JPS63159326A - ネコ白血病ウイルスワクチン、およびそれに使用するウイルス材料の産生方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ウィルス性の抗原およびワクチンに関し、特
に、ネコ白血病ウィルスおよびウィルス性糖蛋白質抗原
を産生しうる、ネコ白血病ウィルス（以下、ＦｅＬＶと
略す。）により感染させた猫の細胞系に関するものであ
る。

〔発明の背景〕

ＦｅＬＶは、Ａ、ＢおよびＣの３つの型からなるレトロ
ウィルスである。ＦｅＬＶは、ウィルスの干渉および交
差中和により、初めて同定された。サーマ（Ｓａｒｍａ
）およびロッグ（Ｌｏｇ）、ヴアイロロジー（Ｖ汁ｏｌ
ｏｇｙ）　（１９７３年）旦、１６０〜１６９ページ；
ラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）およびジャレット（Ｊａｒ
ｒｅｔｔ）、インターナショナル・ジャーナル・オブ・
キャンサー（Ｉｎｔ’ｌ　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ）（１９
７８年）　２１，７６８〜７７８ページ、ジャレノ１−
．バーデイ（Ｈａｒｄｙ）等、ネコ白血病ウィルスーデ
ベロプメント・イン・キャンサー・リサーチ（Ｆｅｌｉ
ｎｅ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｖｉｒｕｓ−Ｄｅｖｅｌｏｐ
ｍｅｎｔｓ　１ｎＣａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　
４巻、４７３〜４７９ページ、出版人、エルゼフィール
・ノース・ホーランド・インコーホレイテッド（Ｅｌｓ
ｅｖｉｅｒ　Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏ１ｌａｎｄ　Ｉｎｃ、）
を参照。

また、ネコ白血病ウィルスは、ジャレットおよびラッセ
ル、Ｉｎｔ’ｌ　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　（１９７８年）
　２１，４６６〜４７２ページ；サーマ等、　ジャーナ
ル・オブ・ナショナル・キャンサー・インスティテユー
ト（Ｊ、Ｎａｔ’１Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、）（１９
７８年）並、８７１〜８７４ページ、ならびにシャルラ
ー（Ｓｃｈａｌｌｅｒ）およびオルセン（Ｑｌｓｅｎ）
、インフェクション・イミユニティ（Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｉｍｍｕｎ、）（１９７５年）肥、１４０５〜１５１０
ページにおいて論じられている。

ＦｅＬＶは、猫に感染しやすい。それは、リンパ促進性
（ｌｙａ＋ｐｈｏｐｌａｓｔｉｃ）若しくは再生不良性
貧血、骨髄抑圧（ｍｙｅｌｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）
、胸腺萎縮、血小板減少症、ならびに生殖不全（例えば
、堕胎、胎児吸収、死産）を含む多くの病気の原因とな
る。リンパ肉腫のようなＦｅＬＶ感染に係る腫瘍性発現
は、ＦｅＬＶに起因する罹病率および死亡率の僅かな部
分を占めるに過ぎない。しかし、猫におけるＦｅＬＶ感
染は、免疫系を抑圧する原因をつくるため、動物が、い
ろいろな微生物による日和見感染にさらされる。

ＦｅＬＶに対して、ワクチンが開発されてきた。

例えば、オルセン（Ｏｌｓｅｎ）による米国特許第４．
３３２，７９３号、ピーダーセン（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ）
等による米国特許第４　、２６４　、５８７号、ジャレ
ット（Ｊａｒｒｅｔｔ）等による米国特許第４，１１７
，１１２号、ジャレット等による同第４，０８６，１３
４号、ジャレット等による同第４，０３４，０８１号、
　およびジャレット等による同第３，９６６．９０７号
の各明細書、ならびにグラスゴ（Ｇｌａｓｇｏｗ）大学
によるベルギー国特許公開公報第Ｒ６４４１７ＤＧ号を
参照。

