JPS63137674A - オキシダ−ゼの製造法 - Google Patents
オキシダ−ゼの製造法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
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- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は酵母がオキシダーゼを産生ずる条件下で酵母を
好気醗酵させ、所望の場合産生されたオキシダーゼを酵
母細胞から単離することｌこよるオキシダーゼの製造方
法に関する。
好気醗酵させ、所望の場合産生されたオキシダーゼを酵
母細胞から単離することｌこよるオキシダーゼの製造方
法に関する。
オキシダーゼはある基質の特異的酸化反応を触媒し、そ
れによってＨ２Ｏ２を産生ずる酵素である。
れによってＨ２Ｏ２を産生ずる酵素である。
うなメチロトローフ性酵母をメタノールに生育できるよ
うにするメタノールオキシダーゼ（ＭＯＸ ）である。
うにするメタノールオキシダーゼ（ＭＯＸ ）である。
ＭＯＸはメタノールをホルムアルデヒドおよび過酸化水
素に酸化触媒し、その間分子状酸素は電子受容体として
作用する。形成するホルムアルデヒドは異化作用に対し
使用されその間蟻酸に最後ｌこ二酸化炭素に変換し、又
は同化作用に対し使用され、その間細胞物質はモノリン
酸キシルロースを経て故意される。これらのそれ以上の
過程では他の酵素が重要な役割を演する二同化過程では
ジヒｒロキシアセトンシンテターゼは重要であり、異化
過程ではホルムアルデヒドデヒドロｒナーゼおよびホル
ミエートデヒドロデナーゼは鍵酵素である。オキシダー
ゼにより形成される過酸化水素はこれらの有機体に対し
非常ｌこ強い毒性があり、現在の技術状態に従って他の
酵素、すなわちカタラーゼにより直ちに無毒化される。
素に酸化触媒し、その間分子状酸素は電子受容体として
作用する。形成するホルムアルデヒドは異化作用に対し
使用されその間蟻酸に最後ｌこ二酸化炭素に変換し、又
は同化作用に対し使用され、その間細胞物質はモノリン
酸キシルロースを経て故意される。これらのそれ以上の
過程では他の酵素が重要な役割を演する二同化過程では
ジヒｒロキシアセトンシンテターゼは重要であり、異化
過程ではホルムアルデヒドデヒドロｒナーゼおよびホル
ミエートデヒドロデナーゼは鍵酵素である。オキシダー
ゼにより形成される過酸化水素はこれらの有機体に対し
非常ｌこ強い毒性があり、現在の技術状態に従って他の
酵素、すなわちカタラーゼにより直ちに無毒化される。
オキシダーゼの他の例は他のアルコールオキシダーゼ、
グルコースオキシダーゼ、グリセロールオキシダーゼ、
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、ア
ミンオキシダーゼ、アリールアルコールオキシダーゼ、
がラクトースオキシダーゼ、ソルボースオキシダーゼ、
尿酸オキシダーゼおよびキサンチンオキシダーゼである
。
グルコースオキシダーゼ、グリセロールオキシダーゼ、
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、ア
ミンオキシダーゼ、アリールアルコールオキシダーゼ、
がラクトースオキシダーゼ、ソルボースオキシダーゼ、
尿酸オキシダーゼおよびキサンチンオキシダーゼである
。
オキシダーゼは各種目的ｌこ対し使用できる。重要な使
用は洗浄および漂白分野にある。洗浄又は漂白処理中オ
キシダーゼの存在は同時にオキシダーゼｌこ対する適当
な基質が存在する場合その場所で過酸化水素を形成する
ことができる。過酸化水素は漂白剤活性を示しＴＡＥＤ
（テトラアセチルエチレンジアミン）のような漂白剤
前駆体と協力して過酸のような低温で活性である漂白剤
を形成することができる。洗浄剤又は漂白剤自体は過酸
化水素を含有しないが、洗浄又は漂白工程中その場所で
過酸化水素の形成を触媒する酵素のみを含むこの系の重
要な利点は貯蔵および輸送中ゾロテアーゼ、リパーゼな
どのような洗浄組成物成分の不よぴドイツ特許第２５５
７６２５号明細書に記載される。
用は洗浄および漂白分野にある。洗浄又は漂白処理中オ
キシダーゼの存在は同時にオキシダーゼｌこ対する適当
な基質が存在する場合その場所で過酸化水素を形成する
ことができる。過酸化水素は漂白剤活性を示しＴＡＥＤ
（テトラアセチルエチレンジアミン）のような漂白剤
前駆体と協力して過酸のような低温で活性である漂白剤
を形成することができる。洗浄剤又は漂白剤自体は過酸
化水素を含有しないが、洗浄又は漂白工程中その場所で
過酸化水素の形成を触媒する酵素のみを含むこの系の重
要な利点は貯蔵および輸送中ゾロテアーゼ、リパーゼな
どのような洗浄組成物成分の不よぴドイツ特許第２５５
７６２５号明細書に記載される。
オキシダーゼの別の使用は定性および／又は定食分析の
分野に、例えば醗酵液のような調査すべき系のアルコー
ル含量を測定するためにある。分析はパーオキシダーゼ
が触媒する着色物質の酸化によって形成される過酸化水
素の分析に基づく。
分野に、例えば醗酵液のような調査すべき系のアルコー
ル含量を測定するためにある。分析はパーオキシダーゼ
が触媒する着色物質の酸化によって形成される過酸化水
素の分析に基づく。
オキシダーゼは化学合成又は基質の酸化を触媒するため
に廃棄物の精製方法のわく組内で使用することもできる
。
に廃棄物の精製方法のわく組内で使用することもできる
。
これらの大部分の使用に対し疑いなく洗浄又は漂白組成
物の成分として、そして分析における助剤としての使用
に対し形成する過酸化水素を分解するカタラーゼをオキ
シダーゼが含まないことが非常に重要なことである。メ
タノール上で酵母の醗酵によるメタノールオキシダーゼ
（ＥＣ１、１，３，１３，）のような微生物学的に生産
されるオキシダーゼに関する周知の問題は、形成する過
酸化物をほとんど即刻分解し、従って有効な漂白剤活性
又は基質濃度の正確な分析を全く不可能にする天然カタ
ラーゼ酵素を常に随伴することである（ Ｖｓｅｎｈｕ
ｌｓ 、 Ｍ、 、ｖａｎ Ｄｉｊｋｅｎ １Ｊ、Ｐ、
およびＨａｒｄｅｒ、 Ｗ、 （１９８３）、［Ａｄｖ
ａｎｃｅｓ ｉｎＭｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ
ｏｇｙ Ｊ 、Ｒｏｓｅ 、 Ａ、Ｈ，、Ｇａｒｅｔｈ
Ｍｏｒｒｉｓ、Ｊ＋およびＴｅｍｐｅｓｔ 、 Ｄ、
Ｗｏ、編輯、２４巻、１〜８２頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ 、 ＮｅｗＹｏｒｋ）。生成物からカタラ
ーゼを大部分除去し又はこれを不活性化し、こうして活
性カタラーゼを実質的に含まないオキシダーゼを得る方
法は既知である（例えば英国特許第２１０１１６７号明
細書参照）ことは真実である。しかし、工業的適用に対
してはこれらの方法（例えばイオン交換クロマトグラフ
ィ又はゲル濾過によるカタラーゼ除去およびＶデシル硫
酸ソーダ（ｓｎｓ ）又はアジ化ソーダ（こよる処理ζ
こよるカタラーゼの不活性化など）は余りに高価にすぎ
、やっかいで、多くの場合不適当であり、又はアジ化ソ
ーダの場合毒性物質さえ導入される。
物の成分として、そして分析における助剤としての使用
に対し形成する過酸化水素を分解するカタラーゼをオキ
シダーゼが含まないことが非常に重要なことである。メ
タノール上で酵母の醗酵によるメタノールオキシダーゼ
（ＥＣ１、１，３，１３，）のような微生物学的に生産
されるオキシダーゼに関する周知の問題は、形成する過
酸化物をほとんど即刻分解し、従って有効な漂白剤活性
又は基質濃度の正確な分析を全く不可能にする天然カタ
ラーゼ酵素を常に随伴することである（ Ｖｓｅｎｈｕ
ｌｓ 、 Ｍ、 、ｖａｎ Ｄｉｊｋｅｎ １Ｊ、Ｐ、
およびＨａｒｄｅｒ、 Ｗ、 （１９８３）、［Ａｄｖ
ａｎｃｅｓ ｉｎＭｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ
ｏｇｙ Ｊ 、Ｒｏｓｅ 、 Ａ、Ｈ，、Ｇａｒｅｔｈ
Ｍｏｒｒｉｓ、Ｊ＋およびＴｅｍｐｅｓｔ 、 Ｄ、
Ｗｏ、編輯、２４巻、１〜８２頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ 、 ＮｅｗＹｏｒｋ）。生成物からカタラ
