JPS63157979A - 新規化合物、その製法及びそれを含む医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は修飾された線維素溶解酵素、特に修飾されたウ
ロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、その製法、
それを含有する薬剤組成物および血栓症の治療における
その用途に関する。

（従来の技術） 一本鎖および二本鎖の形の酵素ウロキナーゼ型プラスミ
ノーゲン活性化因子（以後ｕ−ＰＡと略す）を構成する
アミノ酸配列〔バーストレート（Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ
、Ｍ、　）およびコレｙ　（Ｃｏｌｌｅｎ、Ｄ、ＬＢｌ
ｏｏｄ、　６７、１５２９（１９８６）を参照〕、なら
びにヒトｕ−ＰＡをコードするｅ　ＤＮＡのヌクレオチ
ド配列□〔ホルムズ（Ｈｏ　Ｉｍｅ　ｓ　、Ｗ、Ｅ、　
）ら、Ｂｉｏ／ｌｅｃｈｎｏｌｏｇＬ旦、９２３〜９２
９（１９８５）を参照〕は知られている。ウロキナーゼ
型プラスミノーゲン活性化因子は線維素溶解作用をもつ
ことがわかっている。

ｕ−ＰＡ酵素の一部はヒトおよびネズミの上皮成長因子
との構造的相同性を示すことが見出された〔バニアイ（
Ｂａｎｙａｉ、Ｌ、）ら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、、　１
６３゜３７（１９８３）を参照〕。アミノ酸残基５〜４
９のこの領域は６成長因子ドメイン”と呼ばれた。この
ドメインの主要部分の残基】０〜４４をコードし且つ残
基９および４５を一部コードする遺伝情報は単一のエク
ソン上に存在する〔リッチオ（Ｒｉｃｃｉｏ＋Ａ、）ら
、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｄ、、　１３．２７５９
〜２７７１（１９８５）を参照〕。この領域内に次の３
個のアミノ酸から成る配列が存在するニ ー　ｔｙｒ　−ｐｈｅ　−ｓｅｒ　− 位置　　２４　　２５　　２６ （発明の構成） 本発明者らは今や線維未溶解作用を保持する修飾された
形のｕ　−Ｐ　Ａ　＃紫を同定した。

本発明によれば、成長因子ドメインの領域において修飾
された、線繊素溶解作用を有するウロキナーゼ型プラス
ミノーゲン活性化因子が提供される。

適当な修飾にはいくつかのアミノ酸残基の除去または欠
失、もしくは１個またはそれ以上のアミノ酸残基と異な
るアミノ酸残基との置換が含まれる。

１つの好適な面において、修飾は成長因子ドメインの全
部または一部の欠失から成る。

他の好適な面において、ｕ−ＰＡはアミノ酸残基Ｊ１〜
４５の領域が、とりわけその領域の欠失により、修飾さ
れる。

さらに別の好適な面において、ｕ−ＦＡはアミノ酸残基
２４〜２６の領域が、とりわけその領域の欠失により、
修飾される。

修飾ｕ−ＰＡは好ましくは天然ｕ−ＰＡのアミノ酸残基
１〜１０を含む。

本明細書で用いるウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性
化因子（ｕ　−Ｐ　Ａ　）なる用語は、血栓症およびう
つ血に関する国際委員会（ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｎａ−ｔ
ｉｏｎａｌ　Ｃｏｍｍ１ｔｔｅｅ　ｏｎ　Ｔｈｒｏｍｂ
ｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈａｅｍｏｓｔａ−ｓｉｓ）の牙Ｘ
ＸＶＩＩＩミーティング（イタリー国ペルー　６　＝ ガモ、１９８２年７月２７日）でｕ−ＰＡについて定義
された免疫学的性質をもつグループのプラスミノーゲン
活性化因子を表す。

ここで用いるｕ−ＰＡのアミノ酸およびヌクレオチド配
列の番号付けはホルムズ（Ｈｏ　Ｉｍｅ　ｓ　、Ｗ、Ｅ
、　）らの上記文献（１９８５）に記載された方式に従
い、Ｎ末端セリン残基を番号ｌとする。