特に、ＦｅＬＶワクチンは、失活させたＦｅ１ｊ／ウイ
ルスからか、またエンベロープの糖蛋白質（ｇｐ７０）
から調製される。感染防御抗体は、抗原と反応する必要
があると考えられる。このようなウィルス性材料は、感
染した猫の細胞系を培養することによりつくられるが、
特殊な猫の細胞系が、　ＦｅＬＶワクチンを量産する際
十分に使用しうる量で、良質のウィルス性材料を産生ず
るかどうかを予測することは不可能である。更に、Ｆｅ
ＬＶの一定の細胞株に対するウィルス材料を十分に産生
ずる細胞系は、他の細胞株に対する適切な保護をなし得
なかったり、また、別の理由でワクチン作成中に効力を
持たないウィルス材料をつくることがある。

従って、量産的に使用しうるＦｅＬＶワクチンをっくる
際に用いることができるＦｅＬＶウィルス材料を製造す
るための新しい方法を開発する必要がある。

また、ＦｅＬＶウィルス材料は、診断試薬の調製にも使
用できるため、それを製造するための新しい細胞系も、
開発が切望されている。

（発明の要約） 本発明によると、ＦｅＬＶワクチンをつくるのに十分な
量で、ＦｅＬＶウィルスを産生しうる、ＦｅＬＶのリッ
カード（Ｒｉｃｋａｒｄ）分離物、即ちＦ１３ＬＶ−Ａ
Ｒ□により感染したクランデル・ネコ腎ｙａ（Ｃｒａｎ
ｄｅｌｌ　Ｆｅ１ｉｎｃに１ｄｎｅｙ）　（ＣＲＦＫと
略す）細胞が提供される。

また本発明によると、ＣＲＦＫ細胞を、ＦｅＬＶ−ＡＨ
□のようなＦｅＬＶウィルスで感染させる段階、感染し
たＣＲＦＫ細胞を培養する段階、およびウィルス材料を
回収する段階からなるＦｅＬＶウィルス材料の産生方法
が提供される。

更に、本発明によると、このようにして調製されたウィ
ルス材料からつくられるＦｅＬＶワクチンが提供される
。

本発明によるＦｅＬＶ感染クランデル細胞系は、効飽性
あるＦｅＬＶワクチンに使用される高力価のＦｅＬＶを
安定的に産生ずる。特に、それは、通常の猫の胚細胞よ
りもＩＯ乃至１００倍高い力価のｇｐ７０を産生ずる。

（本発明の詳細な説明） 本発明において使用した猫の細胞系は、アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション（Ａａ＋ｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）（
ＡＴＣＣ，ＣＣＬ９４）から入手したＣＲＦＫ系である
。ＣＲＦＫ細胞については、クランデル（Ｃｒａｎｄｅ
ｌｌ）等、インヒドロ（Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ）（１９７３
年）　９．１７６〜１８５ページに記載されている。

ＣＲＦＫ細胞系を、ＦｅＬＶのリッカード（Ｒｉｃｋａ
ｒｄ）分離物、冷ちＦｅＬＶ−ＡＲｘで感染させる。培
養すると直ぐ、感染細胞系（ＡＣＦＬと略す）は、慢性
的な感染状態になり、１ｍｌ当り、少なくとも１０”〜
１０７のフォーカスを形成する速さで、ウィルス材料を
産生ずる。

細胞によりつくられるＦｅＬＶウィルスは、１乃至３週
間で、１０３ＦＦＵ／社（１ｍＭ当りのフォーカス形成
ユニット）、好ましくは１０３ＦＦＵ／＋ｍＱという力
価を、それから後は、少なくとも２Ｘ１０３ＦＦＵ／ｍ
Ｑ、好ましくは３　Ｘ　１０３ＦＦＵ／社の力価を表わ
す。

別のりッカード分離物、即ちＦｅＬＶ−ＡＲｚで感染さ
せた場合、ＣＲＦＫ細胞は、ウィルス材料をあまり産生
せず、つくられたウィルス材料は、ワクチン剤としての
効能性が低かった。

同様に、別のＦｅＬＶ−ＡＲ工感染細胞系、つまり、Ｆ
ｅＬＶのサーマ（Ｓａｒｍａ）細胞株で感染させた際、
ウィルス材料を十分に産生しうるＡＫ−ＤＩ胞からつく
られるウィルス材料は、ワクチンを調製するのに好適で
あった。