ーゼを大部分除去し又はこれを不活性化し、こうして活
性カタラーゼを実質的に含まないオキシダーゼを得る方
法は既知である（例えば英国特許第２１０１１６７号明
細書参照）ことは真実である。しかし、工業的適用に対
してはこれらの方法（例えばイオン交換クロマトグラフ
ィ又はゲル濾過によるカタラーゼ除去およびＶデシル硫
酸ソーダ（ｓｎｓ ）又はアジ化ソーダ（こよる処理ζ
こよるカタラーゼの不活性化など）は余りに高価にすぎ
、やっかいで、多くの場合不適当であり、又はアジ化ソ
ーダの場合毒性物質さえ導入される。
従ってカタラーゼを含まないオキシダーゼを技術的およ
び経済的に正当な方法で収得しつる方法の要求がある。
び経済的に正当な方法で収得しつる方法の要求がある。
カタラーゼ陰性の突然変異体を使用する微生物学的生産
はこの要求を満たすが、これは実行できないようである
。その理由は資料によればオキシダーゼに対する基質を
微生物のすぐれた生育およびオキシダーゼの強い形質発
現のため一ζ添加した栄養培地で培養する場合、カタラ
ーゼを有しない生物は死亡の運命にあることは予期でき
るからである。
はこの要求を満たすが、これは実行できないようである
。その理由は資料によればオキシダーゼに対する基質を
微生物のすぐれた生育およびオキシダーゼの強い形質発
現のため一ζ添加した栄養培地で培養する場合、カタラ
ーゼを有しない生物は死亡の運命にあることは予期でき
るからである。
メタノールオキシダーゼ（ＭＯＸ ）の場合、ＭＯＸ
。
。
ホルミエートデヒドロデナーゼ、ホルムアルデヒＰデヒ
ドロデナーゼ、ジヒＰロキシアセトンシンチターゼおよ
びカタラーゼの形成はグルコース抑制、およびグリセロ
ールおよびマンニトール抑制に支配されることは既知で
ある。微生物を非常に低濃度のグルコース、グリセロー
ル又はマンニトールで培養する場合ＭＯＸ合成の抑制解
除が起こるが、その場合でもＭＯＸ生産は比較的ごく少
量である。
ドロデナーゼ、ジヒＰロキシアセトンシンチターゼおよ
びカタラーゼの形成はグルコース抑制、およびグリセロ
ールおよびマンニトール抑制に支配されることは既知で
ある。微生物を非常に低濃度のグルコース、グリセロー
ル又はマンニトールで培養する場合ＭＯＸ合成の抑制解
除が起こるが、その場合でもＭＯＸ生産は比較的ごく少
量である。
上記および以下の説明の十分な理解を得るためにいくつ
かの定義が適当である。
かの定義が適当である。
インダクターはプロモータとの相互作用により、有効な
リプレッサーの不活性化により、又はリプレッサー遺伝
子の遮断により遺伝子の転写を促進する化合物である。
リプレッサーの不活性化により、又はリプレッサー遺伝
子の遮断により遺伝子の転写を促進する化合物である。
リプレッサーはプロモータとの相互作用により、又はリ
プレッサータン白遺伝子の活性化により遺伝子の転写を
阻止する化合物である。遺伝子産物の合成（遺伝子の転
写）は誘導物質の作用（誘導）により、又はリプレッサ
−仲介の抑制（抑制解除）により行なうことができる。
プレッサータン白遺伝子の活性化により遺伝子の転写を
阻止する化合物である。遺伝子産物の合成（遺伝子の転
写）は誘導物質の作用（誘導）により、又はリプレッサ
−仲介の抑制（抑制解除）により行なうことができる。
ＭＯＸの場合メタノールはバッチ式および連続式培養の
双方で誘導物質として作用する。グリセロール、ソルビ
トール、グルコースおよびエタノールはバッチ式および
連続式培養における既知のリプレッサーである。バッチ
培養における低濃度のグリセロール、ソルビトールおよ
びグルコースの条件下で、および定常状態連続培賽にお
いて低稀釈割合でＭＯＸの抑制解除が起こる。
双方で誘導物質として作用する。グリセロール、ソルビ
トール、グルコースおよびエタノールはバッチ式および
連続式培養における既知のリプレッサーである。バッチ
培養における低濃度のグリセロール、ソルビトールおよ
びグルコースの条件下で、および定常状態連続培賽にお
いて低稀釈割合でＭＯＸの抑制解除が起こる。
ＭＯＸ合成の完全な誘導は微生物を唯一の炭素源として
メタノール上で、又はメタノールとグルコース、グリセ
ロール又はマンニトールの特定混合物上で培養する場合
のみ起こることは既知である１： ｇｇｇｅｌｉｎｇ
ａｎｄ ８ａｈｍ１Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、
１２７（１９８０） １１９〜１２４およびＡｒｃｈ
、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。
メタノール上で、又はメタノールとグルコース、グリセ
ロール又はマンニトールの特定混合物上で培養する場合
のみ起こることは既知である１： ｇｇｇｅｌｉｎｇ
ａｎｄ ８ａｈｍ１Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、
１２７（１９８０） １１９〜１２４およびＡｒｃｈ
、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。
１３０（１９８１）３６２〜３６５参照〕。これらの著
者は代謝産物ではないメタノール自体は。
者は代謝産物ではないメタノール自体は。
ＭＯＸ合成の誘導の原因となることを酵母Ｈａｎｓｅｎ
ｕｌａｐｏ１７ｍｏｒｐｈ＆に対する彼らの試験から結
論している。
ｕｌａｐｏ１７ｍｏｒｐｈ＆に対する彼らの試験から結
論している。
これらの刊行物から抑制又は抑制解除状況における発現
レベルは誘導状況における発現レベルに比較して低い、
すなわち完全なグルコース抑制下で１〜２％、連続培養
における低生育割合でグルコース又はグリセロール抑制
解除下で約１０％の大きさのオーダであることを推量で
きる。実際ｌこ、これらの刊行物の１つ（Ａｒｃｈ、Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ、１２７（１９８０）１１９〜１２４
〕には、突然変異体５５／１１としＨａｎｓｅｎｕｌａ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａのカタラーゼ陰性突然変異体が
記載され、この突然変異体はメタノール上で生育できな
いが、抑制解除の条件下でグリセロール上に生育させる
場合、メタノールオキシダーゼを生産する。バッチ培養
ではカタラーゼ陰性突然変異体のＭＯＸ生産は野生型、
すなわちカタラーゼ−生産性の、菌株がグリセロール上
に生産する量の約５０％であった。野生型菌株のメタノ
ール上でのＭＯＸ生産に比較して、カタラーゼ陰性突然
変異体のＭＯＸ生産は約１７％に過ぎなかった。カタラ
ーゼを含まないオキシダーゼ標品のこのような比較的小
さい生産性は工業的規模での生産には不適である。
レベルは誘導状況における発現レベルに比較して低い、
すなわち完全なグルコース抑制下で１〜２％、連続培養
における低生育割合でグルコース又はグリセロール抑制
解除下で約１０％の大きさのオーダであることを推量で
きる。実際ｌこ、これらの刊行物の１つ（Ａｒｃｈ、Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ、１２７（１９８０）１１９〜１２４
〕には、突然変異体５５／１１としＨａｎｓｅｎｕｌａ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａのカタラーゼ陰性突然変異体が
記載され、この突然変異体はメタノール上で生育できな
いが、抑制解除の条件下でグリセロール上に生育させる
場合、メタノールオキシダーゼを生産する。バッチ培養
ではカタラーゼ陰性突然変異体のＭＯＸ生産は野生型、
すなわちカタラーゼ−生産性の、菌株がグリセロール上
に生産する量の約５０％であった。野生型菌株のメタノ
ール上でのＭＯＸ生産に比較して、カタラーゼ陰性突然
変異体のＭＯＸ生産は約１７％に過ぎなかった。カタラ
ーゼを含まないオキシダーゼ標品のこのような比較的小
さい生産性は工業的規模での生産には不適である。
上記資料の他に、関連性の低い他のいくつかの刊行物は
挙げる価値がある。Ｃｈｅｍ、 Ａｂｓｔ、 ８ Ｂ（
１９７８）１８５）０５ＷにはＧ、Ｔ、Ｍｉｗａら０、
Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 １
８７ （ｊ ９７８ ）４６４〜４７５を引用し、これ
にはチトクロームｐ−４５０およびＮＡＤＰＨを含有す
るカタラーゼおよびアルコールデヒドロデナーゼを含ま
ない再構成系によるエタノールの直接酸化が記載される
。
挙げる価値がある。Ｃｈｅｍ、 Ａｂｓｔ、 ８ Ｂ（
１９７８）１８５）０５ＷにはＧ、Ｔ、Ｍｉｗａら０、
Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 １
８７ （ｊ ９７８ ）４６４〜４７５を引用し、これ
にはチトクロームｐ−４５０およびＮＡＤＰＨを含有す
るカタラーゼおよびアルコールデヒドロデナーゼを含ま
ない再構成系によるエタノールの直接酸化が記載される
。
ＮｋＤＰＨの存在を必要とすることからみてこの系は分
子状酸素によりアルコール化合物を酸化できるＭＯＸの
ようにオキシダーゼとして作用しないであろう。従って
オキシダーゼを産生するカタラーゼｗ ｐ −Ａ −０
０１９９３７（ｐＨ工ＬＬｒｐｓＰｇ’ｒＲＯＬＥＵＭ
Ｃｏ、 ）にはアルコールオキシダーゼの生産方法が
記載され、この方法ではメタノール−資化性Ｐｉｃｈｉ
ａ−型微生物、例えばＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓが
使用される。Ｐｉｃｈｉａ属のメタノール−資化性微生
物から、反応 ＲＣＨ２０Ｈ＋ ｏ２−）ＲＣＨＯ＋ Ｈ２Ｏ２（式中
、Ｒ＝Ｈ，ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５又はＣ３Ｈ））を触媒する
酵素標品が記載され、ここにはカタラーゼを含まない酵
素がいくつかの精製処理後に製造される。この方法には
上記した不利がある。さらに特許公報自体が精製アルコ
ールオキシダーゼ中に尚いくつかの酵素が存在すること
を示唆している。
子状酸素によりアルコール化合物を酸化できるＭＯＸの
ようにオキシダーゼとして作用しないであろう。従って
オキシダーゼを産生するカタラーゼｗ ｐ −Ａ −０
０１９９３７（ｐＨ工ＬＬｒｐｓＰｇ’ｒＲＯＬＥＵＭ
Ｃｏ、 ）にはアルコールオキシダーゼの生産方法が
記載され、この方法ではメタノール−資化性Ｐｉｃｈｉ
ａ−型微生物、例えばＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓが
使用される。Ｐｉｃｈｉａ属のメタノール−資化性微生
物から、反応 ＲＣＨ２０Ｈ＋ ｏ２−）ＲＣＨＯ＋ Ｈ２Ｏ２（式中
、Ｒ＝Ｈ，ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５又はＣ３Ｈ））を触媒する
酵素標品が記載され、ここにはカタラーゼを含まない酵
素がいくつかの精製処理後に製造される。この方法には
上記した不利がある。さらに特許公報自体が精製アルコ
ールオキシダーゼ中に尚いくつかの酵素が存在すること
を示唆している。
Ｅ Ｐ −Ａ −００７１９９０（ｐｎｘＬＬｘｐｓＰ
ＥＴＲＯＬＩＩＣＵＭ Ｃｏ、 ） Ｊこは水性液から
環境酸素の除去が記載され、この除去はアルコールの存
在で、任意にはカタラーゼを含むアルコールオキシダー
ゼを含む酵素的脱酸素化系により触媒される。
ＥＴＲＯＬＩＩＣＵＭ Ｃｏ、 ） Ｊこは水性液から
環境酸素の除去が記載され、この除去はアルコールの存
在で、任意にはカタラーゼを含むアルコールオキシダー
ゼを含む酵素的脱酸素化系により触媒される。
Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属およびＰｉｃｈｉａ属の酵母は使
用できるが、本発明によるカタラーゼ陰性突然変異体の
使用は記載も示唆もされていない。反対にカタラーゼの
存在は承認され、従って使用酵素標品の性質および目的
は本発明のものとは異る。
用できるが、本発明によるカタラーゼ陰性突然変異体の
使用は記載も示唆もされていない。反対にカタラーゼの
存在は承認され、従って使用酵素標品の性質および目的
は本発明のものとは異る。
Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａのカタラー
ゼ陰性突然変異体をメタノールおよびグルコースのよう
な他の炭素源の存在で酵母に適する栄養培地に生育させ
る場合）序文で述べたような方法により工業的規模で実
現できることがわかった。この場合メタノールはオキシ
ダーゼ遺伝子の発現を誘導し、そして他の炭素源に加え
てオキシダーゼに対する基質となりつるものであり、一
方形酸する過酸化物の毒性効果はメタノール対地の炭素
源の適当な混合比を使用することにより防止できる。カ
タラーゼ陰性突然変異体の形成過程で何が起るかは明ら
かではないが、いくつかの突然変異が同時に起こること
は十分にありうるであろう。例えば、一層正確な試験後
Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａのカタラー
ゼ陰性突然変異体はチトクローム−Ｃ−パーオキシダー
ゼの含量を増加させる結果となったが、これは多分カタ
ラーゼが行なうのと同じ方法で形成Ｈ２Ｏ２を無毒化す
るらしい。これは突然変異により、又はカタラーゼ陰性
酵母の適応性により起こるかについては尚明らかでない
。
ゼ陰性突然変異体をメタノールおよびグルコースのよう
な他の炭素源の存在で酵母に適する栄養培地に生育させ
る場合）序文で述べたような方法により工業的規模で実
現できることがわかった。この場合メタノールはオキシ
ダーゼ遺伝子の発現を誘導し、そして他の炭素源に加え
てオキシダーゼに対する基質となりつるものであり、一
方形酸する過酸化物の毒性効果はメタノール対地の炭素
源の適当な混合比を使用することにより防止できる。カ
タラーゼ陰性突然変異体の形成過程で何が起るかは明ら
かではないが、いくつかの突然変異が同時に起こること
は十分にありうるであろう。例えば、一層正確な試験後
Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａのカタラー
ゼ陰性突然変異体はチトクローム−Ｃ−パーオキシダー
ゼの含量を増加させる結果となったが、これは多分カタ
ラーゼが行なうのと同じ方法で形成Ｈ２Ｏ２を無毒化す
るらしい。これは突然変異により、又はカタラーゼ陰性
酵母の適応性により起こるかについては尚明らかでない
。
上記カタラーゼ陰性Ｈａｎｓｅｎｕｌａ 匹す肌■巨の
代りに、他のカタラーゼ陰性酵母も使用できる。
代りに、他のカタラーゼ陰性酵母も使用できる。
生産されるオキシダーゼにより、メタノール以外の化合
物、例えばアミンオキシダーゼの製造におけるメチルア
ミンは基質であることもでき、誘導剤として使用するこ
ともできる。従って本発明はメタノールオキシダーゼの
生産のみに限定されない。
物、例えばアミンオキシダーゼの製造におけるメチルア
ミンは基質であることもでき、誘導剤として使用するこ
ともできる。従って本発明はメタノールオキシダーゼの
生産のみに限定されない。
各種炭素源はグルコースの代りに使用できる。
従って一般的意味では本発明は酵母がオキシダーゼを生
産する条件下で酵母の好気醗酵を行ない、所望の場合生
産オキシダーゼを酵母細胞から単離するオキシダーゼ含
有組成物の製造方法を含み、その特徴は酵母のカタラー
ゼ陰性突然変異体を次の物質の存在で酵母に適する栄養
培地に生育させることである： （ハ））オキシダーゼ遺伝子の発現を誘導し、オキシダ
ーゼに対し基質ともなりうるいわゆる誘導基質、および （ｂ） 選択した酵母種に対し適する別の炭素源、誘
導基質対地の炭素源のモル比は形成酵母および形成オキ
シダーゼが誘導基質の酸化により有害作用を受けないよ
うな比率である。
産する条件下で酵母の好気醗酵を行ない、所望の場合生
産オキシダーゼを酵母細胞から単離するオキシダーゼ含
有組成物の製造方法を含み、その特徴は酵母のカタラー
ゼ陰性突然変異体を次の物質の存在で酵母に適する栄養
培地に生育させることである： （ハ））オキシダーゼ遺伝子の発現を誘導し、オキシダ
ーゼに対し基質ともなりうるいわゆる誘導基質、および （ｂ） 選択した酵母種に対し適する別の炭素源、誘
導基質対地の炭素源のモル比は形成酵母および形成オキ
シダーゼが誘導基質の酸化により有害作用を受けないよ
うな比率である。