本発明の修飾ｕ−ＰＡは以下に示す既知のＵ−ＰＡ含有
複合体に類似した薬学的に有用な複合体を提供すべく、
適宜誘導することができる：（ａ）欧州特許出願公開矛
１５５３８８号に記載されるような酵素−タンパク質複
合体、その場合線維素溶解作用に寄与する酵素の触媒部
位は可逆的リンキング基を介してそれに結合されたヒト
タンパク質により遮断される； （ｂｌ　　欧州特許出願公開矛１５２７３６号に記載さ
れるような酵素−タンパク質複合体、その複合体は線維
未溶解作用に寄与する触媒部位以外の部位で少なくとも
１種のヒトタンパク質に結合された、少なくとも１種の
任意に遮断された線維素溶解酵素から成る； （ｃ）　　欧州特許出願公開矛Ｏｆ　８３５０３号に記
載されるようなタンパク質−ポリマー複合体、その複合
体は可逆的リンキング基を介して少なくとも１種の水溶
性ポリマーに結合された薬学的に有用なタンパク質から
成る；または （ｄｌ　　欧州特許出願公開矛０１８４３６３号に記結
合された複数の線維素溶解酵素から成る。

本発明の修飾ｕ−ＦＡは上記複合体の酵素または（ヒト
）タンパク質成分としてｕ−ＦＡの代わりに適時使用す
ることができる。

本発明の修飾ｕ−ＰＡまたはその複合体は、線維素溶解
作用に必要不可欠な触媒部位を除去可能な遮断基によっ
て任意に遮断すべくさらに誘導することができる。修飾
ｕ−Ｐ人の上記誘導体は修飾ｕ−ＰＡそれ自体について
以後に述べる方法および組成物のいずれにも使用しうる
。

本明細書で使用する”除去可能な遮断基”なる表現は、
加水分解の擬−次速度定数がＩ）Ｈ７，４の等張水性媒
体中３７℃で１０〜６／秒〜１０”／秒の範囲であるよ
うな速度で加水分解により除去しさる基を包含する。

この種の遮断基は欧州特許庁０００９Ｂ７９号に開示さ
れており、任意に置換されたベンゾイル基または任意に
置換されたアクリロイル基のようなアシル基を含む。ベ
ンゾイル遮断基のための適当な任意置換基にはハロゲン
、Ｃ□−、アルキル、Ｃ１，アルコキシ、Ｃ１＠アルカ
ノイルオキシ％ｃｌ−ａアルカノイルアミノ、アミノま
たはｐ−グアニジノ基が含まれる。アクリロイル遮断基
のための適当な任意置換基にはＣ□−、アルキル、フリ
ル、７エ二ルマタはＣ８−６アルキルフエニルが含まれ
る。

さらに別の面接おいて、本発明は上記の修飾されたウロ
キナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子をコードするＤ
ＮＡを組換え宿主細胞内で発現させて、その修飾ウロキ
ナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子産物を回収するこ
とから成る、本発明の修飾ウロキナーゼ型プラスミノー
ゲン活性化因子の生産方法を提供する。

従って、ｕ−ＰＡの修飾は、ｕ−ＰＡをコードするｃＤ
ＮＡを修飾し、その修飾ｃＤＮＡを原核生物または真核
生物宿主内で発現させる慣用の遺伝子工学技術により実
施することができる。

修飾ｕ−ＰＡをコードするヌクレオチド配列から成るＤ
ＮＡポリマーもまた本発明の一部を構成する。

本発明方法はマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）うの１モ
レキュラークローニング：実験室マニュアル”、コール
ド・スプリング・ハーバ−１１９８２年に記載されるよ
うな慣用の組換え技術により行われる。

特に、本方法は次の諸工程から成る： ■）　上記の修飾されたウロキナーゼ型プラスミノーゲ
ン活性化因子をコードするヌクレオチド配列から成るＤ
ＮＡポリマーを、宿主細胞内で、発現しうる複製可能な
発現ベクターを準備する工程； ｌ）　宿主細胞を上記のベクターで形質転換する工程； ｉｉｌ　）　　上記の形質転換宿主細胞を、上記ＤＮＡ
ポリマーの発現を可能にする条件下で培養して、修飾ウ
ロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子を生産させる
工程； および Ｉｖ　）　　上記の修飾ウロキナーゼ戯プラスミノーゲ
ン活性化因子を回収する工程。

本発明はまた適当なモノ−、ジーまたはオリゴマーヌク
レオチド単位を縮合させることによるＤＮＡポリマーの
製法を提供する。その製法は化学的に、酵素学的に、ま
たは２つの方法の組合せで、適宜ｉｎ　ｖｉｔｒｏまた
はｉｎ　ｖｉｖｏで実施される。従って、ＤＮＡポリマ
ーはロバーツ（Ｄ、Ｍ、Ｒｏｂｅｒｔｓ）ら、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ、２４．５０９０〜５０９Ｂ（１９８
５）に記載されるような慣用方法を用いて、化学合成し
たＤＮＡフラグメントの酵素的連結により作ることがで
きる。化学合成は一般にオリゴデオキシリボヌクレオチ
ドの合成について後述するように行われる。ＤＮＡの酵
素による重合はｉｎ　ｖｉｔｒｏでＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ（フレノウフラグメント）の−ｌ〇　− ようなりＮＡポリメラーゼを用いて、必要に応じてヌク
レオシド三リン酸ｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰオ
Ｊ：びｄ　ＴＴＰを含む適当な緩衝液中１０〜３７℃の
温度において、一般には１０ｏμ！またはそれ以下の量
で行われる。ＤＮＡフラグ メントの酵素による連結はＴ４ＤＮＡリガーゼのような
りＮ人すガーゼを用いて、適当な緩衝液中４℃から周囲
温度までの温度において、一般には５０μノまたはそれ
以下の容量で行われる。