ＡＣＦＬにより産生されるウィルス材料は、本発明の範
囲内で、さまざまなワクチンをつくるのに使用できる。

ウィルス材料は、猫に対するビルレントであり、ワクチ
ンを調製する前に失活させなければならない。

ウィルス材料は、免疫原性を維持させうる通常の方法に
より失活させることができる。失活方法は、この分野で
公知になっている。

公知であり、かつここで使用される失活方法は、熱、ホ
ルマリン、２成分エチレンイミン（ＢＥＩ）、オゾン、
およびソーラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）を含んでいる。

米国特許第４，３３２，７９３号、同第４　、２６４　
、５８７号、同第４，１１７，１１２号、同第４　、０
３４　、０８１号および同第３．９！１６，９０７号各
明細書を参照。

ソーラレンによる失活法を用いるのが好ましい。

この方法において、生ウィルスは、適切な媒体中でソー
ラレンと結合される。ソーラレンの量は、長波長の紫外
線照射を行なって、ウィルスをほぼ゛完全に失活させる
のに十分な量でなければならない。米国特許第４，５４
５，９８７号明細書を参照。

ワクチンは、生理学的に使用しうるキャリヤー、例えば
、脱イオン水、リン酸緩衝溶液、生理的食塩水などのよ
うな不活性キャリヤーを含みうる。

このキャリヤーはまた、鉱油、植物油、無機塩のような
生理的に使用しうるアジュバント、またはムラミルジペ
プチドのような免疫強化剤を含みうる。このようなキャ
リヤーおよびアジュバントは、この技術分野でよく知ら
れている。

ワクチン調整時のウィルスの濃度は、感染細胞から雌さ
れるか、あるいはその内部のままのいずれかにしても、
約１０２乃至１０３ＦＦＵ／ｍＱとする。必要に応じ、
ウィルスは、市販の機器を用いて適宜濃縮される。

全投与量は、少なくとも約１０２ＦＦＵ／量、通常、少
なくとも約１０３ＦＦＵ／量とする。一般に、約１０″
ＦＦＵ／　ｆｆｌを超えることはできない。

通常、特定部位における投与は、約０．１〜４ｍＱの範
囲の量で行なわれ、その際、全投与量は、０．５〜８ａ
＋Ｉｌの範囲とする。注射の回数、およびその時間間隔
は、いろいろ変えられるが、通常、１乃至３週間の間隔
をおいて、１乃至３回行なうのが効果的である。

ワクチンは、皮下注射、筋肉内注射、または腹腔的注射
より投与される。

調製したワクチンは、１回分の容量を有し、かつ皮下注
射針を挿入する中隔を備える瓶の中に詰められる。

（実施例） 以下、本発明を、好適実施例に基づき説明する。

これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではな
く、当業者が、本発明を容易に実施しうる程度に説明し
たまでに過ぎない。

失凰糺よ Ｆ　ｅ　１．　Ｖウィルスおよびｇｐ７０の産生を、（
１）ＦｅＬＶ−ＡＲＩ感染ＣＩ’ｌＦＫ細胞、（２）Ｆ
ｅＬＶ−ＡＲｚ感染ＣＲＦＫ細胞、および（３）ＦｅＬ
Ｖ−ＡＲｘ感染ＡＫ−Ｄ細胞を用い、次の要領で比較し
た。

墓象Ｕ圭ｙ塵亙 ＣＲＦＫ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ９４）を約５Ｘ１０”細
胞密度で１２ｍＱのＭＥＮ、ｓＦ’、増殖培地における
７５ａＪ組織培養フラスコに接種し、３７℃にて一晩培
養した（ＭＥＮ、ｓＦｉ。

は、アール（Ｅａｒｌｅ″Ｓ）の塩と、熱により失活し
た５％のウシ胎児血清を加えた非必須アミノ酸とを含む
イーグルの基礎培地である）。

接種してから２０時間後に、増殖培地を、細胞単層から
取り除いてから、２■Ｑのオーバーレイ培地（２５μｇ
／ｍ１２のＤＥＡＥデキストランを含むＭＥＮ）を加え
た。次に、細胞を、３７℃にて１時間培養した。培養後
、オーバーレイ培地を取り除いてから、細胞単層を、１
回につき１０＋ＱのＭＥＮ、ｓＦｌ、を用いて、２回洗
浄した。