本明細書において「組成物」は各種成分の混合物および
いわば、例えばカプセル形にオキシダーゼを包装した標
品の双方を意味する。
いわば、例えばカプセル形にオキシダーゼを包装した標
品の双方を意味する。
本発明に従ってＨａｎｓｅｎｕｌａ属又はＰｉｃｈｉａ
属、特にＨａｎｓｅｎｕｌａ ｏｌ ｎｏｒ ｈａ種
又はＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ種の酵母のカタラ
ーゼ陰性突然変異体、例えばカタラーゼ陰性突然変異体
Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｏｌ ｎｏｒ ｈａ５５／１１
、ＡＴＣＣ４６０５９を使用することは好ましい。本発
明は疑いなくこの１種の突然変異体に限定されるもので
はない。他のカタラーゼ陰性突然変異体はランダムに任
意の突然変異を導入し、得た突然変異体を次に選択する
ことにより、又は特にヨーロッパ特許出願０１７！１３
７８（Ａ２）明細書に記載のように定方向突然変異方法
により得ることができる。
属、特にＨａｎｓｅｎｕｌａ ｏｌ ｎｏｒ ｈａ種
又はＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ種の酵母のカタラ
ーゼ陰性突然変異体、例えばカタラーゼ陰性突然変異体
Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｏｌ ｎｏｒ ｈａ５５／１１
、ＡＴＣＣ４６０５９を使用することは好ましい。本発
明は疑いなくこの１種の突然変異体に限定されるもので
はない。他のカタラーゼ陰性突然変異体はランダムに任
意の突然変異を導入し、得た突然変異体を次に選択する
ことにより、又は特にヨーロッパ特許出願０１７！１３
７８（Ａ２）明細書に記載のように定方向突然変異方法
により得ることができる。
本発明に従ってオキシダーゼに対する遺伝情報は強いプ
ロモータの制御下にある酵母を使用することがさらに好
ましくその結果大収量のオキシダーゼを得ることができ
る。この例はＭＯＸ プロモータ、特にＨａｎｓｅｎｕ
ｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ ＣＢＳ ４７３２のＭＯ
Ｘプロモータである。これは上記Ｈａｎｓｅｎｕｌａ
朋還ユｍｏｒｐｈａ ５５ ／ １１、ＡＴＣＣ４６０
５９酵母に天然に存在するが、他の酵母については既知
のＤＮＡ組換え技術により達成できる。プロモータの強
さはメタノール上で培養したＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏ
ｌｙｍｏｒｐｈａの野生型菌株のＭＯＸ含量が細胞タン
白の６０チの大きさのオーダにある事実から明らかであ
る。
ロモータの制御下にある酵母を使用することがさらに好
ましくその結果大収量のオキシダーゼを得ることができ
る。この例はＭＯＸ プロモータ、特にＨａｎｓｅｎｕ
ｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ ＣＢＳ ４７３２のＭＯ
Ｘプロモータである。これは上記Ｈａｎｓｅｎｕｌａ
朋還ユｍｏｒｐｈａ ５５ ／ １１、ＡＴＣＣ４６０
５９酵母に天然に存在するが、他の酵母については既知
のＤＮＡ組換え技術により達成できる。プロモータの強
さはメタノール上で培養したＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏ
ｌｙｍｏｒｐｈａの野生型菌株のＭＯＸ含量が細胞タン
白の６０チの大きさのオーダにある事実から明らかであ
る。
他の強いプロモータの例はメチロトローフ性酵母のジヒ
Ｙロキシアセトンシンテターゼ（Ｌ’ｌＡ８ ）プロモ
ータおよびアミンオキシダーゼを生産する酵母のアミン
オキシダーゼプロモータである。
Ｙロキシアセトンシンテターゼ（Ｌ’ｌＡ８ ）プロモ
ータおよびアミンオキシダーゼを生産する酵母のアミン
オキシダーゼプロモータである。
工業的規模での生産と関連して本発明に係る酵母は連続
式醗酵で培養することが好ましい。しかし、「バッチ式
」醗酵又は「フェトバッチ式（ｆｅｄｂａｔｃｈ ）
Ｊ醗酵は除外しない。「フエｒパッチ刺とは基質を初め
に１回で添加せずに、全醗酵中調整できる基質濃度を達
成するように除徐に添加する「バッチ式」醗酵を意味す
る。
式醗酵で培養することが好ましい。しかし、「バッチ式
」醗酵又は「フェトバッチ式（ｆｅｄｂａｔｃｈ ）
Ｊ醗酵は除外しない。「フエｒパッチ刺とは基質を初め
に１回で添加せずに、全醗酵中調整できる基質濃度を達
成するように除徐に添加する「バッチ式」醗酵を意味す
る。
本発明に従ってオキシダーゼ遺伝子として好ましくはメ
タノールオキシダーゼ遺伝子、例えばＨａｎｓｅｎｕｌ
ａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ ＣＢＳ ４７３２の既知Ｍ
ＯＸと同じアミノ酸配列又は酵素工学によシ得たこの配
列の誘導体、又は実際に機能性を有するその修飾体を有
するメタノールオキシダーゼをコードするメタノールオ
キシダーゼ遺伝子を使用することが好ましい。メタノー
ルオキシダーゼと合せてメタノールを誘導基質として使
用することが好ましい。メタノールに対すると同様にＭ
ＯＸ酵素は他の各種基質、例えばエタノール、ｎ−プロ
パツール、ｎ−ブタノール、ｎ−アミルアルコールに対
し、および僅かな程度でおるがメチルセルロシデ、エチ
レングリコール、ペンシルアルコール、イソプロパツー
ル、イソアミルアルコールおよびプロピレングリコール
のような物質に対し活性を有するらしい。エタノールの
ようなこれらの物質のいくつかは、洗滌および漂白組成
物にメタノールオキシダーゼを使用する場合基質として
供するのに非常に適する。これは比較的安価で毒物学的
に許容できるからである。
タノールオキシダーゼ遺伝子、例えばＨａｎｓｅｎｕｌ
ａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ ＣＢＳ ４７３２の既知Ｍ
ＯＸと同じアミノ酸配列又は酵素工学によシ得たこの配
列の誘導体、又は実際に機能性を有するその修飾体を有
するメタノールオキシダーゼをコードするメタノールオ
キシダーゼ遺伝子を使用することが好ましい。メタノー
ルオキシダーゼと合せてメタノールを誘導基質として使
用することが好ましい。メタノールに対すると同様にＭ
ＯＸ酵素は他の各種基質、例えばエタノール、ｎ−プロ
パツール、ｎ−ブタノール、ｎ−アミルアルコールに対
し、および僅かな程度でおるがメチルセルロシデ、エチ
レングリコール、ペンシルアルコール、イソプロパツー
ル、イソアミルアルコールおよびプロピレングリコール
のような物質に対し活性を有するらしい。エタノールの
ようなこれらの物質のいくつかは、洗滌および漂白組成
物にメタノールオキシダーゼを使用する場合基質として
供するのに非常に適する。これは比較的安価で毒物学的
に許容できるからである。
醗酵中、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ又はＰｉｃｈｆａのような
酵母に適する栄養培地が使用され、これはこの微生物に
適する炭素源を含有しなければならない。適当な炭素源
は当業者には既知であシ、又は試験により容易に決定で
きる。例えばグルコースは適するが、他の糖、例えばソ
ルボース、キシロース、ソルビトールおよびグリセロー
ルなどのような他の物質も炭素源として使用することが
でき、又糖蜜のような商業的に入手しうる炭素源も考慮
しうる。
酵母に適する栄養培地が使用され、これはこの微生物に
適する炭素源を含有しなければならない。適当な炭素源
は当業者には既知であシ、又は試験により容易に決定で
きる。例えばグルコースは適するが、他の糖、例えばソ
ルボース、キシロース、ソルビトールおよびグリセロー
ルなどのような他の物質も炭素源として使用することが
でき、又糖蜜のような商業的に入手しうる炭素源も考慮
しうる。
適当な栄養培地はＥｇｌ ｉら、 、Ａｒｃｈ、 Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ。
ｃｒｏｂｉｏｌ。
１２４（１９８０）１１５〜１２１から既知である。
