JPS63142000A

JPS63142000A - モノクロナ−ル抗体

Info

Publication number: JPS63142000A
Application number: JP61287822A
Authority: JP
Inventors: Shigeru Hoshiko; 繁星子; Chuhei Nojiri; 宙平野尻; Ariko Satou; 佐藤　愛理子; Kozo Nagaoka; 長岡　行蔵
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1986-12-04
Filing date: 1986-12-04
Publication date: 1988-06-14

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ル！上０科刑匁肚本発明は、インター７エロンーγの精製や定量１こ有用
な抗インターフェロン−７モノクローナル抗体に関する
。

従来の技術ヒトリンパ球から得られるインターフェロン−γあるい
は組換えＤＮＡ技術により得られる非グリコジル化イン
ターフェロン−γでマウスを免疫し、得られる肺細胞と
マウスの骨髄腫細胞とを融合させて得られるハイブリド
ーマを用いて抗インター７エロンーγモアクローナル抗
体を製造することは公知である０例えばＮａｔｕｒｅ、
　２９６．２５８　（１９８２）＝　ＥＭＢＯＪ、、　
２．１５２７（１９Ｓ３）−Ｊ、　Ｂｉ。

１、　Ｃｈｅｗ、、　２５９（７）−４３０１（１９８
４）−Ｊ、　ｌ＋ｎｕｎｏｌ、。

叱λ（３）、　１３００（１９８４）などがある。

明が　決しようとする、　α 天然あるいは組換えインターフェロン−γの確実な評価
および薬剤の開発のため、優れた精製手段および簡便で
高精度の定量法が求められている。

「　σを解決するための　段本発明者らは特開昭６１−１３９５に記載の方法で製造
した非グリコジル化インターフェロン−７（以下ｒＩＮ
Ｆ−γと略す。）について精製、定量などに使えるモノ
クローナル抗体を得るべく研究した。

その結果、ｒＩＮＦ−γでマウスを免疫して得られる肺
細胞とマウスの骨髄腫細胞とを通常の方法で融合させて
得られるハイブリドーマが、該ｒｌ″　ＮＦ−７に対し
て反応するのみならず、天然由来のグリコジル化インタ
ー７エロンーγ（以下ｎ１ＮＦ−γと略す、）に対して
反応するモノクローナル抗体を生成し、該モノクローナ
ル抗体はその精製、定量に使用することができることを
見出し本発明を完膚した。以下１本発明の詳細な説明す
る。

本発明のモノクローナル抗体の製造は次のとおり行う。

（１）免疫化動物細胞の調製マウスを前記ｒｌＮＦ−γで免疫して、そのマウスから
肺細胞を調製する。ｒＩＮＦ　　７は特開昭６１−１３
９５中のＥ、　Ｃｏｌ　１（ｐＥＣ２４８）が製造した
ものを使用する。免疫の方法は４週令のマウスの皮下。

あるいは腹腔内に７０インドの完全アジュバントあるい
は食塩水とともにｒＩＮＦ−１を２５〜４００μｇ／匹
を投与する。３週目、４週目、６週目と４回投与する。

（２）骨髄腫細胞の調製骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使
用する。たとえば、８−７ザグアニン耐性マウス（ＢＡ
ＬＢ／Ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３−八ｇ８−０
１　（Ｐ　３　Ｕ　１　）［Ｃｕｒｒｅｎｔ　ｔｏｐｉ
ｃｓｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ＩＩＩ
ｌｍｕｎｏｌｏｇｙ　８１　１−７（１９７Ｂ）　）な
どが用いられる。

（３）　細胞融合融合試験は最後の免疫のための注射の後３日、目に実行
される。即ち、３日後に肺臓を摘出し、＃細胞を調整す
る。ハイブリドーマ生産のために使われる基本的方法は
Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ＋Ｃｏ１ｄ
　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ＋　Ｎｅｗ　
Ｙｏｒｋ（１９８０）に述べられている方法と同じであ
る。

（４）　モノクローナル抗体の調製モノクローナル抗体の大量スケールの生産のため、８−
１１週令マウスに２．６．１０．１４−テトラメチルペ
ンタデカンの０，４ｘｌが腹腔内に注射され。