修飾ｕ−ＰＡをコードするＤＮＡポリマーはウィンター
（Ｗｉｎｔｅｒ、Ｑ、）ら、Ｎａｔｕｒｅ、　２９９．
７５１）〜７５８（１９ｇ２）またはシーラー（Ｚｏｌ
ｌｅｒ）およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）、Ｎｕｃｌ、Ａｃ
１ｄｓ　ＲｅＳ、＋　１０．６４８７〜６５００（１９
８２）に記載されるような慣用方法によるウロキナーゼ
型プラスミノーゲン活性化因子をコードするｃＤＮＡの
特定部位の突然変異誘発により、あるいはチェノ（Ｃｈ
ａｎ）およびスミｘ　（ｓｍｉ　ｔｈＬＮｕｃｌ、Ａｃ
１ｄｓ　Ｒｅｄ、、　１２．２４０７２４１９（１９８
４）またはウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ、Ｇ、）らｔ　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、Ｔｒａｎｓ、＋−■、２２４〜
２２５（１９８４）に記載されるような欠失突然変異誘
発により作ることができる。修飾ｃ　ＤＮＡの発現は慣
用方法により実施される。

上記の突然変異誘発法はアミノ酸残基５〜４９（例えば
アミノ酸２４〜２６）をコードするｃ　ＤＮＡ配列の必
要とされる変化に従って考案されたオリゴデオキシリボ
ヌクレオチドの使用を伴う。

この種の方法で使用されるオリゴデオキシリボヌクレオ
チドもまた本発明の一部を構成する。

本発明はまた、すべての遊離ヒドロキシ基およびアミノ
基が保護されている、上記オリゴデオキシリボヌクレオ
チドと同じ塩基配列をもっ第２のオリゴデオキシリボヌ
クレオチドから保護基を除去することより成る、本発明
のオリゴデオキシリボヌクレオチドの製法を提供する。

本発明方法で用いるオリゴデオキシリボヌクレオチドは
１遺伝子フラグメントの化学的および酵素的合成−実験
室マニュアル”（Ｈ，Ｇ、ガラセンおよびＡ、ラング編
集）、フェアラーグ・ケミ−、ワインハイム（１９ｓ２
）ｔたは例えばタイト（Ｍ、Ｊ、Ｇａ１ｔ）、マテス（
Ｈ，Ｗ、Ｄ、Ｍａｔｔｈｅｓ　）、シン（Ｍ、Ｓｉｎｇ
ｈ　）、スプＯ−）　（Ｂ、Ｓ、５ｐａｒｏａｔ　）お
よびチトマス（Ｒ，Ｃ，Ｔｉｔｍａｓ　Ｌ　Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、　　１０．６２４
３（１９８２）；スプ０−　）　（Ｂ、Ｓ。

５ｐｒｏａｔ）およびパンワース（Ｗ、Ｂａｎｎｗａｒ
ｔｈ　ＬＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　ＬｅｔｔｅｒＳ、　
２４．５７７１（１９８３）　；　マテッチ（Ｍ、Ｄ、
Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ）およびカルサーズ（Ｍ、Ｈ。

Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　　ＬＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌ
ｅｔｔｅｒｓ、２Ｌ　　７１９（１９８０）；マテツチ
（Ｍ、Ｄ、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ）およびカルサーズ（Ｍ
、Ｈ，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）＋Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　
ｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉ
ｅｔｙ、１０３＋３１８５（１９８１）　；アダムス（
Ｓ、Ｐ、Ａｄａｍｓ　）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔ
ｈｅＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　５ｏｃｉ
ｅｔｙ＋１０５，６６１（１９８３）　　；シ：／　ハ
（Ｎ−Ｄ、５ｉｎｈａ　）ｅビアナツト（Ｊ、Ｂｉｅｒ
ｎａｔＬマクマナス（Ｊ、ＭｃＭａｎｎｕｓ　）および
コースタ−（Ｈ，Ｋｏｅｓｔｅｒ　）　＋　Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｂ＋ＩＬ４５Ｍ（１
９８４）　；およびマチＸ　（Ｈ，Ｗ、ＤｏＭａｔｔｈ
ｅｓ　）ら、ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ、　３．８０１（
１９８４）の科学文献に記載されるような固相法を使っ
て、慣用のホスホトリエステル、ホスファイトまたはホ
スホルアミダイトの化学により製造することができる。