本発明に従って＃＃中炭素源量と誘導物質、例えばメタ
ノール量間の適地を確定することは重要である。
ノール量間の適地を確定することは重要である。
本発明の好ましい態様は選択した酵母種に適する炭素源
、例えばグルコースおよびメタノールの存在で培養する
ことを特徴とし、メタノール：グルコースのモル比は（
０，０２５〜６）：１であシ、好ましくは（０，８〜Ｌ
８ ）： ｆである。
、例えばグルコースおよびメタノールの存在で培養する
ことを特徴とし、メタノール：グルコースのモル比は（
０，０２５〜６）：１であシ、好ましくは（０，８〜Ｌ
８ ）： ｆである。
カタラーゼ陰性突然変異体Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙ
ｍｏｒｐｈａ ５５ ／ １１ 、 ＡＴＣＣ４６０５
９の０．１時間−１の稀釈割合について連続１１１酵で
これらのメタノール／グルコース混合物による試験では
、メタノール上で培養したカメ２−ゼ生産性野生型菌株
のＭＯＸ収量の５０％の大きさのオーダにあるＭＯＸ収
量を得友。これらの収量はカタラーゼを欠く点からみて
も工業規模で使用するに適する。
ｍｏｒｐｈａ ５５ ／ １１ 、 ＡＴＣＣ４６０５
９の０．１時間−１の稀釈割合について連続１１１酵で
これらのメタノール／グルコース混合物による試験では
、メタノール上で培養したカメ２−ゼ生産性野生型菌株
のＭＯＸ収量の５０％の大きさのオーダにあるＭＯＸ収
量を得友。これらの収量はカタラーゼを欠く点からみて
も工業規模で使用するに適する。
本発明の好ましい態様によれば、カタラーゼ陰性オキシ
ダーゼ含有酵母は連続醗酵終了後オキシダーゼ酵素が失
活しない乾燥処理にかけ、又は細胞を透過性にし又は不
活性化ささせる別の処理にかける。凍結乾燥処理は非常
に適するようである。
ダーゼ含有酵母は連続醗酵終了後オキシダーゼ酵素が失
活しない乾燥処理にかけ、又は細胞を透過性にし又は不
活性化ささせる別の処理にかける。凍結乾燥処理は非常
に適するようである。
このような乾燥処理の利点は乾燥処理により不活性化し
た細胞は５から少なくとも３００ミル七ル／ｌのメタノ
ール濃度を使用して直ちにＨ２０２生産を開始すること
である。反対に、生活細胞サスペンションは７５〜３０
０ミリモル／！！のメタノール濃度を使用する場合遅れ
時間を示し、７５ミリモル／ｌ以下ではＨ２Ｏ２生産は
起こらないことがわかった。これはカタラーゼと同様の
Ｈ２Ｏ２分解作用を有する生活細胞サスペンション中の
チトクロームＣパーオキシダーゼの存在にょシ生ずる。
た細胞は５から少なくとも３００ミル七ル／ｌのメタノ
ール濃度を使用して直ちにＨ２０２生産を開始すること
である。反対に、生活細胞サスペンションは７５〜３０
０ミリモル／！！のメタノール濃度を使用する場合遅れ
時間を示し、７５ミリモル／ｌ以下ではＨ２Ｏ２生産は
起こらないことがわかった。これはカタラーゼと同様の
Ｈ２Ｏ２分解作用を有する生活細胞サスペンション中の
チトクロームＣパーオキシダーゼの存在にょシ生ずる。
この存在は上記した。
メタノール使用濃度が高すぎ、および／又はグルコース
に対するメタノールの比が高すぎる場合、ＭＯＸ収量は
低下し、カルチャーは死滅さえする。
に対するメタノールの比が高すぎる場合、ＭＯＸ収量は
低下し、カルチャーは死滅さえする。
メタノール濃度が低すぎると生産が不十分になるので、
オキシダーゼの収量が低い結果になる。メタノールを使
用しないグルコースのみによる突然変異体の生育では野
生型菌株の場合におけるように、明らかにグルコース抑
制の結果として同じ低ＭＯＸ活性を得る。
オキシダーゼの収量が低い結果になる。メタノールを使
用しないグルコースのみによる突然変異体の生育では野
生型菌株の場合におけるように、明らかにグルコース抑
制の結果として同じ低ＭＯＸ活性を得る。
意図的使用に対し、その１ま場養酵母細肥を使用するこ
とを望まないか又はできない場合、酵母細胞、％くベル
オキシソームに蓄積されたオキシダーゼを細胞から単離
すべきである。これを行なうために、ガラス球による細
胞の物理的破壊、いわゆるフレンチプレスにおける処理
、又はマントンガタリン均質機、超音波処理および酵素
的方法、例えばチモリアーゼによる方法のような細胞崩
壊の通例方法は適用できる。
とを望まないか又はできない場合、酵母細胞、％くベル
オキシソームに蓄積されたオキシダーゼを細胞から単離
すべきである。これを行なうために、ガラス球による細
胞の物理的破壊、いわゆるフレンチプレスにおける処理
、又はマントンガタリン均質機、超音波処理および酵素
的方法、例えばチモリアーゼによる方法のような細胞崩
壊の通例方法は適用できる。
本発明はこのような酵母生産に本発明方法を利用するこ
とによシ得たオキシダーゼを含有し、カタラーゼ陰性の
酵母突然変異体、およびオキシダーゼ又は本発明により
酵母からオキシダーゼを単離し、できれば仄にオキシダ
ーゼを加工し、こうして他の成分を有する組成物に単離
することによって得るオキシダーゼ含有組成物にも関す
る。
とによシ得たオキシダーゼを含有し、カタラーゼ陰性の
酵母突然変異体、およびオキシダーゼ又は本発明により
酵母からオキシダーゼを単離し、できれば仄にオキシダ
ーゼを加工し、こうして他の成分を有する組成物に単離
することによって得るオキシダーゼ含有組成物にも関す
る。
さらに、本発明は本発明によるオキシダーゼ含有、カメ
ラーゼ陰性の酵母突然変異体の使用、又は洗浄又は漂白
方法における過酸化水素のその場所での形成に対しオキ
シダーゼに対する基質と共にそこから単離したオキシダ
ーゼの使用に関する。
ラーゼ陰性の酵母突然変異体の使用、又は洗浄又は漂白
方法における過酸化水素のその場所での形成に対しオキ
シダーゼに対する基質と共にそこから単離したオキシダ
ーゼの使用に関する。
特にアルコールオキシダーゼを使用する場合、エタノー
ルはこのような洗浄方法において基質として使用するこ
とが好ましい。
ルはこのような洗浄方法において基質として使用するこ
とが好ましい。
本発明によるオキシダーゼ含有、カタラーゼ陰性の酵母
突然変異体、又はこれらから単離したオキシダーゼを含
有する洗浄又は漂白剤は本発明の一態様である。
突然変異体、又はこれらから単離したオキシダーゼを含
有する洗浄又は漂白剤は本発明の一態様である。
さらに、本発明は本発明によるオキシダーゼ含有、カタ
ラーゼ陰性の酵母突然変異体の使用、又は化学合成又は
廃棄物の精製方法のわく岨内のオキシダーゼの基質に対
する酸化に対し、又はオキシダーゼに対する基質の定性
および／又は定量測定に対する触媒としてそこから単離
し几オキシダーゼの使用に関する。
ラーゼ陰性の酵母突然変異体の使用、又は化学合成又は
廃棄物の精製方法のわく岨内のオキシダーゼの基質に対
する酸化に対し、又はオキシダーゼに対する基質の定性
および／又は定量測定に対する触媒としてそこから単離
し几オキシダーゼの使用に関する。
本発明はさらに次の試験部分で説明する。
醗酵条件および培地
Ｈａｎａｅｎｕｌａ−稈品ヱジど刺Ｙ工は酵母ペプトン
デキストロース寒天からのカタラーゼ陰性コロニーとし
て使用し、ＫｇｌｉらのＡｒｃｈ、 Ｍｉｃｒｏｌｉｏ
ｌ、 １２４（１９８０）、１１５〜１２１記載の、単
独炭素源としてグルコースを含む培地で３７°Ｃで１日
子備培養した。
デキストロース寒天からのカタラーゼ陰性コロニーとし
て使用し、ＫｇｌｉらのＡｒｃｈ、 Ｍｉｃｒｏｌｉｏ
ｌ、 １２４（１９８０）、１１５〜１２１記載の、単
独炭素源としてグルコースを含む培地で３７°Ｃで１日
子備培養した。
培養は２１の培地を含有する３ノ醗酵器で連続的に行な
った。通気、ｐＨおよび攪拌を調整し、溶解酸素圧は２
５％飽和以下に決してしないように注意した。５ＰＨ＞
よび泡の形成は４：１〜１：１比のシリコン油規準の消
泡剤を含有する濃アンそニア溶液によシ調整した（ Ｒ
ｈｏｎｅ ＰｏｕｌｅｎｃからのＲｈｏｄｏｒａｉｌ
４２６ Ｒ） ６−は５．０±０．０５ｐ）１ユニツト
に調整した。温度は３７±０．２℃に保持した。
った。通気、ｐＨおよび攪拌を調整し、溶解酸素圧は２
５％飽和以下に決してしないように注意した。５ＰＨ＞
よび泡の形成は４：１〜１：１比のシリコン油規準の消
泡剤を含有する濃アンそニア溶液によシ調整した（ Ｒ
ｈｏｎｅ ＰｏｕｌｅｎｃからのＲｈｏｄｏｒａｉｌ