その７日後にｌＸｌ０’ハイブリドーマ細胞が注射され
る。１０〜３０日後腹水を集め、遠心分離して固形分を
除き、　Ａｆｒｉｇｅｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａの７フイ
ニテイークロマトグラフイーによって上澄から純化され
た。抗体のイソタイプ、サブクラスの決定は０ｕｃｈｔ
ｅｒ−１ｏｎｙ法（免疫学実験入門、生物化学実験法１
５゜学会出版センター刊、　Ｐ７４．１９８１年）によ
って行う、かくして、ＩＦＮＧ−３，ＩＦＮＧ−５，Ｉ
ＰＮＧ−７と命名したハイプリドーマ株から得られるモ
ノクローナル抗体ＩＦＮＧ−３，ＩＦＮＧ−５及びＩＰ
ＮＧ−７はＩｇ（ｖｌに属することを同定した。

］実施例　１１（１）免疫マウス牌細胞の調製２匹のＢＡＬＢ／Ｃマウスが２種の融合試験のため免疫
された。抗原として前記ｒＩＮＦ−７を使用し、下記の
スケジュールに従って２匹の４週令メスＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ
／Ｃマウスが免疫された。

３日目　　　４　　２５（１，Ｐ、）　　　２００（１
，Ｐ、）ｓａｌｉｎｅ　　　　　５ａｌｉｎｅＳ−Ｃ−：痔下注射１、　Ｐ、　：腹腔内注射ＦＣＡ、：　７０インドの完全な７ジユバント融合試験
は最後の注射の３日目に実行された。

（２）細胞融合肺臓をＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４０（日永製薬）培地中に粉
砕した。その細胞を遠心分離（１０分間＊　２００Ｘｇ
）で集め。

ＲＰＭ１１６４０倍地で洗った。一方、８−７ザグアニ
ン耐性マウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｕ１を培地（ＲＰＭ　Ｉ　
−１６４０１：１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清トｌＯ＃ｇ
／ｍｇ８−７ザグ７ニンを加えた培地）に培養した細胞
を融合に用いた。Ｐ３Ｕ１ミエローマは遠心分離によっ
て集められ、冷えたＲＰＭ１１６４０で洗った。

免疫した肺臓細胞とＰ３Ｕ１ミエローマを（２〜４Ｘ１
０’）：　（２〜４Ｘ１０’）の割合で混合し遠心分離
（２００Ｘｇ、　１０分間ルな。細胞ベレットに５０％
（Ｗ／゛Ｖ）ポリエチレングリフール１０００を含むＲ
ＰＭ１１６４０溶液１０ｉｉ１が滴下され、室温で６分
間混合した。その混合細胞は遠心分離（２００Ｘｇ、　
１０分間）で集められた。１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清
含有ＲＰＭＩＩ６４０の２４ａ（ｌを加え、よく混合し
た。（１−２Ｘ１０５）ミニｏ　−ｖｃｅｌｌｓ／ｚｌ
細胞サスヘンシタン２す１を１０％（■ハ）牛胎児血清
を含む１８Ｒ１のＲＰＭ１１６４０で除々に希釈した。

（１−２Ｘ１０’および１−２Ｘ１０３ミエローマｃｅ
ｌｌｓ／ｚ１）。これら希釈した細胞懸濁液は前もって
準備された４退会ＢＡＬＢ／Ｃマウスの肺臓及び胸腺由
来の供給細胞（ｆｅｅｄ−ｅｒ　ｃｅｌｌ）（２Ｘｌ０
５）と混合した。この懸濁液の１００μρが２つの９６
穴ウエルプレートのウェルに展開された。５％ＣＯ２，
３７℃、湿度９５％で３日間培養した。３口径１０％牛
脂児血清、　１３．６μｇ／ｘρヒポキサンチン及び３
．９μｓ／ｊ１チミジンを含むＲＰＭ１１６４０培地（
以下ＲＰＭ１１６４０−ＨＡＴ培地と略す）の１００μ
βがウェルに加えられた。そρ後毎日培地の半量が新鮮
なＲＰＭ１１６４０−ＨＡＴ培地１００μｇで置き換え
られた。

（３）ハイブリドーマのクローニングと抗体産生１０〜
１４後、各ウェルの培養液の上ｉ■について。

酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって各ウェルの関連
抗体のテストを行った。０．ＩＭ　ＮａＨＣＯ−−Ｎａ
ｚＣＯ＊（＋）Ｈ９，Ｏ）緩衝液にｒＩＦＮ−７１μｇ
／ｘｌ’ｒｊ解し、その溶液の１００μｐがＥＬＩＳＡ
のため前期９６穴ウエルプレートに加えられ、３時間。

