JPS63148987A - Ｓｓｐｅウイルスのｈ蛋白質をコ−ドする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は亜急性硬化性全脳炎（ｓｕｂａｃｕｔｅｓｃｌ
ｅｒｏｓｉｎｇｐａｎｅｎｃｅｐｈａｌｉ　ｔｉｓ；５
ＳＰＥ）ウィルスのヘマグルチニン（ｈｅｍａＢ］ｕｔ
ｉｎｉｎ；　Ｈ）蛋白質をコードする遺伝子に関する。

〔従来の技術〕

５ＳＰＥは小児や若年者に知能低下環をもたらす予後の
悪いウィルス性脳炎であり、これに対する満足すべき予
防ワクチンは開発されていない。５ＳＰＥに類縁の麻疹
については、有効な生ワクチンが開発されており、先進
国においては十分な予防が可能となったが、発展途上国
では生ワクチンの価格が高く、管理、維持が困難である
等の理由から、今だ大勢の子供が麻疹のために死亡して
いる。

このため、麻疹に対する、安価で維持管理が容易なワク
チン、例えば組換ワクチンの開発が望まれる。この場合
、麻疹ウィルス及びこのウィルスと近縁な５ＳＰＥウイ
ルスの両者に対して効果を有するワクチンを開発するこ
とが一層合理的である。

ワクチンの製造のためには、ワクチンの抗原蛋白質をコ
ードする遺伝子を遺伝子組換え技法により大腸菌、酵母
又は動物細胞中で発現せしめ、抗原蛋白質を得る方法、
及び抗原蛋白質をコードする遺伝子をワクチニアウィル
スに組込んで組換えウィルスを造成して生ワクチンを得
る方法等が一般的な方法として知られており、このため
にはまず、抗原蛋白質をコードする遺伝子をクローニン
グしなければならない。

これらのウィルスの抗原として機能すると考えられるヘ
マグルチニン蛋白ｔ（Ｎ蛋白質）の内、麻疹ウィルスの
Ｈｌ白質についてはそれをコードする遺伝子（Ｈ遺伝子
）がすでにクローニングされている（Ａｌｋｈａｔｉｂ
、Ｇ、及びり、Ｊ、Ｂｒ１ｅｄｉｓ＋　１９８６＋Ｔｈ
ｅ　ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｐｒｉｍａｒｙ　５ｔｒｕｃ
ｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎ＋ｅａｓｌｅｓｖｉｒｕｓ
　ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ、　４　＋　１５０　＋
４７９−４９０）が、５ＳＰＥウイルスのＨ遺伝子はま
だクローニングされていない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明は、５ＳＰＥウイルスに対するワクチンを開発す
ることを終掻的な目的とし、その前提として５ＳＰＥウ
イルスの抗原蛋白質であるｌ］蛋白質をコードするクロ
ーン化された遺伝子を提供しようとするものである。

〔問題点を解決するための手段〕 前記の目的は、５ＳＰＥウイルスのＮ蛋白質の全部又は
一部をコードするクローン化された遺伝子を提供するこ
とにより達成される。

〔具体的な説明〕

次に、５ＳＰＥウイルスのＮ蛋白質のクローニング方法
を具体的に記載する。

（１）　５ＳＰＥウィルス−Ｖｅｒｏ　　　感”　７．
　＜７）　’　ｒ亜急性硬化性全脳炎（ＳＳＰＥ）ウィ
ルスの由来麻疹罹患後１０年目に発症した５ＳＰＥ患児
の剖検脳からの、トリプシン、ＥＤＴＡまたは機械的処
理により分散させた脳細胞を、Ｖｅｒｏ細胞と混合培養
し、５ＳＰＥ　−Ｖｅｒｏ細胞感染系（山形１株）を樹
立した。

この感染系に出現する融合巨細胞は、サル赤血球吸着陽
性で、その細胞質及び核には封入体と麻疹抗原が検出さ
れた。本株は、培養液中にウィルス粒子を遊離せず、従
っていわゆる“粒子非崖出系”であると考えられるが、
細胞を凍結融解した後の遠心上清中には、少量の感染性
粒子が回収された。

（文献：　Ｈｏｍｍａ、Ｈ，、Ｔａ５ｈｉｒｏ、Ｍ、、
Ｋｏｎｎｏ、Ｈ，，０ｈａｔａ。

Ｙ、、Ｈｉｎｏ、Ｍ、及びＴａｋａｓｅ、Ｓ、　（１９
Ｂ２）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