使用される固体支持体には当分針で知られた支持体、例
えばキーゼルグール（ケイソウ土）−ポリジメチルアク
リルアミド、シリカ、制御された孔ガラス、またはセル
ロースペーパーディスクが含まれる。製造すべきオリゴ
デオキシリボヌクレオチドのご末端の塩基は、末端！−
デオキシリボース単位の３′醗素に結合されたスペーサ
ー基を介して、固体支持体に結合され、そして（保護さ
れた形の）オリゴデオキシリボヌクレオチドの組み立て
は合成サイクルに従って１→ぎの方向に行われる。必要
とされる操作は手動または自動装置のいずれかで行われ
る。

合成の終了時に、保護されたオリゴデオキシリボヌクレ
オチドは、以下で説明するように、ひとたび意図する塩
基配列が組み立てられると実施される他の保護基除去反
応の前、後またはそれと同時に固体支持体から切り離さ
れる。有利には、オリゴデオキシリボヌクレオチドは室
温またはわずかに昇温下にアンモニア水溶液のような塩
基性試薬で処理するか、あるいは室温またはわずかに昇
瀉下に水性ジオキサン中の１．１，３．３−テトラメチ
ルグアニジニウム−５ｙｎ　−２−二トロベンズアルド
キシメートまたは類似の試薬で処理することにより、固
体支持体から分離される。

別法として、その製法は例えばリース（Ｃ，Ｂ。

Ｒｅｅｓｅ　）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、３４．３１
４３−３１７９（１９７８）に記載されるような溶液中
でのホスホトリエステル化学により慣例的に行われる。

オリゴデオキシリボヌクレオチドの必要とされるヌクレ
オチド塩基配列は、例えば上記文献に記載されるごとく
、適当なモノ−、ジーまたはオリゴマーヌクレオチド単
位を、ピリジンのような溶媒中室温またはわずかに昇温
下に１−（メシチレンスルホニル）−３−二トロー１．
２．４−）リアゾールのような適当な縮合剤で縮合する
（ホスホトリエステル化学を使用する場合）か、あるい
はアセトニトリル中周囲温度でテトラゾールのような縮
合剤で縮合する（ホスファイトまたはホスホルアミダイ
ト化学を使用する場合）ことにより、慣例的に合成する
ことができる。場合により、それぞれの縮合工程の後に
１キヤツピング工程ヲ導入して、遊離のぎ一ヒドロキシ
基を含む未反応出発物質を不活性化する。このようなキ
ャッピング工程は適当には周囲温度でテトラヒドロフラ
ン中の２．６−ルチジンおよび４−Ｎ、Ｎ−ジメチルア
ミノピリジンの存在下に無水酢酸のようなアシル化剤を
用いて行われる。

ホスファイトまたはホスホルアミダイト化学を使用する
場合、各縮合工程で生じたホスファイト−トリエステル
ヌクレオチド間結合中のリン（至）原子は、後続の縮合
工程を行う前に、酸化されて対応するホスホトリエステ
ル結合を与える。このような酸化は慣用の酸化剤、例え
ばルチジンのような塩基の存在下に水性テトラヒドロフ
ラン中のヨウ素を用いて行われる。この酸化工程は先に
述べた任意の１キヤツピング工程の後で有利に行われる
。

オリゴデオキシリボヌクレオチドの合成の間中、ヌクレ
オチド間ホスホジエステル結合中のヒドロキシ基は、こ
の分子の枝分れを防ぐために通常使用されるアリール基
またはアルキル基（例えば２−マタは４−クロロフェニ
ル、メチルまたは２−シアンエチル）で保護することが
できる。アリール保護基は合成の終了時に、この目的の
ために通常使用される試薬、例えば水性ジオキサンのよ
うな水性溶媒中の１．１．３．３−テトラメチル−グア
ニジニウム−５ｙｎ　−２−二トロベンズアルドキシメ
ートを用いて周囲温度で処理することにより除去される
。メチル基は合成の終了時に、ジオキサン中のトリエチ
ルアンモニウムチオフェルレートを用いて周囲温度で処
理することにより除去される。

２−シアンエチル基は合成の終了時に、周囲温度でピリ
ジン中のトリエチルアミンまたはｔ−ブチルアミンのよ
うな塩基性試薬で処理するか、あるいは約５０℃にて濃
アンモニア水溶液で処理する（この工程は以下で説明す
るようにＡ、ＣおよびＧ塩基上に存在する保護基を同時
にかつ有利に除去する）ことにより除去される。

