JPS63139134A

JPS63139134A - Ｔ細胞活性化剤

Info

Publication number: JPS63139134A
Application number: JP61287211A
Authority: JP
Inventors: Yoshiharu Yokoo; 義春横尾; Motoo Yamazaki; 基生山崎; Koyuki Ogawa; 小川　こゆき; Makoto Morimoto; 森本　眞; Masami Okabe; 正実岡部
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1986-12-02
Filing date: 1986-12-02
Publication date: 1988-06-10

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明はＴ細胞活性化剤、特にインターロイキン−２誘
導剤に関する。

従来の技術およびその問題点Ｔ細胞活性化因子は従来インターロイキン１（Ｉ　Ｌ　
−１）　　ｌ：Ｍｉｚｅｌ、Ｓ、　Ｂ、　ｅｔ　ａｌ、
、　　ジャーナル・オブ・イムノロシイ（Ｊ、Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ、）、　１２０゜１４９７〜１５０３　（１９７
Ｂ）　）　、インターロイキン２（Ｉ　Ｌ　−２）　［
：Ｇ１１ｌｉｓ、　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　［ｍ
ｍｕｎｏｌ、。

皿２０２７〜２０３２　（１９７８）：］などが知られ
ている。

ＩＬ−２は腫瘍抗原に対する抗原特異的Ｔ細胞を増殖さ
せるものであり、かかるＴ細胞は腫瘍の成長を抑制する
ので腫瘍治療に有効である［：Ｇ１１ｌｉｓ、　Ｓ、ｅ
ｔ　ａｌ、、ネーチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）。

２６８、１５５　（１９７７）　〕、また、ＩＬ−２は
Ｔ−インターフェロンの産生を誘発し、ナチュラルキラ
ー細胞を活性化することが知られている（Ｗｅｉｇｅｎ
ｔ、　Ｄ、　Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、インフェクション・
アンドーイミュ−’−イティ（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａ
ｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）。

９９２〜９９７　（１９８３））。

さらに、ＩＬ−２は、免疫系の機能障害に関する病気、
たとえばエイズ（ＡＩＤＳ）をはじめとする免疫不全症
、多発性硬化症および関節リューマチ症の治療に有用で
ある〔Ｒｏｏｋ、　Ａ、　Ｈｌｅｔａｌ、ジャーナル・
イムノロシイ（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）。

旦ム　（３）、　１５０３〜１５０７　（１９８５）／
Ｐｈａｄｋｅ、　Ｋ、ｅｔａｌ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ、、　１３６．　　（１１）、　４０８５〜４０９
１（１９８６）　）。

一方、ＩＬ−１には、様々な作用があるが、その１つに
はヘルパーＴ細胞に働きＩＬ−２産生を促す作用がある
（Ｇｉｌｌｉｓ、　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、、プロシーディ
ング・オブ・ザ・ナショナル・アヵデミイ・オブ・サイ
エンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、）、　　７８．１１３３　（１９８１）　）。

さらには、腫瘍細胞に直接的な抗腫瘍作用を有する〔０
ｎｏｚａｋｉ。

Ｋ、　ｅｔ　ａｌ、、ジャーナル・オブ・イムノロシイ
（Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、）、　　１３５．３９６２
　（１９８５）：］ことが知られている。したがって、
Ｔ細胞活性化因子は抗腫瘍剤としての可能性を有するも
のとしても注目されている。

種々の細胞（線維芽細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞等）の培養」
１清より新規なＴ細胞活性化因子を得るべく研究を重ね
た結果、ヒストン８２Ｂの部分構造を有するＴ細胞活性
化因子が発見された。

この事実をもとに、ヒストン関連物質について研究した
ところ、ヒストン８２Ｂが特異的ニＴ細胞活性化能を有
し、さらにＩＬ−２誘導能も有することを発見し、本発
明に至った。