七現朋旦り１酋−１１９５−１２０２）。

（２）　ｌｌＲＮＡの抽出 本発明においては、Ｖｅｒｏ細胞で増殖できるようにし
た５ＳＰＥウィルス山形１株（ＹａｍａｇａＬａ　　１
　）を培養し、次にＯｋａｙａｍａ　−Ｂｅｒｇ法（Ｏ
ｋａｙａｍａ及びＢｅｒｇ＋Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏ
ｌ、　　２，１６１　１７０，１９８２；３，２８０−
２８９、１９８３）によりｃＤＮＡを調製した。

すなわち、５ＳＰＥウィルス山形１株を、ｍ、ｏ、　ｔ
、　＝１でサブ・コンフルエントのＦ　−Ｖｅｒｏ細胞
を収容する直径６（Ｊのシャーレ８枚に接種した。翌日
継代し、２４時間後アクチノマイシンＤを２０■／−の
濃度で添加することにより細胞性ｍＲＮＡの合成を抑制
しながらさらに５時間インキュベートした。

次に、グアニジニウム−セシウムクロライド法（６Ｍ　
ＧＴＣ、５１Ｍクエン酸ナトリウム、０．５％サルコシ
ル−５，７Ｍ　ＣｓＣ１１＋　ｏ、　Ｉ　Ｍ　ＥＤＴＡ
）で１２時間以上、３５．００Ｏｒｐｍ　（１５，０Ｏ
ＯＸＧ）にて遠心することによりＲＮＡを回収した（Ｔ
、Ｍａｎｉａｔｉｓ等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ且■旦り、
ρ１９６．１９８２）。

次に、常法に従って、前記のように回収したＲＮＡ画分
をオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに通し、吸着したＲ
ＮＡを溶出することによりポリＡ（゛）ＲＮＡを回収し
た（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒり且
ＬＬ！！４１．　Ｉ）１９７．１９８２）　。

（２）プヱ：≦θ囚１暫 本発明においては、前記のようにして調製したポリＡ”
　ＲＮＡ中に目的とする遺伝子のｍＲＮＡが存在するこ
とを確認するため、及び後で詳細に記載するｃＤＮパラ
イフ゛ラリ−のスクリーニングのため、Ｈ遺伝子の検出
及びスクリーニングについては掻めて近縁の麻疹ウィル
ス（ＭＶ）のＨ遺伝子をプローブとして使用した（Ｈ遺
伝子プローブ又はＭＶ−Ｈ−ｃＤＮＡプローブと称する
）。

ＭＶ　−Ｈ−ｃＤＮＡは次のようにして調製した。

Ｅｄｍｏｎｓ　ｔｏｎ株を感染した細胞からｍＲＮ八を
抽出した後、ｃＤＮＡを作製し、これをｐＢＲ３２２に
挿したプラスミドから切り出した。その詳細はＲｏｚｅ
ｎｂｌａｔｔ。

Ｓｏ、Ｇｅｓａｎｇ、Ｃ，、、Ｌａｖｉｅ、Ｖ及びＮｅ
ｕｍａｎ、　Ｆ、　（１９８２）　。

ＪＪｉｒｏｌ、　　４２．７９０−７９９に記載されて
いる。

プローブの作製は、ニックトランスレーションにより上
記ＭＶ−Ｈ−ｃＤＮＡを放射性同位元素ｆｆｔｐで標識
することにより行った（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ等、Ｍｏ
１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、ｐ１０９．１９８２
）。要約すれば、市販キットを用いて、前記ＤＮＡをＴ
ｒｉｓ　−ＨＣＩ　（ｐＨ７，８）緩衝液中で、′３２
Ｐ標識した３種類（Ｃ，Ｇ、Ｔ）のデオキシリボヌクレ
オチド三リン酸と共にＥ。

コリＤＮＡポリメラーゼ■の存在下でインキュベートす
ることにより０ｐ標識する。次に標識されたＤＮＡを、
未反応の”　Ｐ　ｄＮＴＰからセファデックス０２５カ
ラムを用いて分離する。

（３）ポリ八”’　ＤＮＡ　　のＨ白−り＋Ｒ１ソＪソ
ノ１コ？ｌ≦ヒーｍ前記のようにして調製したポリＡ”
　ＲＮＡをブライオキサイド又はホルムアミドで変性し
た後、アガロース電気泳動により分離し、そして通常の
ノーサン・ハイブリダイゼーション法により前記のＭＶ
　−Ｈ−ｃＤＮＡプローブを用いてこれとハイブリダイ
ズするｍＲＮＡの検出を試みた（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ
等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　　＋ｐ２００
＋１９８２）　ｅその結果、ＭＶ−Ｈ−ｃＤＮＡプロー
ブとハイブリダイズするｍＲＮＡが２３．２ｋｂ付近の
両分に存在することが確認された。