４２６ Ｒ） ６−は５．０±０．０５ｐ）１ユニツト
に調整した。温度は３７±０．２℃に保持した。
出入する培地流を測定し、嬬動ポンプにより所望流速に
調整した。メタノール濃度はカルチャーをメタノールに
適応させるために除徐に増加した。
調整した。メタノール濃度はカルチャーをメタノールに
適応させるために除徐に増加した。
醗酵の安定状態は呼吸パラメータを測定することにより
（呼吸商、二酸化炭素の発生割合および酸素吸収割合）
、および細胞サスペンション２よび細胞浴解質中のＭＯ
Ｘ含量を横歪することにより試験を行なった。
（呼吸商、二酸化炭素の発生割合および酸素吸収割合）
、および細胞サスペンション２よび細胞浴解質中のＭＯ
Ｘ含量を横歪することにより試験を行なった。
分析
ＭＯＸおよびカタラーゼの測定
細胞ナスペンションのＭＯＸ活性、細胞を含まない抽出
物およびカタラーゼ活性はｖａｎ ＤｉｊｋｅｎらのＡ
ｒｃｈ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 １１１ （１９７６
） 、 １３７〜１４４に従って測定した。１ユニツト
は７．５の−を有する空気飽和０．１ Ｍ ’）ン酸塩
バッファー中で６７℃で１分ａｂ使用される１μモルメ
タノールに相当する。
物およびカタラーゼ活性はｖａｎ ＤｉｊｋｅｎらのＡ
ｒｃｈ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 １１１ （１９７６
） 、 １３７〜１４４に従って測定した。１ユニツト
は７．５の−を有する空気飽和０．１ Ｍ ’）ン酸塩
バッファー中で６７℃で１分ａｂ使用される１μモルメ
タノールに相当する。
タン白
タン白はＬｏｗｒｙらのＪ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、
１９３（１９５）Ｌ２６５〜２７５の方法に従って測
定し友。牛血清アルブミンは標準として使用した。
１９３（１９５）Ｌ２６５〜２７５の方法に従って測
定し友。牛血清アルブミンは標準として使用した。
バイオマス
バイオマスの乾燥重量は洗浄細胞サスペンションを１０
０℃で恒量まで乾燥することにより測定した。
０℃で恒量まで乾燥することにより測定した。
グルコース、メタノール、４ｒ：Ｉｔおよびホルムアル
デヒドはＨＰＬＣおよび標準酵素分析により測定し几み 細胞の破壊 崩壊細胞は超音波処理又はチモリアーゼによるインキュ
ベーションによｎ得た。
デヒドはＨＰＬＣおよび標準酵素分析により測定し几み 細胞の破壊 崩壊細胞は超音波処理又はチモリアーゼによるインキュ
ベーションによｎ得た。
超音波処理
超音波処理は０℃で７．５の−を有する０、１Ｍりン酸
カリ溶液により行なった。この溶液は３ｇのガラスピー
ズ（平均直径１００μ）と共に５７１１７の洗浄細胞サ
スペンションを含有し念。細胞サスペンションはＢｒａ
ｎｓｏｎの細胞破壊機メイゾＢ−ｉ ２（Ｂｒａｎｓｏ
ｎ ８ｏｎｉｃ Ｐｏｗｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ ）によ
り１分間５回処理した。処理間に１分の冷却期間を守っ
た。５ゴの溶液につき７０ワツトの出力を導入し、その
ためにミクロチップを使用し九０例 ｌ−メタノール／
グルコース上のＭＯＸ生産の最適条件化 Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ ＡＴＣＣ
４６０５９は表Ａ記載の培地に生育させた。この培地は
各検地のメタノール対グルコースを含有した。
カリ溶液により行なった。この溶液は３ｇのガラスピー
ズ（平均直径１００μ）と共に５７１１７の洗浄細胞サ
スペンションを含有し念。細胞サスペンションはＢｒａ
ｎｓｏｎの細胞破壊機メイゾＢ−ｉ ２（Ｂｒａｎｓｏ
ｎ ８ｏｎｉｃ Ｐｏｗｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ ）によ
り１分間５回処理した。処理間に１分の冷却期間を守っ
た。５ゴの溶液につき７０ワツトの出力を導入し、その
ためにミクロチップを使用し九０例 ｌ−メタノール／
グルコース上のＭＯＸ生産の最適条件化 Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ ＡＴＣＣ
４６０５９は表Ａ記載の培地に生育させた。この培地は
各検地のメタノール対グルコースを含有した。
図１および表Ｂは４〜５滞留期間後の平衡状態にあるｍ
ｅから得た細胞溶解質のＭＯＸ比活性を示す＠０．０９
５時間″″１の一定稀釈割合でメタノール対グルコース
の比に対し１〜１．８モルメタノール対１モルグルコー
スの最適範囲が図１かられがったＯ 表Ｃには、メタノール、ホルムアルデヒドおよびグルコ
ースの残留濃度値を示す。明らかに、最適比以上のメタ
ノール対グルコース比では、メタノールおよび／又はホ
ルムアルデヒドの濃度は非常に高くなるので酵母および
オキシダーゼに対し毒物的に作用し始め、図１かられか
るようにＭＯＸの低収量となる。
ｅから得た細胞溶解質のＭＯＸ比活性を示す＠０．０９
５時間″″１の一定稀釈割合でメタノール対グルコース
の比に対し１〜１．８モルメタノール対１モルグルコー
スの最適範囲が図１かられがったＯ 表Ｃには、メタノール、ホルムアルデヒドおよびグルコ
ースの残留濃度値を示す。明らかに、最適比以上のメタ
ノール対グルコース比では、メタノールおよび／又はホ
ルムアルデヒドの濃度は非常に高くなるので酵母および
オキシダーゼに対し毒物的に作用し始め、図１かられか
るようにＭＯＸの低収量となる。
上記カルチャーから傅念細胞溶解質ではカタラーゼ活性
は全く検出できなかった。
は全く検出できなかった。
カメラーゼ陰性突然変異体Ｈａｎｓ、ｅｎｕｌａｐｏｌ
ｙｍｏｒｐｈａ ５５ ／ １１ 、 ＡＴＣＣ４６０
５９が誘導される野生型菌株Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏ
ｌｙｍｏｒｐｈａ ＣＢ８４７３２ｔ−多くのメタノー
ル含有培地（メタノール／グルコース、メタノール／グ
リセロール）上で同一条件下で培養した。
ｙｍｏｒｐｈａ ５５ ／ １１ 、 ＡＴＣＣ４６０
５９が誘導される野生型菌株Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏ
ｌｙｍｏｒｐｈａ ＣＢ８４７３２ｔ−多くのメタノー
ル含有培地（メタノール／グルコース、メタノール／グ
リセロール）上で同一条件下で培養した。
こうして得たＭＯＸ収量は表りに示す。これから最適条
件下でカタラーゼ陰性突然変異体は細廊タン白ダにつき
ユニットとして表わしてメタノール上で培養した野生型
Ｍ株に対し４９％のＭＯＸ ’ｉ示すと思われる。
件下でカタラーゼ陰性突然変異体は細廊タン白ダにつき
ユニットとして表わしてメタノール上で培養した野生型
Ｍ株に対し４９％のＭＯＸ ’ｉ示すと思われる。
メタノール／グルコース上で培養し九野生型菌株に対し
、突然変異体は最適条件下で５２〜６２％を示した。
、突然変異体は最適条件下で５２〜６２％を示した。
０．０９５時間−１の稀釈割合で表ＡＫ示す培地上で生
育させた。メタノール対グルコースのモル比は１．１３
： １であった。
育させた。メタノール対グルコースのモル比は１．１３
： １であった。
細胞の超音波処理に続いて１５分１２，０００，９で遠
心分離し、空気安定性の細胞を含まない抽出物を得た。
心分離し、空気安定性の細胞を含まない抽出物を得た。
細胞を含まない溶解質のＭＯＸ活性は６５％飽和硫酸ア
ンモニウム溶液により沈澱させた。こうして得た沈澱は
室温で安定でｂつ几。カタラーゼ活性は沈澱物中に全く
検出できなかった。
ンモニウム溶液により沈澱させた。こうして得た沈澱は
室温で安定でｂつ几。カタラーゼ活性は沈澱物中に全く
検出できなかった。
硫酸アンモニウムにより傅た沈澱は本明刑齋の序文に記
載の使用に対し適用できる。
載の使用に対し適用できる。
！醗酵容器で０．０９５時間−１の稀釈割合で表Ａ記載
の培地に生育させた。メタノール対グルコースのモル比
は１．１３ ： １であった。
の培地に生育させた。メタノール対グルコースのモル比
は１．１３ ： １であった。
例■記載の硫酸アンモニウム方法によシ単離したＭＯＸ
の比活性は３．３Ｍ０Ｘユニツト／〜タン白であった。