次に、約２．５　Ｘ　１０３ＦＦＵ／ｍＱの力価を有す
る２ｄのＦｅＬＶ−ＡＲ□を用いて、細胞単層を覆った
。３７℃にて。

２時間、ウィルスを吸着させた。感染の多種後（ＭＯＩ
）は、０．Ｏｌであった。

２時間の吸着に引き続き、細胞に１２＋ｍｆｌのＭＥＮ
、ｓＦｌ、増殖培地を施してから、３７℃にて培養した
＊　ＦｅＬＶ−ＡＲｘにより感染させたＣＲＦＫ細胞の
最初のフラスコを、０−ＡＣＦＬと名付けた。

最初の感染後、３０の間隔で培地をかえた。集密状態は
、最初の感染後７日日、つまり、７ボスト感染日（ｐ、
ｉ、と略す）に達成し、その時点で、新しいフラスコに
おいて、１：１０の分割比にて、細胞の継代培養を行な
った。

これと同じ操作を、７目間隔で５週間行なった。

そのフラスコを、次つぎに、　１−ＡＣＦＬ、２−　Ａ
　ＣＦ　＋−などというふうに名付けた。

ＦｅＬＶ−ＡＲ□感染ＣＲＦＫ細胞に対して以上述べて
きたと同じ方法を用いて、ＣＲＦＫ細胞をＦｅＬＶＪＲ
ｚで、またＡＫ−Ｄ細胞をＦｅＬＶ−ＡＲｍで、それぞ
れ感染させた。

７目間隔のポスト感染（ｐ、ｉ、）において、ＦｅＬＶ
−Ａを含んでいる培地のサンプルを取り出した。サンプ
ルについて、力価を測定し、かつ表１に示す結果ととも
に後段で説明するように、ｐ２７に対する分析を行ない
、それにより、細胞系が長期にわたって感染されている
ことを確認した。

ウィルス材ｔの口暖 集密状態において、第５継代のＡＣＦＬ細胞（５−ＡＣ
ＦＬ）の入った１０本の回転瓶それぞれに、２５０ｔＱ
のＭＥＮｓｓＦ１５を加えた。７２時間後、上澄み部を
採り。

プールし、かつ１０％のＤＭＳＯを用いて凍結させてか
ら、−８５℃にて貯蔵した。

新鮮な培地を１回転瓶に加え、１４４時間して。

上澄み部を再び採り、プールしてから、凍結させた。

採取物を解凍し、プールしてから、ミリポアー・コーポ
レイション（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉ
ｏｎ）製ペリコン（Ｐｃ１１ｉｃｏｎ）限外濾過カセッ
ト（１００，０００分子量排除）を用い、　１０倍に濃
縮し、最終容量を５００＋ｎＱにした。

同じ操作により、第５継代のＦｅＬＶ−ＡＲ２感染ＣＲ
ＦＫ細胞（５−ＣＲＦＫ）から採ったウィルスを濃縮し
た。

ｐｅＬＶ−Ａ１２ｍ感染ＡＫ−Ｄ細胞により産生された
ウィルス材料は、回収できなかった。その理由は、ウィ
ルス材料の産生量があまりに少なく、ワクチンを調製し
うるような量ではなかったためである。

５−ＡＣＦＬおよび５−ＣＲＦＫａ胞系カラ採ッタプー
ルシ、かつ濃縮したウィルス材料について、力価を測定
し、かつ後段で説明するようにｐ２７に対する分析を行
なった。また、それらについて、ｇｐ７０に対する分析
を行ない、かつ、後段で説明する逆転写酵素活性に対す
るテストを行なった。

ウィルス；定：フォーカスＱ収旦；ットの収標準のテス
ト細胞（クローン８１）を、増殖培地（マツコイ（Ｍｃ
Ｃｏｙ’　５）５Ａ　＋　１５％熱失活化ウシつ児血清
）の入った、１皿当り、２ＸｌＯ’細胞の割合で、６ｃ
ｍプラスチックペトリ皿の中へまき、湿度調節されたＣ
Ｏ□インキュベーター中で培養した。約２０分後、培地
を取り出し、増殖培地における１ｍ１ｌのＤＥＡＥデキ
ストラン（２５μｇ１０Ｑ）を、容器に加えた。