３７℃反応後、その溶液は捨てられた。ウェルには３％
牛血清アルブミンを入れたＴＢＳ（２０ｍＭＴｒｉｓ　
　ＨＣＬ　ｐＨ７，５ｔ　５００＋ａＭ　ＮａＣ１）２
００μ（を入れ１５時間、１５℃でブロックした。この
プレートはＥＬＩＳＡの標準法に従って抗ｒＩＮＦ−７
抗体の検出のために使われた。陽性ウェル中のハイブリ
ドーマはＲＰＭ１１６４０−ＨＡＴ培地を入れたＦａｌ
ｃｏｎ２４ウェルプレートに拡大した。そこでマイクロ
スコープにより手捏作でクローン化された。

抗体価の認められた細胞について、限界希釈法によりク
ローニングを２〜４回繰り返し、抗インター７エロンー
γモノクローナ抗体産生ハイブリドーマ株として選択す
る。

（４）モノクローナル抗体の調製モノクローナル抗体の大量生産のため、ａ−ｔｔ週令マ
ウスに２．６．１０．１４テトラメチルペンタデカンの
０．４ｘ１が腹腔内に注射された。７口径ｌＸｌ０’バ
イプリドーマ細胞が注射された。１４日から２６日後そ
の腹水液が集められ、４００００Ｘｇ、　２０分間遠心
分離した。そのモノクローナル抗体は７フイデルフロテ
インＡ７フイニテイークロマトグラフイーによって上澄
から純化された。

（５）確立されたハイブリドーマセルライン上記（１）
〜（４）までの実験で７ウスＡと７ウスＢの２匹のマウ
スを使用した。これら２匹を免疫後はその血清はｒｌＦ
Ｎ−７１１１３／ｘｌと１＝３５０００（マウスＡ）、
　１　：　７０００（マウスＢ）の希釈で反応した。こ
の２つの肺臓は独立した融合試験のために使われた。最
終的にｒＩＮＦ−γに対するモノクローナル抗体を産生
する２２のハイブリドーマセルラインがクローン化され
確立された。このうちバイブリド−ｖＮｏ　　ＩＦＮＧ
−３，ＩＰＮＧ−５、ＩＦＮ（’、−７の生産するモノ
クローナル抗体がヒ）　＋７ンバ球由米の天然型インタ
ーフェロン−γ（１，８Ｘ１０’単位／ｌ１１８蛋白）
　（Ｍｅｌｏｙ　Ｌａｂｓ。

より購入）に対しても反応し、がっ、ｒインターフェロ
ン−γを臭化シアン及び／又はペプシンで分解したペプ
チドには反応しないことが判明した。この性質は試薬と
しての有望性を示すものである。

また免疫グロブリンクラスはＩｇＧ、であることがｆ１
明した０表１にハイブリドーマＩＦＮＣ，１−２２が生
産するモノクローナル抗体の免疫グロブリンクラス、ペ
プチド、天然型インター７エイロンーγとの反応性につ
いて示す。

表１．ｒインターフェロン−７に対するモノクローナル
抗体の性質バイブ　免疫グロブ　力価　反応性　天然型リドーマ　
リンクラス（＊　１　）ペプチドインター（＊２）７二
ロＩＦＮＧ−２Ｍ１２８　　　＋　　　＋ＩＦＮＧ−３Ｇ
ｌ　　　８１９２　　−　　　＋ＩＦＮＧ−４Ｇｌ　　
　２０４８−− ＩＦＮＧ−５Ｇ１　　３２７６８　　−　　　＋ＩＦＮ
Ｃ−６Ｍ　　　　１０２４　　　＋＋（弱い）ＩＦＮＧ
−７Ｇ１　　３２７６８　　−　　　＋ＩＦＮに　　８
　　　　Ｇ２ａ　　　２０４Ｓ　　Ｎ、Ｄ、　　−ＩＦ
Ｎ［ｌ；−９Ｍ　　　　　２５６　　−　　　＋（弱い
）ＩＦＮＧ−１ｏ　　　　　Ｇ　１　　　　８１９２　
　　　＋　　　　＋ＩＦＮＧ−１１Ｇｌ　　　８１９２
　　−　　−ＩＦＮＧ−１２（ｉ　１　　　４０９６　
　　＋　　　＋ＩＦＮＧ−１，３Ａ　　２０４８　＋　
十ＩＦＮＧ−１４に　１　　　４０９６　　−　　−Ｉ
ＦＮＧ−１５Ｇ１３２７６８　＋　＋ＩＦＮＧ−１６Ｍ
３２　　　＋　　　＋［ＦＫ−１７Ｇ　１　　３２７６
８　　　＋　　　＋ＩＦＮ（ニー１８　　　　Ｇｌ　　
　　　６４　　−　　　一応性、Ｎ、Ｄ、：測定されな
かった。

