を測定
する方法に比べて、血清または尿などの試料中の濁質成
分の影響を受けることなく高感度でＮＡＤＰｌｌを定量
できる。従来の紫外部吸収法によるＮＡＡｌ２Ｏ検出限
界濃度が１０−ｂＭであるのに対して９本法の検出限界
濃度は１０−’Ｍである。末法では、特別の装置を必要
とせず汎用の発光測定装置を使用するため、安価に定量
がなされる。本発明の方法を用いて、生体由来の試料（
例えば血液や尿）中のＮＡＧ円１を誘導する生体成分（
例えば。

グルタミン酸、グルコース−６−リン酸など）を定量す
ることも可能である。

（実施例） 以下に本発明を実施例により説明する。

去施皇よ ０、１Ｍリン酸緩衝液（ａｌ１７．０）　３．０ｍｌに
旧黄色酵素溶液（１０／ａｄ）　　１−を加え、２５℃
にて５分間加温した。これに既知量のＮＡＡｌ２Ｏ含有
する試料溶液１　ｍｌを加えて、さらに１５分間加温し
■２０２を発生させた。この反応液０　、５　ｍｌを発
光測定用バイアルに移し、これに、　Ｔｅｌ’Ｏを０．
１ｍＭの割合で、そして。

フルオレセインをｌμＨの割合で含有する溶液０．５ｍ
ｌを加えた。添加後１５秒を経てから反応液の発光を発
光測定装置で１０秒間にわたり測定した。ＮＡＤＰＨの
最終濃度が１０−８〜１０−　’Ｍとなるような上記試
料溶液を用いて、それぞれ測定を行なった。ＮＡＤＰＨ
濃度と発光量（積分値）との関係を第１図に示す。

第１　図カラＮＡＤＰＨ（７）終濃度１０−”−１０−
’ｌ’ｌ　（７）範囲において直線的な関係が得られ、
この範囲において定量が可能であることがわかる。

遍１殊ｌ　　　′ ２’、？’　　−ジクロロフルオレシンジアセテートの
エタノール溶液（５ｍｇ／　１０ｍ１’）　ＬＯｍｌに
０．ＯＩＮ　Ｎａ０１１水溶液４０−を加えて脱アセチ
ル化反応を行った。

これに１％のβ−シクロデキストリンを含有する２５ｍ
Ｍリン酸バッフｙ　−（ｐＨ７，０）　１５ＯＮ１を加
え、螢光物質前駆体を含む試薬（ＬＤＣＦ）溶液を得た
。このＬＤＣＦ溶液３　ｍｌに、旧黄色酵素およびペル
オキシダーゼをそれぞれ５Ｕ／ｍｌの濃度で含有する溶
液１　ｍｌを加えて、全容を４　ｍｌとした。これを３
０℃で５分間加温した後、既知量のＮＡＤ円１を含む試
料溶液１ｍｌを加えて３０℃にして１時間インキュベー
トして反応させた。ＬＤＣＦはペルオキシダーゼの存在
下で酸化され、螢光を発するジクロロフルオレセイン（
ＤＣＩ”）が反応液中に生成する。この反応液Ｑ、５ｍ
ｌを採取しバイアルに移し、さらに、　ＴＣＰＯを０．
１ｍＭの濃度で、そしてｌＩ２０□を０．４ｍＭの濃度
で含有するアセトニトリル溶液０．５−を加えた。反応
液の発光強度のピーク値を発光測定装置にて測定した。

上記ペルオキシダーゼ存在下の反応における反応液中の
Ｎへ叶Ｈ濃度をＮＡＤＰ１１終濃度とし、　　ＮＡＤＰ
Ｈ終濃度１０−’−１０−’Ｈの範囲で上記反応を行な
った。

ＮＡＤ円１終濃度と発光強度（ピーク値）との関係を第
２図に示す。第２図においては、　　ＮＡＤＰｌｌｊｌ
がＯ門の場合の値がブランクとして差し引かれている。

第２図カラ、　　ＮＡＤＰ！Ｉ？ａ度１０−”　〜１０
−’Ｍ　（７）範囲で直線的な関係が得られ、この範囲
において定量が可能であることがわかる。

（発明の効果） 本発明によれば、試料中のＮＡＤＰｌｌが濁質成分の影
Ｖを受けることなく高感度で定量される。末法によりＮ
＾ＤＰＨの定量、　　ＮＡＤｒ’１１を生じる生体成分
（グルタミン酸、グルコース−６−リン酸など）の定量
などが極めて効果的になされ得る。

４．８　のＰＪ゛なｊ′■ 第１図は２本発明方法により試料溶液中のＮＡＤＰＨを
測定したときのＮＡＤＰＨＦｉ度と発光ｆｆ１（積分値
）との関係を示すグラフ、そして第２図は本発明の方法
により試料溶液中のＮＡＤＰｌｌを測定したときのＮＡ
Ｄｒ’Ｈ濃度と発光強度との関係を示すグラフである。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ＮＡＤＰＨを含む試料に旧黄色酵素（ｏｌｄ　ｙｅ
   ｌｌｏｗ　ｅｎｚｙｍｅ）を作用させ、生成する過酸化
   水素を蓚酸ジエステルおよび螢光物質と反応させ、生成
   する発光量を測定することを特徴とするＮＡＤＰＨの化
   学発光法による定量法。 ２、ＮＡＤＰＨを含む試料に旧黄色酵素（ｏｌｄ　ｙｅ
   ｌｌｏｗ　ｅｎｚｙｍｅ）を作用させ、生成する過酸化
   水素を酸化触媒の存在下で螢光物質前駆体と反応させ、
   生成する螢光物質を酸化触媒の阻害条件下に蓚酸ジエス
   テルおよび新たに加えた過酸化水素と反応させ、生成す
   る発光量を測定することを特徴とするＮＡＤＰＨの化学
   発光法による定量法。