次に、細胞を３７℃にて培養した。３０分間、　ＤＨＡ
Ｅデキストラン培地を取り出してから、容器を、２■Ｑ
の増殖培地を用いて１回洗浄した。

皿当り０．２〜１．０−のウィルス接種物を加え、その
皿を、時々振盪させながら、３７℃にて３０分間培養し
てから、容器に対し、５ｍＭの増殖培地を加えた。３ポ
スト感染（３ｐ、ｉ、）日に、３■Ｑの増殖培地を加え
たｅ　７ｐ−１−口に、−切の増殖培地を取り除き、５
ｓ＋Ｉ２の新鮮な増殖培地と取り換えた＊　１０ｐ、ｉ
。

日に、３ｍＭの新鮮な増殖培地を加えた。

１２ｐ、ｉ、日に、フォーカスが読み取れた。フォーカ
スは、直径が０．５〜２＋ｓｍあり、かつ密な単層上で
、重なり合い、小さく黒ずんだ丸い細胞から構成されて
いた単層の退縮は、フォーカス領域中に全く生じなかっ
た。

この方法に関する詳しいことは、フィンシンガー　（Ｆ
ｉｓｃｈｉｎｇｅｒ）等、ジャーナル・オブ・ヴイロロ
ジー（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）（１９７４年）１４．１７７
〜１７９ページに記載されている。

鄭１ヱノ１＜ 感染培地からの上澄み部を、製造者が詳しく述べている
手順に基づき、　ＥＬＩＳＡ（リュークアッセイ＊　Ｆ
　（Ｌｅｕｋａｓｓａｙ＊Ｆ）、ピットマン・ムーア（
ＰｉｔｍａｎＭｏｏｒｅ）から市販されている。）によ
り、抗原に特異的なＦｅＬＶグループ（ｐ２７）に対す
る分析を行なった。

７０アツセイ 感染培地からの上澄み部を、間接的ＥＬＩＳＡにより、
ＦｅＬＶ　ｇＰ７０に対する分析を行なった。山羊の抗
ＦｅＬＶ　ｇｐ７０ポリクローナル抗体（ＮＣＩ貯蔵所
）でコートしたマイクロ滴定平板を、捕捉用固相として
使用した。平板に結合したウィルスを検出するために使
用した抗体は、マウスの抗Ｆｅｌ、Ｖ　ｇｐ７０（ＡＧ
ＲＩ）であった。

２次抗体は、山羊のペルオキシダーゼ接合型抗マウス免
疫グロブリン（ベーリンガー・マンハイム・バイオケミ
カルズ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂ
ｉｏ−ｃｈｅ■１ｃａｌｓ））であった。使用した基質
は、クエン酸バッファーにおけるテトラメチルベンジン
であつた・ ｇｐ７０の定量を、精製ウィルスの標準サンプルとの比
較に基づいて行なった。標準のウィルスのサンプルは、
標準法を用い、超遠心機における沈降速度により生ずる
、予め形成された１５〜６０％の直線スクロース勾配に
おけるピリオンを集めて調製した。

テスト用および標準用サンプルは、段階的に希釈し、［
ＥＬＩＳＡにより分析した。各希釈時点の光学密度（Ｏ
Ｄ）を測定した。テストサンプルの標準ウィルスに対す
る力価は、テストサンプルの最大光学密度の５０％にて
算定した。

゛転−−アッセイ 細胞培養の上澄み部について、次の要領で、逆転写酵素
活性に対するテストを行なった。

細胞培養上澄み部の各５０μＱアリコートに対し、５０
μｇの２ｘカクテルを加えた。　　２Ｘカクテルとは、
脱イオン水中に、８０ｍＭのトリス１ｌＣＱ（ｐＨ８，
２）、１２０ｍＭのに（４，１，２ａ＋Ｍの酢酸マンガ
ン、　　１０ｎ、ｓ、ポリ−Ａ、０．０１０ＤＺＧｌ＋
オリゴ−ｄＴｌ、〜１□０．１　ｍＭのＴＴＰ、０．４
％ＮＰ−４０，３，Ｏｎ＋Ｈのジチオトレイトール、０
．１　μＣｉ／μＱの３１１−ＴＴＩ’を含んでいるも
のである。混合物を、３７℃にて、３０分間培養し、そ
こで１反応を止めてから、容管に、０．２＋ｏＱの０．
１Ｍポリリン酸ナトリウムおよび０，３ｍｆｌの２０％
低温三塩化酢酸（ＴＣＡ）を加えて、　ＤＮＡを沈澱さ
せた。