Ａ、ＣおよびＧ塩基に存在するアミノ基は塩基に不安定
な保護基、例えばＡおよびＣの場合はベー　１７　＝ ンゾイル基、そしてＧの場合はイソブチリル基で保護さ
れる。この種の基はアンモニアのような塩基性試薬を用
いて周囲温度またはわずかに昇温（例えば５０℃）で処
理することにより除去される。末端リボース部分の５′
−ヒドロキシ基はトリチル、４．４’−ジメトキシトリ
チルまたはピキシル（９−フェニル−９−キサンチル）
のよつｔｘ酸に不安定な基で保護され、この種の基は各
縮合工程の前および合成の終了時にジーまたはトリクロ
ロ酢酸のような酸性試薬を用いて無水溶媒（例えばジク
ロロメタンまたはクロロホルム）中周囲温度で処理する
ことＫより除去される。

組換え宿主細胞による修飾ｕ−ＰＡをコードするＤＮＡ
ポリマーの発現は、その宿主細胞内でＤＮＡポリマーを
発現しうる複製可能な発現ベクターを用いて行わ名る。

その発現ベクターは新規であり、これもまた本発明の一
部を構成する。

複製可能な発現ベクターは、宿主細胞と適合しうるベク
ターを切断して完全なレプリコンをもつ線状ＤＮＡセグ
メントを作り、その線状セグメントと修飾ｕ−ＰＡをコ
ードするＤＮＡポリマーとを連結条件下で連結すること
Ｋより、本発明に従って作製される。

ベクターの選択は、原核生物または真核生物であり得る
宿主細胞によって幾分か左右されるであろう。適当なベ
クターにはプラスミド、バクテリオファージ、組換えウ
ィルスおよびコスミドが含まれる。

複製可能な発現ベクターの作製は、例えばマニアテスら
の上記文献に記載の方法により、ＤＮＡの制限、重合お
よび連結用の適当な酵素を用いて慣例的に実施される。

重合および連結はＤＮＡポリマーの製造において上述し
た通りに行われる。

制限酵素による消化は適当な緩衝液中２０〜７０℃の温
度で、一般には０．１〜１０μｇのＤＮＡを含む２００
μノまたはそれ以下の容量で行われる。

組換え宿主細胞は、形質転換条件下に宿主細胞を本発明
の複製可能な発現ベクターで形質転換することにより、
本発明に従って作られる。適切な形質転換条件は慣例的
であり、例えばマニアテスらの上記文献、または”ＤＮ
Ａクローニングｖｏ１．ＩＩ、グローパー（Ｄ、Ｍ、Ｇ
ｌｏｖｅｒ）編集、ＩＲＬプレス社、１９８５年に記載
されている。

形質転換条件の選択は宿主細胞により決定される。従っ
て、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）のような細菌宿主はＣａＣ
１，の溶液（：Ｉ−ｘ　ｙ　（Ｃｏｈｅｎ）ら、Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、　６９，２１１０（１９７３）を
参照〕またはＲｂＣＪ　。

ＭｎＣｊｔ、Ｊ’ｐ酸カリウムおよびグリセロールの混
合物から成る溶液で処理され、次に３−〔Ｎ−モルホリ
ノツープロパン−スルホン酸、Ｒｂ（Ｊおよびグリセロ
ールで処理される。哺乳動物の培養細胞はその細胞への
ベクターＤＮＡのカルシウム共沈により形質転換される
。本発明はまた本発明の複製可能な発現ベクターで形質
転換された宿主細胞をも包含する。

ＤＮＡポリマーを発現させる条件下での形質転換宿主細
胞の培養は、例えばマニアテスらの上記文献および上記
の′″ＤＮＡＤＮＡクローニングれるようにして慣例的
に行われる。従って、細胞は栄養素を供給して、４５℃
以下の温度で培養することが好ましい。

修飾ｕ−ＰＡ発現産物は宿主細胞に応じて慣用方法で回
収される。こうして、宿主細胞が大腸菌のような細菌で
ある場合は、それを物理的、化学的または酵素的に溶菌
し、得られた溶菌液からタンパク質産物を単離すること
ができる。宿主細胞が哺乳動物細胞である場合は、一般
にその生産物は栄養培地から単離することができる。Ｄ
ＮＡポリマーは修飾ｕ−ＰＡを発現する安定した形質転
換哺乳動物細胞株の単離のために考案されたベクター（
例えばウシｅパビローマウイルスベクｐ　−）中に挿入
することができる（ＤＮＡクローニング。