ヒストン８２Ｂは染色体蛋白質であり、従来その生理学
的な意味が知られていなかったが、最近胸腺因子ＨＴＨ
ａがヒストン８２Ｂと同一蛋白質であることが明らかに
され、ヒストンＨ２Ｂのホルモン医薬としての用途が示
唆された（ＷＯ８５／　３００３−Ａ１．１９８５）。

一般的にＴ細胞活性化能を有する物質、例えばＩＬ−１
などは発熱を伴なうことが知られ、臨床上の１つの欠点
とされている。ところが、本物質は発熱性が著しく低い
ことがわかった。

問題点を解決するための手段本発明に係る哺乳動物のＴ細胞活性化剤は哺乳動物由来
のヒストン８２　Ｂを含有することを特徴とする。本発
明に係るＴ細胞活性化剤は有効量の哺乳動物由来のヒス
トン８２Ｂ及び製剤添加剤よりなる。

ヒストン８２　Ｂは哺乳動物由来のものであればいかな
るものでもよく、ヒト、ウシ、マウス等のヒストン８２
Ｂが例示される。哺乳動物のヒストン８２Ｂとしては以
下のアミノ酸配列（Ａ）を有するもの、及びそのアミノ
酸配列の一部が変化したものが知られており、いずれも
本発明に使用できる：Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−へ
ｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−８ｅｒ−八ｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｙ
ｓ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖａ　１−１１　ｉ　ｓ−Ｐ　ｒ　ｏ−
Ａｓ　ｐ−Ｔｈｒ−Ｇ　！　ｙ−Ｉ　］　］ｅ−８ｅｒ
−８ｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｍｅ　ｔ−Ｇ　］　ｙ−１
１ｅ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−３ｅ　ｒ−Ｐｈ　ｅ−Ｖａ　Ｉ
−Ａｓｎ−Ａｓｐ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｇ　ｌｕ−Ａｒｇ
−１］　ｅ−Ａ　］　ａ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｇ　］　］ｕ−
八ｌへ−３ｅｒ−Ａｒｇ−ＬｅｕＡｌａ−Ｈｉｓ−Ｔｙ
ｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−八ｒｇ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−１１ｅ
−Ｔｈｒ−３ｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｇｌｎ−
Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−八ｒｇ−Ｖａ　１−３ｅｒ−
Ｇ　］　ｕ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｔｈ　ｒ−Ｌｙｓ−Ａ　ｌ　
ａ−Ｖａ　ｌ　−Ｔｈ　ｒ−Ｌ　ｙｓ−Ｔ　ｙ　ｒ−Ｔ
ｈｒ−５ｅｒ−３ｅｒ−Ｌｙｓ −上記アミノ酸配列のヒストン８２Ｂはヒト、ウシ、マ
ウスのヒストン８２Ｂとして通常に見い出されるもの一
メジャー成分−である〔日本生化学全組生化学データブ
ック〔１〕、■東京化学同人、２８４　（１９７９）　
）。−１−記アミノ酸配列の一部が変化したヒストン８
２Ｂ−マイナー成分−とじては２，３５，９３．１１２
及び１１３位がそれぞれＧｌｎ、　Ｇｉｎ、　Ｇｉｎ、
　ＧＩＸ及びＳｅｒに置換し、２４位のしｙｓを欠失し
、１１６位のＬｙｓＯ後にＬｙｓを挿入し、１６−１９
位をＡｌａ−Ｖａ１４ｈｒ−Ｌｙｓとした置換体が知ら
れている（前掲生化学データブック）。又ヒトに由来す
る上記メジャー成分のヒストン８２Ｂの３９及び１２４
位をそれぞれＩｌｅ及びＡｌａ　とした置換体が知られ
ている〔Ｏｈｅ、Ｙ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、、　８５゜６１５〜６２４　（１９７９）　）
。さらに上記メジャー成分のマウスヒストン８２　Ｂの
７５位をＳｅｔ　とした置換体が知られているＣ３．　
Ｇ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ　　ａｎｄＡ、　Ｚｗｅｉｄｌｅ
ｒ、　Ｎａｔｕｒｅ、　　２６６、２７３　（１９７７
）　）。