この結果は、前記ポリ　４国ＲＮＡ中に５ＳＰＥウイル
スのＨ蛋白質をコードするｍＲＮＡが存在することを示
唆している。

（４）　ｃＤＮＡ−イブーリーの８゜＋＋Ｏｋａｙａｍ
ａ　−Ｂｅｒｇ法（Ｏｋａｙａｍａ　Ｈ，及びＰ、Ｂｅ
ｒｇ：Ｍｏｌ。

Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　２．１６１，１９８２；　３２
８０，１９８３）によりｃＤＮＡのライブラリーを作製
した。ベクターとしては、ｏｌｉｇｏ　ｄＴ−ｔａｉｌ
ｅｄ　（Ｔ　＝１７）　ｐｃＤＶ−１と、ｏｌｉｇ。

ｄＧ−ｔａｉｌｅｄ　（Ｇ　＝１２）　ｐＬ　−１旧ｎ
ｄＩｆｆリンカ−を用いた。

上記ｏ１ｉｇｏ　ｄＴ−ｔａｉｌｅｄ　　ｐｃＤＶ　−
１を用いて、ｃＤＮＡを作製した。８躍の前記ポリＡ　
（＋）　ＲＮＡ、２躍のｄＴ−ｔａｉｌｅｄプラスミド
・ブライマー（ｐｃＤＶ−１）、４種類のｄＮＴＰ　（
（”Ｓ）　ｄＣＴＰを含む）２■ｈ１及び２０．６ユニ
ツトの逆転写酵素（ＲＴａｓｅ）を含む４０ＪＩＩの反
応液（１００ｍＭ、　ｐＨ８，３のＴｒｉｓ　−ＨＣｌ
、　１０ｍＭＭｇＣｂ、１４０ｍＭ　ＭＣＩ、２　ｍＭ
水酸化メチル水銀２０ｍＦＩメルカプトエタノール１　
ｍＭ　ＲＮａｓｅインヒビター）にて４２℃、６０分間
インキュベートすることによりｃＤＮＡ−プラスミドを
形成せしめた。これに３．５ｍＭｄＣＴＰ及び３０ユニ
ツトのターミナルトランスファラーゼを°添加し、７３
．５１１１の反応液として３７℃にて３分間反応せしめ
、そして２．５ｍＭ　ＥＤＴＡ　＋　０．０５％ＳＤＳ
液（最終濃度）を添加することにより反応を停止した。

この反応混合物をクロロホルム／フェノールで抽出した
後、エタノールによりＤＮＡを沈澱せしめた。

このｃＤＮＡ−プラスミドを、生塩濃度緩衝液（５０ｍ
Ｍ　ＮａＣ１，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，
５）、ｌｏｍＭ　ＭｇＣ１ｇ。

１ｍＭジチオスレイトール〕中で２０ユニツトのＨｉｎ
ｄｌｌｌにより、４０１１！の反応液中で３７℃にて２
時間消化した。

まず、１２０ｎｇのｃＤＮＡ−プラスミドと３５ｎｇの
ＰＬ−１リンカ−を４０ｍの反応液中にて６５℃、５分
間インキュベートし、その後４２℃、６０分、更にイン
キュベート後室温に戻し、アニーリングさせる。その擺
Ｏ℃に冷し、Ｅ、コリＤＮＡリガーゼを０．３　ｎ加え
、１２℃で一夜、インキュベーションした。

次に、Ｅ、コリＤＮＡリガーゼ２００ｎｇ　、　ＲＮａ
ｓｅ　Ｈｏ、４５０ユニツト、ＤＮＡポリメラーゼ０．
８ユニツトを添加しく液量４８ｕり、１２℃、１５℃、
２０℃、２５℃と３０分づつ徐々に温度を上げ、ｍＲＮ
Ａ部分を消化するとともに、ｃＤＮＡを２本鎖とし、で
きたｃＤＮＡをリガーゼにて結合させた。以上の反応に
よりｃＤＮＡを作製した。なお、これらの反応は同一キ
ューブ中、同一緩衝液にて行ない、新たな酵素などは、
その都度添加した。

こうして得られたプラスミドにより大腸菌ニジエリシャ
’コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｈｃｉａ　ｃｏｌｔ）Ｄｌｌ
　−５株及びＭＣ１０６１株を形質転換し、ｃＤＮＡラ
イブラリーを得た。