ｖｏｌ　、ｎ＋Ｄ、Ｍ、グローバー編集、ＩＲＬプレス
、１９８５年；カウフマン（Ｋａｕ　ｆｍａｎ　、　Ｒ
，Ｊ　、）らｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒａｎｄ　Ｃｅ１ｌ
ｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　５．１７５０〜１７５９（
１９８５）　ｐバブラキス（ｐａｖｌａｋｉｓ、Ｇ、Ｎ
、）およびハマー（Ｈａｍｅｒ、Ｄ＋Ｈ，）＋Ｐｒｏｃ
ｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＮａｔｉｏｎａｌＡｃ
ａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ（Ｕ　Ｓ　Ａ）　
ｊＪｊ；）−＋　３９７〜４０１（１９８３）；ゴーデ
ル（Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｄ、Ｖ、）ら、欧州特許出願公開
牙００９３６１９号、　１９８３年を参照〕。

　２１一 本発明に従って生産された修飾ｕ−ＰＡは、宿主細胞に
応じて、いろいろな程度にグリコジル化され得ることが
明らかであるだろう。本発明の修飾ｕ　−Ｐ　Ａはこの
ようなグリコジル化変異体を包含するものである。

１つの好適な実施態様において、修飾されたウロキナー
ゼ型プラスミノーゲン活性化酵素は、ヌクレオチド１６
６から５′方向へ伸びるｕ−ＰＡｃ　ＤＮＡの領域に相
補的であるか又は対応するヌクレオチド配列を、　ｕ　
−ＰＡ　　ｃＤＮＡのヌクレオチド２７２からｒ方向へ
伸びる領域に相補的であるか又は対応するヌクレオチド
配列に直接連結してなるオリゴデオキシリボヌクレオチ
ドを用いて、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因
子をコードするｃＤＮＡに欠失突然変異を生じさせ、そ
して修飾ｃ　ＤＮＡを原核または真核宿主細胞において
発現させることから成る方法によって生産される。

上記の好適な実施態様で使用されるオリゴデオキシリボ
ヌクレオチドは長さが少なくとも１６ヌクレオテドであ
り、好ましくは少なくとも３０ヌクレオチドである。適
当には、それは欠失領域のそれぞれの側のヌクレオチド
に相補的な少なくとも８ヌクレオチド、好ましくは少な
くとも１５ヌクレオチドを含む。

好適なオリゴデオキシリボヌクレオチドは次の配列（１
）のオリゴデオキシリボヌクレオチドは新規であり、こ
れも本発明の一部を構成する。オリゴデオキシリボヌク
レオチド（Ｉ）の５′末端の１５塩基はｕ−ＰＡ　　ｃ
ＤＮＡのヌクレオチド２８６〜２７２に相補的であり、
そしてオリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｉ）のご末端
の１５塩基はｕ　−Ｐ　Ａ　ｃＤＮＡのヌクレオチド１
６６〜１５２に相補的である。

配列（１１のオリゴデオキシリボヌクレオチドはｕ−Ｐ
Ａのアミノ酸１１〜４５をコードするｃＤＮＡ部分を欠
失させるために使用される。突然変異誘発後に得られた
ｃ　ＤＮＡはホルムズ（ｎｏ　１ｍｅ　ｓ　、Ｗ、Ｅ、
　）らの上記文献（１９８５）に記載のものに類似して
いると考えられるが、但し次の新しいヌクレオチド配列
を有する： このｃ　ＤＮＡの発現によって得られるｕ−ＰＡはホル
ムズらの上記文献に記載のものと類似したアミノ酸配列
をもつことが期待されるが、但し次の変異を有する： 位置６　　　　　　　　　１０　　４６　　　　　　　
　５０−ｇｌｎ−ｖａ　１−ｐｒｏ−ｓｅｒ−ａｓｎ−
１ｙｓ−ｓｅｒ−１ｙｓ−ｔｈｒ−ｃｙｓ第２の好適な
実施態様において、修飾ウロキナーゼ型プラスミノーゲ
ン活性化酵素は、ヌクレオチド２０５から５′方向へ伸
びるｕ　−Ｐ　Ａ　ｃＤＮＡの領域に相補的であるか又
は対応するヌクレオチド配列を、ｕ　−Ｐ　Ａ　ｃＤＮ
Ａのヌクレオチド２１５からご方向へ伸びる領域に相補
的であるか又は対応するヌクレオチド配列に直接連結し
てなるオリゴデオキシリボヌクレオチドを用いて、ウロ
キナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子をコードするｃ
ＤＮＡに欠失突然変異誘発を生じさせ、そしてその修飾
ｃ　ＤＮＡを原核または真核宿主細胞において発現させ
ることから成る方法において生産される。