の比活性は３．３Ｍ０Ｘユニツト／〜タン白であった。
サスペンション中の（全体の）もとのままの細胞は０−
５８ ＭＯＸユニット／ｒｎ９バイオマスのＭＯＸ活性
を示した（乾物産量規準でン。ａ記は凍結乾燥装置で１
５℃で２日減圧乾燥した。乾燥試料を７．５のＰ）１ｔ
−有する０、０５ Ｍリン酸カリバッファ中にサスペン
ションに復元し、好気条件下で超音波処理後の活性はｉ
、４Ｍ０Ｘユニツト／タバイオマス（乾燥重量）であっ
た。乾燥後、細胞は少なくとも１ｔ月呈温で安定であっ
た。乾燥細胞はカタラーゼ活性を全く含有しなかった。
５８ ＭＯＸユニット／ｒｎ９バイオマスのＭＯＸ活性
を示した（乾物産量規準でン。ａ記は凍結乾燥装置で１
５℃で２日減圧乾燥した。乾燥試料を７．５のＰ）１ｔ
−有する０、０５ Ｍリン酸カリバッファ中にサスペン
ションに復元し、好気条件下で超音波処理後の活性はｉ
、４Ｍ０Ｘユニツト／タバイオマス（乾燥重量）であっ
た。乾燥後、細胞は少なくとも１ｔ月呈温で安定であっ
た。乾燥細胞はカタラーゼ活性を全く含有しなかった。
表 Ａ−生育培地の組成
ｌＩ／１−１
グルコース ５
メタノール ０−２．２
ＮＨ，Ｃ１７，６３
ＫＨ２ＰＱ、 ２．８１Ｍｇ８０．・７
Ｈ２００−５９ ＣａＣ１２ＩＩ２Ｈ２００−０５５ Ｆｅ８０４・７Ｈ２００−０３７５ ＭｎＳＯ４，Ｈ２Ｏ０−０１４ ＺｎＳ０ 、７Ｈ２０Ｌｌ −０２２ ＣｕＳＯ４，５Ｈ２００，００４ ＣＯＣＩ２．６Ｈ２００，００４５ Ｎａ２ＭＯＯ４−２Ｈ２００−００２６Ｈ３Ｂ０．
０．００４ ＫＪ Ｏ，００２６ＥＤＴＡ
０ 、４５ ビオチン ０．００００７５チアミンＨＣＩ
０．００６２５メソ−イノシトール ０．
０６ ピリドキシン ｏ、ｏａｉｓＤ−パントテン
酸 ０．０３ 表 Ｂ−０，０９５時間−１の稀釈割合でメタノール／
ゲルコース混合物上に培養した旦、１往正五辺逸ＡＴｃ
ｃ ４６０５９の生育収量およびＭＯＸ生産バイオマス
ＭＯ８収量 活 性 モル比 乾燥ｘｔ ユニット／岬 ユニツ
レ−０２，５５０，１２０，２８ ０＊１．５０ ０．１６ ０．４０．０７
２．６０ ０．２ ０．４８０．
１４ ２．７０ ０．２３ ０．５
５０．２ ２．７６ ０．３２ ０
．７６０．２ ２．５９ ０．２９
０．７０．４１ ２．５０ ０．４７
１．４０．８１ ２．５９ ０．
７３ １．７４１．１３ ２．５８
１．１ ２，６１．１３ ２．５８
１．４ ３．３１．８ ２．５３
０．８１ ２．５）．８ ２．
７３ ０．９ ２．６２．４ ２
．５８ ０．８２ ２．０＊表Ａにおける値
の７５％のビタミン濃度。
Ｈ２００−５９ ＣａＣ１２ＩＩ２Ｈ２００−０５５ Ｆｅ８０４・７Ｈ２００−０３７５ ＭｎＳＯ４，Ｈ２Ｏ０−０１４ ＺｎＳ０ 、７Ｈ２０Ｌｌ −０２２ ＣｕＳＯ４，５Ｈ２００，００４ ＣＯＣＩ２．６Ｈ２００，００４５ Ｎａ２ＭＯＯ４−２Ｈ２００−００２６Ｈ３Ｂ０．
０．００４ ＫＪ Ｏ，００２６ＥＤＴＡ
０ 、４５ ビオチン ０．００００７５チアミンＨＣＩ
０．００６２５メソ−イノシトール ０．
０６ ピリドキシン ｏ、ｏａｉｓＤ−パントテン
酸 ０．０３ 表 Ｂ−０，０９５時間−１の稀釈割合でメタノール／
ゲルコース混合物上に培養した旦、１往正五辺逸ＡＴｃ
ｃ ４６０５９の生育収量およびＭＯＸ生産バイオマス
ＭＯ８収量 活 性 モル比 乾燥ｘｔ ユニット／岬 ユニツ
レ−０２，５５０，１２０，２８ ０＊１．５０ ０．１６ ０．４０．０７
２．６０ ０．２ ０．４８０．
１４ ２．７０ ０．２３ ０．５
５０．２ ２．７６ ０．３２ ０
．７６０．２ ２．５９ ０．２９
０．７０．４１ ２．５０ ０．４７
１．４０．８１ ２．５９ ０．
７３ １．７４１．１３ ２．５８
１．１ ２，６１．１３ ２．５８
１．４ ３．３１．８ ２．５３
０．８１ ２．５）．８ ２．
７３ ０．９ ２．６２．４ ２
．５８ ０．８２ ２．０＊表Ａにおける値
の７５％のビタミン濃度。
表 Ｃ−平衡状態におけるメタノール、ホルムメタノー
ル： 残 留 濃 度Ｉｌ／ｌ
＃／ｌ ９／１ｏ、ｏ ｏ
ｏ 。
ル： 残 留 濃 度Ｉｌ／ｌ
＃／ｌ ９／１ｏ、ｏ ｏ
ｏ 。
Ｏ，０１４０００
０，０７０００
０，１４０００
０，２０００
０，４１００，２８０
０，８００，６１０
１，１３００，４３０
１，８０１，１０
２，４０，１７０，４７０
Claims (13)
- （１）酵母のオキシダーゼ産生条件下で酵母を好気醗酵
させ、必要に応じて酵母細胞から産生したオキシダーゼ
を単離することによるオキシダーゼ又はオキシダーゼ含
有組成物の製造方法において、酵母のカタラーゼ陰性突
然変異体を、 （ａ）オキシダーゼ遺伝子の発現を誘導し、オキシダー
ゼに対する基質ともなりうるいわゆる誘導基質、および （ｂ）選択した酵母種に適する別の炭素源、の存在下に
酵母に適する栄養培地に生育させ、誘導基質対その他の
炭素源のモル比は、生成酵母と生成オキシダーゼが誘導
基質の酸化に対し悪影響を受けない量比であることを特
徴とする、上記製造方法。 - （２）￥Ｈａｎｓｅｎｕｌａ￥属、好ましくは￥Ｈａｎ
ｓｅｎｕｌａ￥￥ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ￥種、特に￥Ｈ
ａｎｓｅｎｕｌａ￥ ￥ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ￥５５／
１１、ＡＴＣＣ４６０５９、又は￥Ｐｉｃｈｉａ￥属、
好ましくは￥Ｐｉｃｈｉａ￥ ￥ｐａｓｔｏｒｉｓ￥種
の酵母のカタラーゼ陰性突然変異体を使用する、特許請
求の範囲第１項記載の方法。 - （３）オキシダーゼとしてメタノールオキシダーゼを産
生し、好ましくはメタノールは誘導基質として使用する
、特許請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。 - （４）￥Ｈａｎｓｅｎｕｌａ￥ ￥ｐｏｌｙｍｏｒｐｈ
ａ￥ ＣＢＳ ４７３２の既知メタノールオキシダーゼ
と同じアミノ酸配列、又は酵素工学により得たこの配列
の誘導体を有するメタノールオキシダーゼを生産する、
特許請求の範囲第３項記載の方法。 - （５）酵母はグルコース、ソルボース、キシロース、ソ
ルビトールのような糖、糖蜜のような市販の炭素源およ
びグリセロールなどの微生物学で使用する他の炭素源か
ら成る群から選択した別の炭素源を含有する栄養培地で
培養する、特許請求の範囲第１項から第４項のいずれか
１項に記載の方法。 - （６）メタノールおよびグルコースは炭素源としてメタ
ノール：グルコースを（０．０２５〜３）：１、好まし
くは（１〜１．８）：１のモル比で使用する、特許請求
の範囲第５項記載の方法。 - （７）酵母は連続醗酵で生育させる、特許請求の範囲第
１項から第６項のいずれか１項に記載の方法。 - （８）組換えＤＮＡ技術により修飾した酵母を使用し、
オキシダーゼに関する遺伝情報は強力プロモータ、好ま
しくはメタノールオキシダーゼ（ＭＯＸ）プロモータ、
特に￥Ｈａｎｓｅｎｕｌａ￥ ￥ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ
￥ ＣＢＳ４７３２のプロモータの制御下にある、特許
請求の範囲第１項から第７項のいずれか１項に記載の方
法。 - （９）カタラーゼ陰性、オキシダーゼ含有酵母は醗酵終
了後、オキシダーゼ酵素が失活しない乾燥処理、例えば
凍結乾燥、又は細胞を透過性にし、又は不活性化する別
の処理にかける、特許請求の範囲第１項から第８項のい
ずれか１項に記載の方法。 - （１０）特許請求の範囲第１項から第９項のいずれか１
項に記載の方法の使用により得た、オキシダーゼ含有、
カタラーゼ陰性の酵母突然変異体。 - （１１）特許請求の範囲第１０項記載の酵母からオキシ
ダーゼを単離し、任意には次にオキシダーゼをプロセシ
ングし、こうして他の成分を有する組成物に単離するこ
とにより得た、オキシダーゼ又はオキシダーゼ含有組成
物。 - （１２）特許請求の範囲第１０項記載のオキシダーゼ含
有、カタラーゼ陰性の酵母突然変異体又は特許請求の範
囲第１１項記載のオキシダーゼをオキシダーゼに対する
基質、好ましくはエタノールと共に、 （ｉ）洗滌又は漂白方法において過酸化水素のその場所
での形成、 （ｉｉ）オキシダーゼに対する基質の定性および／又は
定量測定、又は （ｉｉｉ）化学合成又は廃棄物の精製方法のわく組内で