（５）　ｃＤＮＡ−イブ−１−のスフ１−ニング次に、
上記のようにして得られた９５１株について、コロニー
ハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。

この結果ＭＶ　−Ｈ−ｃＤＮＡプローブとハイブリダイ
ズするクローン５個を得た。これらのクローンをそれぞ
れエシェリシ＋・コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ　ｃｏ
ｉｌ　）ＤＨ−ＳＳＰＥＶＨ−１〜ＤＨ−５ＳＰＥＶＩ
＋−５と命名した。また、これらの大腸菌中のプラスミ
ドを、それぞれｐＤＨ−ＳＳＰＥＶＨ−１〜ｐＤＨ−５
ＳＰＥＶＨ−５と命名した。

候補株ｐＤＩＩ　−５ＳＰＥν１１−１は約３　ｋｂ、
候補株ｐＤＨ−５ＳＰＥＶＨ−２及びｐＤ）Ｉ　−５Ｓ
ＰＥＶＨ−３は２．４ｋｂ、そして他の２つの候補株は
約１．０　ｋｂであった。

これらのうちｐＤＨ−５ＳＰＥＶＨ−１〜−３は５ＳＰ
Ｅ　’フィルスのＨ蛋白質のほぼ完全のコード領域を含
有するものと推定される。

前記プラスミドｐＤ［ｌ　−５ＳＰＥＶＨ−２を含有す
る大腸菌をｐＯＢ　−５ＳＰＥＨと称し、これは微工研
菌寄第９ｏ７Ａ　号（Ｆ［！ＲＭ　ｐ＝　Ｆｏ７１　　
）として工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されて
いる。

（６）ノ　　、ｌズの。

前記プラスミド中のｃＤＮＡ挿入部分の制限酵素地図は
第１図に示すように決定された。

（７）　５ＳＰＥのＨ遺伝子の発現 スクリーニングにより得られたクーロンのうち、候補株
ｐＤ−５ＳＰＥＶＨ−２ツク−０７をＣｏ５−７細胞で
形質発現させたところ、５ＳＰＨのＨの発現が６１！　
Ｌｚされた。

Ｓａｌ　Ｉで鎖状にした５ＳＰＥ−Ｈ遺伝子ＩＩ４．２
ＭＣａＣ１１２，６ｍ、ＩＩＢＳ（５０ｍＭ　ｔ（ＥＰ
ＥＳ、２８０ｎ＋Ｍ　ＮａＣｌ、　１．５１１メＭリン
酸緩衝液）１００メを混合したものにＴＥ緩衝液を加え
全量２００　ｍにした。それにＣＯ５−７ｔ−［！１胞
の培養液２００Ｉを混合した。３７℃で７時間培養後、
１０％ＤＭＳＯにより１５分間処理し、さらに１０％Ｆ
Ｃ５−Ｅａｇｌｅｓ培地で３７℃１〜２目培養した後、
５ＳＰＥ−Ｈの発現を調べた。即ち、ＳＳＰ［！−Ｉ（
遺伝子を導入したＣｏ５−７細胞をアセトン固定後、ウ
サギの抗Ｈ抗体で間接法を使用し蛍光染色したところ、
特異的に染まった。また、上記線ＬＪに０．２％のアフ
リカミドリザルの赤血球をかけたところ、吸着が起き、
Ｈ（血球凝集素）抗原が発現されていることが示された
。以上の２つの事実により、このＤＮＡ断片は５ＳＰＥ
−Ｈ遺伝子をコードすることが証明された。

〔発明の効果〕

本発明により得られる亜急性硬化性全脳炎（ＳＳＰＥ）
ウィルスのヘマグルチニン蛋白質（Ｈ蛋白質）のｃＤＮ
＾は、ワクチニアウィルス等に組込んで組換ウイ／Ｌ／
スを作製する方法、又はこれらの遺伝子を大腸菌、酵母
又は動物細胞中で発現せしめて５ＳＰＥウイルスの抗原
蛋白質を製造する方法において、遺伝子操作の出発材料
として有用である。

【図面の簡単な説明】 第１図はプラスミド、Ｉ））Ｉ−Ｓ　Ｓ　Ｐ　ＥＶ＋沖
のｃＤＮＡ挿入部の制限酵素地図を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、亜急性硬化性全脳炎（ＳＳＰＥ）ウィルスのヘマグ
   ルチニン蛋白質（Ｈ蛋白質）の全部又は一部をコードす
   る遺伝子。 ２、ｃＤＮＡである特許請求の範囲第１項に記載の遺伝
   子。