上記の好適な実施態様で使用されるオリゴデオキシリボ
ヌクレオチドは適当には少なくとも１６ヌクレオテド長
であり、好ましくは少なくとも３０ヌクレオチド長であ
る。適当には、それは欠失領域のそれぞれの側のヌクレ
オチドに相補的な少なくとも８ヌクレオチド、好ましく
は少なくとも１５ヌクレオチドを含む。

好適ナオリゴデオキシリボヌクレオテドは配列（Ｉ）を
有する。

ｆｆ　ｄ　（ＧＣＡＣＣＡＧＴＱＡＡＴＧｒＴＣＴＴＧ
ＴＴＧＧＡＣＡＣＡＣＡ）　３’　　（Ｉ）配列（１）
のオリゴデオキシリボヌクレオチドは新規であり、これ
もまた本発明の一部を構成する。

オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｉｌの５′末端の１
５塩基はｕ　−Ｐ　Ａ　ｃＤＮＡのヌクレオチド２２９
〜２１５に相補的であり、そしてオリゴデオキシリボヌ
クレオチド（Ｉ）の３′末端の１５塩基はｕ　−ＰＡｃ
　ＤＮＡのヌクレオチド２０５〜１９１に相補的である
０ 配列（Ｉ）のオリゴヌクレオチドはｕ−ＰＡのアミノ酸
２４〜２６をコードするｃＤＮＡ部分を欠失させるため
に使用される。突然変異誘発後に得られるｃＤＮＡはホ
ルムズ（Ｈｏｌｍｅｓ、Ｗ、Ｅ、）らの上記文献に記載
のものに類似していると考えられるが、次の新しいヌク
レオチド配列を有する： ５　’　−ＧＴＧ　ＴＣＣＡＡＣＡＡＧ　ＡＡＣＡＴＴ
　ＣＡＣＴＧＧ　３’このｃ　ＤＮＡの発現により得ら
れるｕ−ＰＡはホルムズらの上記文献に記載のものと類
似したアミノ酸配列をもつことが期待されるが、次の変
異を有する： 位置２０　　　　　　２３２７　　　　　　３Ｏ−ｖａ
ｌ−ｓｅｒ−ａｓｎ−１ｙｓ−ａｓｎ−ｉ　１ｅ−ｈｉ
ｓ−１ｒｐ一本発明の修飾ｕ−ＰＡは、成長因子ドメイ
ンのお 領域（例えばアミノ酸２４〜２６の領域）にゆいて修飾
されたｕ−ＰＡのＡ鎖に天然ｕ−ＰＡのＢ鎖が結合した
ものから成る。この修飾ｕ−ＰＡのＡ鎖は欧州特許矛０
１５５３８７号に記載されるような線維素溶解作用をも
つハイブリットタンパク質の１つの鎖として使用するこ
とができる。修飾ｕ−ＦＡのＡ鎖、修飾ｕ−ＰＡのＡ鎖
をコードするＤＮＡ、および線維素溶解作用を有するプ
ロテアーゼのＢ鎖に結合された修飾ｕ−ＰＡのＡ鎖から
成るハイブリットタンパク質（その触媒部位は任意に除
去可能な遮断基で遮断される）はすべて本発明の一部を
構成する。ハイブリットタンパク質は修飾ｕ−ＰＡそれ
自体について以後に述べる方法および組成物のいずれに
おいても使用しうる。

本発明の修飾ｕ−ＰＡは適当には薬剤組成物の形で投与
される。従って、本発明はまた本発明の修飾ｕ−ＰＡを
薬学的に許容される担体と組み合わせてなる薬剤組成物
を提供する。本発明組成物はヒトへの静脈内投与に適合
する薬剤組成物として常法に従って処方される。

静脈内投与用の組成物は一般に滅菌等張水性緩衝液中に
溶解した滅菌酵素の溶液である。必要に応じて、その組
成物は修飾ｕ−ＰＡを溶解状態に保つための可溶化剤、
および注射箇所の痛みを緩和するためのリグノカインの
ような局所麻酔剤をさらに含んでいてもよい。一般に、
修飾ｕ−ＰＡは活性単位のタンパク質量を示す気密容器
（例えばアンプルやサシエツト）中の乾燥粉末または無
水濃厚液として単位剤形で供給されるであろう。