次に、管を、０℃にて３０分間培養した。サンプルを、
２．４ｃ＋＋＋ホワツトマン（Ｉｉｌｈａｔ＋＋＋ａｎ
）ＧＦ／Ａフィルター上に集めた。フィルターを、５％
低温ＴＣＡを用いて２回、引続き１００％低温エタノー
ルを用いて洗浄しながら、乾燥させた。

ベックマン・インストルメンツ（ｎｅｃｋｍａｎ　Ｉｎ
５ｔｒｕ−鵬ｅｎｔｓ）のＬＳ−１８００型シンチレー
シヨンカウンターを用い、７ｍ１１のシンチレーション
流体中で、特異的ウィルスＤＮＡの放射能を計数した。

藍−求 滴定および各種分析の結果を、表１に示す。

表から分かるように、ＡＣＦＬ系は、感染後直ちに。

高力価のウィルスを産生じ、かつ、ＦｅＬＶ−ＡＲｚで
感染させたＣＲＦＫ細胞、またはＦｅＬＶ−ＡＲ工て感
染させたＡＫ−Ｄ細胞よりも高い持続性をもって、ウィ
ルスおよびウィルス抗原を産生じ続けた。

感染したＡに−Ｄ細胞は、ワクチン製造に使用しうる程
度十分に高い力価のウィルスを産生じなかった。この結
果、Ａに一〇細胞が、実験的ワクチンを調製するのに十
分な量のＦｅＬＶ−Ａのサーマ（Ｓａｒｍａ）株をうま
く産生ずるために使われてきただけに、予想外であった
。

大庭員Ｉ 第８継代の慢性的に感染したＡＣＦＬ細胞と、第７代納
代の慢性的に感染した正常ネコ胚細胞とにおけるＦｅＬ
Ｖ−ＡＲ□ウィルス材料の産生を比較した。感染、培養
１滴定、および分析を、実施例１に記載した要領で行な
った。

結果を１表２に示す。

表から分かるように、　ＡＣＦＬ系は、同じウィルス分
離物によって感染させた正常ネコ胚細胞よりも多くのウ
ィルスおよびｇρ７０ウィルス抗原を産生じた。

ス】１１走 ＡＣＦＬおよびＦｅＬＶ−＾Ｒ２で感染したＣＲＦＫ細
胞系から得られたワクチン製剤の有効性を、次の要領で
比較した。

ワクチン製赳 第１のワクチン製剤を、実施例１のＡＣＦＬ細胞により
産生され、プールされ、かつ濃縮されたウィルス材料か
ら調製した。濃縮ウィルスは、室温で約４８時間、０．
２％ホルマリンによる失活を行ない調製した。ワクチン
は、浮遊ウィルスを約１０３ＦＦＵ含み、かつ水中油滴
アジュバントを１：１の比で含んでいた。

第２のワクチン製剤を、実施例１のＦｅＬＶ−ＡＲｚ感
染ＣＲＦＫ細胞により産生され、プールされかつ濃縮さ
れたウィルスから、同じ要領で調製した。それは、約２
．４Ｘ１０３ＦＦＵのウィルスを含んでいた。

主ユ且蔓権軌立 生まれてから１４乃至１５５日目雄９匹およびｌｌ１Ｉ
！９匹からなる１８匹の猫（最小の病気猫、リバーティ
・ラプス（Ｌｉｂｅｒｔｙ　Ｌａｂｓ）、リバーティ・
コーナー（Ｌｉｂｅｒｔｙ　Ｃｏｒｎｅｒ）、ニューシ
ャーシー州）を、各６匹ずつ、３つのグループに分けた
。

グループ■および■に、第１および第２のワクチン製剤
をそれぞれ１１Ｑづつ、３週間の間をあけ、筋肉内注射
による接種を行なった。グループ■の猫は、ワクチンを
接種しない対照とした。２次接種後２週間目に、すべて
の猫に１０３　ＦＦＬＩの生ＦｅＬＶ−ＡＲｔを用いて
、０鼻的に誘発投与を行なった。