ヒトヒストン８２　Ｂは［：Ｏｈｅ、Ｙ、ｅｔ　ａｌ、
、　Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　８５，６１５−６２４　（１９７
９）：］に従って取得することができる。又、ウシヒス
トン８２ＢはＣＪｏｈｎｓ、　Ｅ、Ｉｌｌ、　ｅｔ　ａ
ｌｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、、　９２．５５゜（１
９６４）　ｌ：ｌに従って取得することができる。

他の哺乳動物由来のヒストン８２　Ｂもこれらと同様の
手法で得ることができろ。

ヒストン８２Ｂ取得の際、メジャー成分とマイナー成分
は通常混合物として得られるが、これらは通常特に分離
することなく用いることができる。又、ウシヒストン８
２Ｂは市販されており、これを用いてもよい。

本Ｔ細胞活性化剤は種々の製剤形態、例えば、注射剤、
帯列、経鼻剤等として用いることができ、各製剤形態に
応じて適当な製剤添加剤が単独又は組合せで使用される
。

注射剤の調製に当っては、溶剤（水、生理食塩水）、可
溶化剤（アルブミン、アミノ酸類、糖類、塩化す）　Ｉ
Ｊウム等）、等張化剤（塩化ナトリウム、グルコース等
）、保存剤（クレゾール、ｐ−オキシ安息香酸エステル
、クロロブタノール等）、抗酸化剤（アスコルビン酸、
ピロ亜硫酸す）　ＩＪウム等）　、ｐＨ調整剤（塩酸、
リン酸、水酸化ナトリウム等）、無痛化剤（塩酸プロ力
イン、塩酸リドカイン、ベンジルアルコール等）等が常
法により用いられる。

注射剤中のヒストン８２Ｂの含量は２０〜５０ｍ１中に
０．００１〜２０ｍｇが適当である。

帯列の調製に当っては、帯剣基剤〔例えば、マクロゴー
ル類、グリセロゼラチン、カカオ脂、１１１ｉｔｅｐｓ
ｏ１基剤（Ｄｙｎａｍｉｔ　Ｎｏｂｅｌ　ＡＢ社）等〕
、吸収促進剤（胆汁酸塩、脂肪酸類、界面活性剤類、エ
ナミン類等）等が常法により用いられる。

経鼻剤の調製に当っては、溶剤（水、生理食塩水）、可
溶化剤（アルブミン、アミノ酸類、糖類、塩化ナトリウ
ム等）、保存剤（クレゾール、ｐ−オキシ安息香酸、ク
ロロブタノール等）、抗酸化剤（アスコルビン酸、ピロ
亜硫酸ナトリウム等）、吸収促進剤（サポニン、グリコ
ール酸ナトリウム、非イオン界面活性剤、シクロデキス
トリン等）等が常法により用いられる。

本Ｔ細胞活性化剤はヒトを含む哺乳動物のインターロイ
キン−２誘導を含むＴ細胞活性化のために用いることが
できる。

インターロイキン−２誘導作用から水剤は抗腫瘍剤とし
ての使用が期待される。すなわち急性リンパ性白血病、
急性骨髄性白血病、腎癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨
髄性白血病、乳癌、胃癌、肝癌、結腸癌、直腸癌、肺癌
、膵癌、子宮頚癌、子宮体癌、頭頚部腫瘍、膀胱癌等へ
の抗腫瘍剤としての使用が期待される。

本Ｔ細胞活性化剤はＴ細胞活性化作用に基づき、又放射
線障害防止剤、免疫不全治療剤、抗炎症剤（リューマチ
、関節炎治療）としても有用であると期待される。

Ｔ細胞活性化、抗腫瘍、放射線障害防止、免疫不全治療
、抗炎症のための本Ｔ細胞活性化剤の投与量はヒト等の
種、年令、症状、投与形態等により異なるが、通常ヒト
を含む哺乳動物に対し注射もしくは点鼻の場合０．０１
μｇ／ｋｇ／ｄａ、ｙ〜１　ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ　、特
に０．１−１００μｇ／ｋｇ／ｃｌａｙ　、直腸投与の
場合０．１　μｇ／ｋｇ／ｄａｙ　〜１０ｍｇ／ｋｇ／
ｄａｙ　、特に０．１μｇ／ｋｇ／ｃｌａｙ　−１＋ｎ
ｇ／ｋｇ／ｄａｙが適当である。投与方法も症状や投与
量によって変えることができるが、例えば１日１回連日
投与；１日１回９日間投与後５日間体薬等の方法をとる
ことができる。