修飾ｕ−ＰＡが除去可能な遮断基を含む場合は、遊離タ
ンパク質を放出する時間が表示されるだろう。タンパク
質が輸液によって投与される場合は、医薬品数の滅菌し
た１注射用水”または食塩水を含む輸液ビンと共に分配
されるだろう。タンパク質が注射により投与される場合
は、注射用の滅菌水または食塩水のアンプルと共に分配
されるだろう。注射用または輸液用組成物は投与に先立
って諸成分を混合することにより調製される。投与すべ
き物質の量は必要とされる線維素溶解の量および速度、
血栓塞栓症の重症度、ならびに凝血塊の位置および大き
さにより左右されるだろう。正確な投与量および投与方
法は必然的にその疾患の性質を考慮しつつ諸情況に従っ
て主治医により決定されねばならない。しかしながら、
一般に血栓症の患者は例えば５回以下の注射あるいは輸
液により０．０１−１　ａｍｐ／＃（体重）の１日分の
用量を受は取るであろう。

上記の投与量範囲内において、本発明化合物は毒物学的
副作用を何ら示さない。

従って、本発明の別の面では、効果的な無毒性量の本発
明修飾ｕ−ＰＡを患者に投与することから成る血栓症の
治療方法が提供される。

本発明はまた有効治療物質として使用するための、特に
血栓症の治療に使用するための本発明修飾ｕ−ＰＡを提
供する。

以下の実施例は本発明を例示するためのものである。

実施例Ｉ Ｆ！ｄ　（ＧＣＡＧＧＴＴＴＴＴＧＡＣＴＴＧＴＴＣＧ
ＡＴ田駄渭Ｇ）３′上記の３０−ｍｅｒは本明細書にお
いて記載したものと類似した慣用固相法により製造した
。このオリゴデオキシリボヌクレオチドを使用して、Ｎ
ｕｃｌ。

Ａｃ１ｄ、１（ｅｓ、、１２．２４０７〜２４１９（１
９８４）またはＢｉｏｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、Ｔｒａｎｓ、
、１２＋２２４〜２２５　（１９８４）　Ｋ記載される
方法により修飾ｕ　−Ｐ　Ａ　ｃＤＮＡを作った。

原核または真核宿主細胞による修飾ｃ　ＤＮＡの発現は
、アミノ酸１１〜４５が欠失された本発明の修飾ｕ−Ｐ
Ａをもたらした。

実施例２ ｆｆ　ｄ（ＧＣＡＣＣＡＧＴＧＡＡＴＧＴＴＣＴＴＧＴ
ＴＧＧＡＣＡＣＡＣＡ）　３’上記の３０−ｍａｒは本
明細書において記載したものと類似した慣用固相法によ
り製造した。

この３０−ｍａｒを使用して、実施例１の方法により、
アミノ酸２４〜２６が欠失された本発明の修飾ｕ−ＦＡ
を製造した。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕ
   −ＰＡ）の成長因子ドメインの領域において修飾され、
   場合によりその線維素溶解作用にとつて必要不可決な触
   媒部位が除去可能な遮断基により遮断されている、線維
   素溶解作用を有する修飾されたウロキナーゼ型プラスミ
   ノーゲン活性化因子。
2. （２）天然ｕ−ＰＡのアミノ酸１〜１０を含む、特許請
   求の範囲第１項記載の修飾ｕ−ＰＡ。
3. （３）修飾はアミノ酸残基１１〜４５の欠失から成る、
   特許請求の範囲第１項または第２項記載の修飾ｕ−ＰＡ
   。
4. （４）修飾はアミノ酸残基２４〜２６の欠失から成る、
   特許請求の範囲第１項または第２項記載の修飾ｕ−ＰＡ
   。
5. （５）成長因子ドメインの領域において修飾されたウロ
   キナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子のＡ鎖を、線維
   素溶解作用を有するプロテアーゼのＢ鎖に結合させて成
   り、場合によりその触媒部位が除去可能な遮断基で遮断
   されているハイブリットタンパク質。
6. （６）線維素溶解作用に寄与する酵素の触媒部位が可逆
   的なリンキング基を介してそれに結合されたタンパク質
   によつて遮断されている酵素−タンパク質複合体であつ
   て、酵素およびタンパク質の一方が特許請求の範囲第１
   〜４項のいずれか１項に記載された修飾ｕ−ＰＡである
   ことを特徴とする上記の酵素−タンパク質複合体。
7. （７）特許請求の範囲第１項記載の修飾ｕ−ＰＡを、薬
   学的に許容される担体と組み合わせてなる医薬組成物。
8. （８）血栓症の治療に使用するための特許請求の範囲第
   １項記載の修飾ｕ−ＰＡ。
9. （９）血栓症治療用の医薬の製造に使用するための特許
   請求の範囲第１項記載の修飾ｕ−ＰＡ。
10. （１０）特許請求の範囲第１項記載の修飾ｕ−ＰＡをコ
    ードするＤＮＡを組換え宿主細胞内で発現させ、その後
    修飾ｕ−ＰＡ産物を回収することから成る上記の修飾ｕ
    −ＰＡの生産方法。