［実施例２］　　ｒ−インター７エイロンー７の定量ｒ
ＩＮＦ−γ分子の定量分析のため、サンドイッチＥＬＩ
ＳＡを開発した。プラスチック９６ウエルマイクロタイ
タープレートがウサギ抗「インターフェロン−γ−１８
Ｇ３３μｇ７ｘｉを含むＰＢＳで２５℃、１６時間コー
トされた。そのプレートはＰＢＳ（０，０１８ｐｈｏｓ
ｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ、　ｐＨ７，（Ｌ　０．１５
ＭＮａＣｌ　）で２度洗われ、さらに非特異的反応範囲
をシールするため３％（Ｉｌｌ／Ｖ）牛血清アルブミン
を含むＰＢＳ中に４℃、１６時間インキュベートされた
。

０．１％（Ｖハ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰ　Ｂ　Ｓ　（
Ｐ　Ｂ　Ｓ　−Ｔｗｅｅｎと以下略す、）で２度洗った
後「インターフェロン−γを含む１００μｌのサンプル
が１５℃、１６時間インキュベートされた。そのサンプ
ルが捨てられ、そのプレートは２度Ｐ　Ｂ　Ｓ−Ｔｗｅ
ｅｎで洗われた６１％牛血清フルプミンを含むＰＢＳ中
の１００μｅの抗「インタ−７エロンーγモノクローナ
ル抗体が加えられ、３７℃、３時間インキュベートされ
た。２度Ｐ　Ｂ　Ｓ−Ｔｗｅｅｎで洗った後、ＰＯＤ（
ペルオキシダーゼ）結合抗マウスＩｇＧ（ヤギ）の１０
０μｐを適当な希釈比率でウェルに加えた。そのプレー
トは３７℃、３時間でインキエベートされた。ＰＢＳ−
Ｔｗｅｅｎで２度洗った後、その酵素反応は０−７二二
レンジアミンを使った標準プロシコールによって行われ
た。　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　
Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ、　　Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａ
ｒｂｏｒ。

Ｎ　ｅｗ　Ｙ　ｏｒｋ（１９８０）参照。

要約するとウサギ抗「インタ−７エロンーγポリクロー
ナル抗体を第１抗体として使い、ｍｌ抗体によって結合
されたｒインターフェロン−γは＃４２抗体としての「
インタ−７エロンーγモノクローナル抗体と酵素結合抗
マウス免疫グロブリンによって検出するのである。第１
図はＩＦＮＧ−５モノクロ一ナル抗体とＰＯＤ結合抗マ
ウスＩｇＧとのカップリングから得られた標準力価カー
ブを示している。ｒインター７エロンー７は５　ｎｇ／
ｍｌの濃度で検出できる。

［実施例３］　　ｒ−インターフェロン−γに対する結
合プロフィール２２の抗体の大部分はｐＨ３，５−１２でｒインターフ
ェロン−γを結合している。しかしＩＦＮＧ−１４のモ
ノクローナル抗体はｐＨ４，０以下ｐＨ９，５以上で結
合しない、第２図の（ａ）はＩＦＮＧ−１４生産のモノ
クローナル抗体に対する結合のｐｔ−ｉプロフィールで
ある。第２図の（ｂ）はｔＦＮＧ−５生産のモノクロー
ナル抗体に対する結合のｐＨブｏフィールである。

４シを米本発明のモノクローナル抗体を用−１で組み換えインタ
ー７エロンーγのみならず天然型ンター７エロンー７を
効率よく定量し、精製することができろ。

【図面の簡単な説明】

第１図；ｒインターフェロン−γの含有量と〇−フェニ
レンノアミンを基質としたペルオキシダーゼによろ４９
２ｎ論の吸光度の関係を示す。第２図；（ａ）はＩＦＮＧ−１４生産モノクロ一ナル抗体のｒイ
ンターフェロン−７との結合率とｐＨの関係を示す。（１，）はＩＦＮＧ−５生産モノクロ一ナル抗体のｒイ
ンター７エロンーγとの結合率とｐＨの関係を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）天然および組換えインターフェロン−γと反応す
る抗インターフェロン−γモノクローナル抗体。
（２）天然および組換えインターフェロン−γと反応す
るが、臭化シアンまたは／及びペプシンによって分解さ
れたインターフェロン−γとは反応しない特許請求の範
囲第１項記載の抗インターフェロン−γモノクローナル
抗体。