週ごとに、血液サンプルを採った。サンプルについて、
上で述べたｐ２７　ＥＬＩＳＡ法により、また。

次に述べる間接免疫蛍光法により、ＦｅＬＶ抗原に対す
る分析を行なった。更に、後段で述べるウィルス分離プ
ロトコルにより、サンプルをテストした。

九反貫洸」１工■ｕ ワクチンを接種した猫からとった血液塗抹標本について
１間接免疫蛍光法により、血液細胞におけるＦｅＬＶ抗
原の有無に対するテストを行なった。

第１の抗体は、山羊の抗ＦｅＬＶｐ２７　（ＮＣＩ貯蔵
所）であり、第２の抗体は、兎のフルオレセイン接合型
抗山羊ＩｇＧ　（クーパー・バイオメディカル（Ｃｏｏ
ｐｅｒＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ）／カッペル・ラボラトリ
ーズ（ＣａｐｐｅｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　）と
した。スライドは、エピフルオレッセンス用の装置がつ
いたツアイス（Ｚｅｉｓｓ）の写真用顕微鏡を用いて調
べた。

ブイ〃ノ」ｌ七すしヒジ火 猫は、離しておいた。血液サンプルは、無菌状態にして
集めた。血清を遠心分離によって分離し、０．２μｍの
フィルター・ディスク（例えば、ゲルマン・アクロディ
スクス（Ｇｅｌ＠ａｎ　Ａｃｒｏｄｉｓｃｓ））　を通
して濾過した。

リンパ球は、１〜１　、５ｍｍのＥＤＴＡで処理した血
液を１〜１　、５＠ｆｌのリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で
希釈し、その懸濁液を２．５＠ｆｌのフィコール・ペイ
ク（ＦｉｃｏｌｌＰａｑｕｅ）　（ファーマシア（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ）社の商品名）の上に層状に入れ、かつ
管をａｏｏ　ｘ　ｇにて３０分間遠心分離させる密度勾
配遠心法により分離した。界面のところに集められた細
胞を採り、　　ＰＢＳを用いて１回洗浄した。リンパ球
を、０．２ｍｍの同原血清中に懸濁させた。

１５％熱失活化ウシつ児血清、および抗生物質（１００
ユニツト／ｌｌＱのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｆ
ｌのストレプトマイシン）を加えたＦ１２に培地中で、
ＡＫ−Ｄネコ肺細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ１５０）を増殖さ
せることによって、細胞培養指示薬を調製した。

トリプシン処理により、ＡＫ−Ｄ細胞を採収した。

約５Ｘ１０ｓの細胞を、４ｍｍの培地が入った２５ｃＪ
の各フラスコの中に接種した。培養物を、５％のＣＯ□
とともに１日間、３７℃にて培養した。培地を取り除き
、再懸濁したリンパ球（０，２ｍｍりを、ＡＫ−Ｄ細胞
の単層上に接種した。

対照培養物を、　　ＰＢＳとともに接種した。接種物を
、１時間吸着させてから、５社の培地を加えた。

次の日に培地を取りかえた。その後、細胞を、５％の０
０２とともに３７℃にて培養し、３日目または４日目に
栄養を補給し、かつ７日目に継代培養を行なった。

ＦｅＬＶ　ｐ２７抗原分析のため、補給（３・〜５５日
目後接種）前と、また３〜５日目の継代培養前に、細胞
培養の上澄み部を集めた。次に、この集めた上澄み部に
ついて、製造者が詳しく述べている手順に基づきＥＬＩ
ＳＡ法（リュークアッセイ＊Ｆ、ピットマン・ムーア（
前出））により、　ＦｅＬＶ　ｐ２７の有無に対するテ
ストを行なった。

２つの共役活性を与えた培養物を、「正のウィルス分離
」と見做し、かつ、６週間、負の状態になっている培養
物を、「負のウィルス分離」と見做した。

このプロトコルの妥当性を確認するため、実施例１で既
に述べたウィルスのクローン−８１分析を用い、感染性
レトロウィルスの有無に対するテストを、上澄み部につ
いて行なった。