吐乳動物のヒストン８２Ｂは発熱性が著しく低いので、
本Ｔ細胞活性化剤は臨床上有利に使用できる。

実施例次にヒストン８２Ｂの薬理データを示す。

実験例１゜Ｔ細胞活性化能ウシヒスト：／　Ｈ１（Ｈｉｓｔｏｎｅ　Ｔｙｐｅ　　
Ｖ−３。

シグマ社製）、ウシヒストンＨ２Ａ　（ｌｌｉｓｔｏｎ
ｅＴｙｐｅ　　■−Ｓ、　　シグマ社製）、ウシヒスト
ンＨ２Ｂ　（Ｈｉｓｔｏｎｅ　Ｔｙｐｅ　　■−８．シ
グマ社製）、ウシヒストンＨ３（Ｈｉｓｔｏｎｅ　Ｔｙ
ｐｅ　　■−８．シグマ社製）及びウシヒストンＨ４（
Ｏｇａｗａ、　Ｙ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂ、Ｃ，、２４４，４３８７（１
９６９）に従って調製〕のＴ細胞　活性化能を等厚の方
法〔臨床検査嬰（３）、　３２Ｂ　（１９８４）’］に
準じて評価した。すなわち４〜６週令のＣ３Ｈ／Ｈｅマ
ウスの胸腺細胞を１０％子牛脂児血ｒｆｆ（ＦＣ３）（
ギブコ社製）およびコンカナバリンＡ　（Ｃｏｎ　Ａ）
　０．５〜１．０μｇ／ｍｌを加えたＲＰＭＩ−１６４
０培地（日木製薬社製）に１〜２　Ｘ　１０７細胞／ｍ
ｆｌの濃度で懸濁させる。この胸腺細胞懸濁液０．１ｍ
ｌおよびＰＢＳで適当濃度に希釈した上記各ウシヒスト
ン各０，１ｍｌを９６穴マイクロプレートの各ウェルに
入れ、これを５％炭酸ガス含有空気中、３７℃で４８時
間培養する。０．２５μＣｉの３Ｈ−チミジンヲ各ウェ
ルにパルスラベルして、３白目に細胞を回収する。３Ｈ
−チミジンの導入は続く液体シンチレーション計数によ
り計測する。

測定結果としての各ヒストン量（ｍｇ）と３Ｈ−チミジ
ン取込量（ｃｐｍ）との関係を第１図に示す。第１図か
らヒストン８２　Ｂのみが実質的なチミジン取込を示し
、Ｔ細胞活性化能を有することが明らかである。

又、ヒストン）１２Ｂの比活性は約５×１０６単位／ｍ
ｇ蛋白であった。ここで活性は胸腺細胞による〔３Ｈ〕
−チミジンの最大取込量の５０％を生じさせる能力を１
単位とし、これに試料の希釈倍率を乗する方法で表す。

又、比活性は、ブラッドフォードの方法［：Ｂｒａｄｆ
ｏｒｄ、　Ｎ、　Ｍ、、ｅｔａｌ、、アナリティカルバ
イオケミス）　ＩＪ　（Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、７２　、２４８．　　（１９７６
）〕または、〕５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲの銀染色
からの蛋白質定量値を基に、前述の方法で算出した活性
（単位数）をこの定量値で割った値で表す。