オキシダーゼの基質の酸化、 に対する使用。 - （１３）洗浄又は漂白組成物であって、特許請求の範囲
第１０項記載のオキシダーゼ含有、カタラーゼ陰性の酵
母突然変異体又は特許請求の範囲第１１項記載のオキシ
ダーゼを含有することを特徴とする、上記組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL8602978 | 1986-11-24 | ||
| NL8602978 | 1986-11-24 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63137674A true JPS63137674A (ja) | 1988-06-09 |
| JPH0365753B2 JPH0365753B2 (ja) | 1991-10-14 |
Family
ID=19848877
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62168499A Granted JPS63137674A (ja) | 1986-11-24 | 1987-07-06 | オキシダ−ゼの製造法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0242007B1 (ja) |
| JP (1) | JPS63137674A (ja) |
| AT (1) | ATE58169T1 (ja) |
| DE (1) | DE3765978D1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02276568A (ja) * | 1988-12-20 | 1990-11-13 | Rhein Biotech G Fuer Neue Biotechnol Prozesse & Prod Mbh | Ｃ↓１資化性微生物の変異株およびｃ↓１資化性微生物内での蛋白質の製造方法 |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2218099A (en) * | 1988-05-05 | 1989-11-08 | Unilever Plc | Process for preparing a catalase-free oxidase |
| GB8826401D0 (en) * | 1988-11-11 | 1988-12-14 | Unilever Plc | Bleach composition |
| US5919684A (en) * | 1991-03-11 | 1999-07-06 | Moldowan Lab Inc. | Process for the reduction of catalase activity in alcohol oxidase |
| US5204261A (en) * | 1991-04-24 | 1993-04-20 | Phillips Petroleum Company | Catalase-negative pichia pastoris |
| ES2264181T3 (es) * | 1997-10-01 | 2006-12-16 | Dsm Ip Assets B.V. | Procedimiento para la produccion de proteinas. |
| DE102005053529A1 (de) * | 2005-11-08 | 2007-06-21 | Henkel Kgaa | System zur enzymatischen Generierung von Wasserstoffperoxid |
| ES2740449T3 (es) * | 2015-12-22 | 2020-02-05 | Bisy E U | Célula de levadura |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5519094A (en) * | 1978-07-10 | 1980-02-09 | Kernforschungsanlage Juelich | Microbiological production of alcoholoxidase |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2308013A1 (de) * | 1973-02-17 | 1974-09-12 | Behringwerke Ag | Katalasearme glucoseoxidase und verfahren zu ihrer gewinnung |
| USRE32016E (en) * | 1976-12-10 | 1985-10-29 | Eastman Kodak Company | Analysis of lactic acid or lactate using lactate oxidase |
| CA1157399A (en) * | 1979-06-05 | 1983-11-22 | Thomas R. Hopkins | Alcohol oxidase from pichia-type yeasts |
| US4414334A (en) * | 1981-08-07 | 1983-11-08 | Phillips Petroleum Company | Oxygen scavenging with enzymes |
| EP0173378B1 (en) * | 1984-07-27 | 1991-06-12 | Unilever N.V. | Process for preparing a polypeptide by culturing a transformed microorganism, a transformed microorganism suitable therefor and dna sequences suitable for preparing such microorganism |
-
1987
- 1987-06-05 AT AT87201055T patent/ATE58169T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-06-05 EP EP87201055A patent/EP0242007B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-05 DE DE8787201055T patent/DE3765978D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-07-06 JP JP62168499A patent/JPS63137674A/ja active Granted
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5519094A (en) * | 1978-07-10 | 1980-02-09 | Kernforschungsanlage Juelich | Microbiological production of alcoholoxidase |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02276568A (ja) * | 1988-12-20 | 1990-11-13 | Rhein Biotech G Fuer Neue Biotechnol Prozesse & Prod Mbh | Ｃ↓１資化性微生物の変異株およびｃ↓１資化性微生物内での蛋白質の製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0365753B2 (ja) | 1991-10-14 |
| EP0242007B1 (en) | 1990-11-07 |
| EP0242007A1 (en) | 1987-10-21 |
| ATE58169T1 (de) | 1990-11-15 |
| DE3765978D1 (de) | 1990-12-13 |
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