輩−米 誘発後１１週間目において、ＩＦＡ測定若しくはｐ２７
ＥＬＩＳＡ測定の結果、　グループＩの猫には、ウィル
スは存在していなかった。それに対ル、両方による測定
の結果、グループ■の猫６匹中４匹、およびグループ■
の猫６匹中５匹には、ウィルスが存在していた。

誘発後５週目において、グループ■の猫６匹中５匹、お
よびグループ■の猫６匹中６匹は、正のウィルス分離を
示し、また、グループ■の猫６匹には、正のウィルス分
離を示したものはなかった。

誘発前の日に、ＥＬＩＳＡ法により陽性であった２匹の
猫の血液から、ウィルスは分層されなかった。

ウィルス分離は、一般に、　　ＥＬＩＳＡ法より鋭敏な
試験法であるので、ＥＬＩＳＡ法による結果は１間違い
であると見做すことができる。また、ＣＲＦＫ細胞にお
いて増殖されるＦｅＬＶ−＾Ｒ２から産生されるワクチ
ンの不全が、有効投与量のせいであるのか、抗原の特性
に帰せしめうるのか、あるいは他の要因によるのかどう
なのかについては、分かっていない。

要約すれば、慢性的に感染させたＡＣＦＬ系は、調べら
れている他の細胞系−分離ウイルス組合せ物よりも多く
のウィルス、およびｇｐ７０ウィルス抗原を産生じた。

異なる分離体により感染したＣＲＦＫ細胞からのウィル
スは、有効なワクチンをつくらなかった。

ＡＣＦＬ系は、高力価のＦｅＬＶウィルスを産生させる
ものとして優れており、かつ産生されたウィルスは、ワ
クチンをつくる際に有用である。また、ＡＣＦＬウィル
スは、診断薬をつくるのに使用することができる。

以上の結果を、表３にまとめて示す。

本明細書において引用した文献は、本発明の技術分野に
関係している技術者のレベルにおけるものを提示した。

各文献は、それらが、個々に参考とされているように、
本明細書では、同じ場所で、また同じ内容に対する参考
として挙げである。

当業者であれば、特許請求の範囲に記載の精神から逸脱
することなく、本明細書に記載した実施例に種々の変形
変更を行なって、本発明を実施しうろことに思い至る筈
である。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）ネコ白血病ウィルス（ＦｅＬＶ）のリッカード分
   離物（以下、ＦｅＬＶ−Ａ＿Ｒ＿＿１と略す。）により
   感染させたクランデル・ネコ腎臓（以下、ＣＲＦＫと略
   す。）細胞。
2. （２）ＣＲＦＫ細胞が、１ｍｌ当り、少なくとも１０＾
   ３のフォーカス形成ユニットでウィルス材料を産生しう
   るものであることを特徴とする特許請求の範囲第（１）
   項に記載のＣＲＦＫ細胞。
3. （３）ＦｅＬＶなるウィルス材料の産生方法において、
   細胞培養培地で、ＦｅＬＶ−Ａ＿Ｒ＿＿１感染ＣＲＦＫ
   細胞を培養する段階と、 前記培地から、ウィルス材料を回収する段階とからなる
   ことを特徴とするＦｅＬＶウィルス材料の産生方法。
4. （４）ウィルス材料が、ＦｅＬＶ−Ａ＿Ｒ＿＿１または
   ｇｐ７０であることを特徴とする特許請求の範囲第（３
   ）項に記載のＦｅＬＶウィルス材料の産生方法。
5. （５）ＦｅＬＶ−Ａ＿Ｒ＿＿１で感染させたＣＲＦＫに
   より産生される失活化ウィルス材料、および製薬的に使
   用しうるキャリヤー若しくは免疫学的アジュバントから
   なることを特徴とするＦｅＬＶワクチン。
6. （６）失活化ウィルス材料が、失活したＦｅＬＶ−Ａ＿
   Ｒ＿＿１またはｇｐ７０であることを特徴とする特許請
   求の範囲第（５）項に記載のＦｅＬＶワクチン。
7. （７）失活化ＦｅＬＶウィルス１ｍｌ当り、約１０＾２
   乃至約１０＾９のフォーカス形成ユニットからなること
   を特徴とする特許請求の範囲第（５）項に記載のＦｅＬ
   Ｖワクチン。