実験例２゜ＩＬ−２誘導活性ウシヒストン１］２Ｂ並びに対照ヒストンとしてヒスト
ン８２Ｂと相同性が認められるウシヒストンＨ２Ａに対
して、ヒト白血病株Ｈ３Ｂ。

２細胞を用いる方法〔Ｋａｓａｈａｒａ、Ｔ、　ｅｔ　
ａｌ、、　　ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ、Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ、）、１３４、１６８２　（１９８６）〕
に準じて、活性を評価した。

すなわち、ヒト白血病細胞株Ｈ３Ｂ、２細胞（Ｋａｓａ
ｈａｒａ、Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ
、、１３４．１６８２（１９８６）：］　１０６細胞／
ｍβを５０ｍｇ／ｍｊ！のフィトヘマグルチニン（ＰＨ
Δ）存在下、上記各ヒストンのＰＢＳ溶液を加え２４時
間培養し、培養土清中のＩＬ２活性を測定した。ＩＬ−
２活性はＩＬ−２依存性キラ−Ｔ細胞株を用い冊て、〔３Ｈ〕−チミジンの取り込み量として測定した。

第１表に結果を示した。第１表より、ウシヒストン８２
ＢにはＩ　Ｌ　、−２誘導能が認められるがウシヒスト
ンＨ２Ａは高濃度においてもＩＬ−２誘導能がＳ忍めら
れないことが分る。

第　　　１　　　表実験例３゜発熱性体重２．１〜２．５　ｋｇの雄性ウサギの中で、試料投
与前の体温が３８５〜３９．８℃の範囲にあって、更に
、体温を１時間間隔て３回測定し、第２回および第３回
の測定体温の差が０．２℃以下のウサギを１群３羽用い
た。試料はウシヒストン８２Ｂを生理食塩水に溶解して
１ｍｊ２／ｋｇを静脈内投与した。

試料投与後、１時間間隔で３回測定し、試料投与前第３
回目の体温（対照体温）と投与後の最高体温との差を体
温上昇値とし、発熱性の判定は３羽の体温上昇の平均値
が０．６℃以上のとき陽性（十）とした。

ウシヒストン８２Ｂの発熱性試験の結果を第２表に示す
。

第　　　　２　　　　表第１表より、蛋白重量基準でウシヒストン８２ＢとＴ細
胞活性化因子ＩＬ−１βとは発熱性において１００倍以
上の差が認められた。

実験例４゜毒性（ＬＤｓｏ）ＬＤｓｏは８週令の雄性ＢＡＩ、Ｂ　／　Ｃマウスにウ
シヒストン８２Ｂを生理食塩水に溶かして１回静注し、
１群６匹のマウスの投与後３０日間の生死を観察し、各
投与群の死亡率より、Ｌｉｔｃｈｆ　１ｅｌｄＷｉｌｃ
ｏｘｏｎ法（Ｌｉｔｃｈｆｉｅｌｄ　Ｊ、　Ｔ、　＆　
Ｗｉｌｃｏｘｏｎ。

Ｖｌ、　Ｆ、Ｊ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　ＢＸｐｔｌ
、Ｔｈｅｒａｐ、、　　９６゜９９　（１９４９）　）
により算出した結果、７９．３ｍｇ／ｋｇであった。

実施例１゜ウシヒストン８２Ｂ　　０．２ｇ及び精製ヒト血清アル
ブミン２ｇを注射用蒸留水に溶解し全量を２０１とする
。無菌濾過後、５ｍずつ褐色バイアルに分注し常法によ
り凍結乾燥し、５０■／ｖｉａｌの凍結乾燥製剤を得る
。この製剤は哺乳動物のＴ細胞活性化に用いることがで
きる。

【図面の簡単な説明】

第１図は各種ヒストンＨのＴ細胞活性化能をマウス胸腺
細胞のチミジン取込量（ｃｐｍ）で表し、それとヒスト
ンＨの量との関係を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）哺乳動物由来のヒストンＨ２Ｂを含有してなる哺
乳動物のＴ細胞活性化剤。
（２）Ｔ細胞活性化がインターロイキン−２誘導である
特許請求の範囲第１項記載のＴ細胞活性化剤。