JPH0365753B2 - - Google Patents
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- JPH0365753B2 JPH0365753B2 JP62168499A JP16849987A JPH0365753B2 JP H0365753 B2 JPH0365753 B2 JP H0365753B2 JP 62168499 A JP62168499 A JP 62168499A JP 16849987 A JP16849987 A JP 16849987A JP H0365753 B2 JPH0365753 B2 JP H0365753B2
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は酵母がオキシダーゼを産生する条件下
で酵母を好気醗酵させ、所望の場合産生されたオ
キシダーゼを酵母細胞から単離することによるオ
キシダーゼの製造方法に関する。 オキシダーゼはある基質の特異的酸化反応を触
媒し、それによつてH2O2を産生する酵素である。
オキシダーゼの一つとして、ハンゼヌラ・ポリモ
ルフア（Hansenula polymorupha）、カンジ
ダ・オイジニイ（Candida boidinii）、ピキア・
パストリス（Pichia pastoris）等のメタノール
資化（メチロトローフともいう）酵母がメタノー
ル中で生育できるようにするメタノールオキシダ
ーゼ（MOX）がある。MOXはメタノールのホ
ルムアルデヒドと過酸化水素への酸化を触媒とす
るが、このとき分子状酸素が電子受容体として作
用する。生成したホルムアルデヒドは、異化作用
（この場合、ホルムアルデヒドはギ酸、最終的に
は二酸化炭素に編纂される）又は同化作用（この
場合、細胞物質がキシロース−リン酸経路で合成
される）に用いられる。ホルムアルデヒド生成後
のこれらの過程においては、MOX以外の酸素が
重要な役割を果たしている。即ち、同化過程にお
いてはジヒドロキシアセトンシンテターゼが重要
であり、異化過程においてはホルムアルデヒドデ
ヒドロゲナーゼとホルミエートデヒドロゲナーゼ
が鍵を握る酵素である。オキシダーゼによつて生
成した過酸化水素は生体に対して非常に強い毒性
を有しているが、現在理解されているところによ
れば、他の酵素、即ちカタラーゼによつて直ちに
無毒化される。 オキシダーゼの他の例は他のアルコールオキシ
ダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グリセロール
オキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、アル
デヒドオキシダーゼ、アミンオキシダーゼ、アリ
ールアルコールオキシダーゼ、ガラクトースオキ
シダーゼ、ソルボースオキシダーゼ、尿酸オキシ
ダーゼおよびキサンチンオキシダーゼである。 オキシダーゼは各種目的に対し使用できる。重
要な使用は洗浄および漂白分野にある。洗浄又は
漂白処理中オキシダーゼの存在は同時にオキシダ
ーゼに対する適当な基質が存在する場合その場所
で過酸化水素を形成することができる。過酸化水
素は漂白剤活性を示しTAED（テトラアセチルエ
チレンジアミン）のような漂白剤前駆体と協力し
て過酸のような低温で活性である漂白剤を形成す
ることができる。洗浄剤又は漂白剤自体は過酸化
水素を含有しないが、洗浄又は漂白工程中その場
所で過酸化水素の形成を触媒する酵素のみを含む
この系の重要な利点は貯蔵および輸送中プロテア
ーゼ、リパーゼなどのような洗浄組成物成分の不
活性化が防止されることである。オキシダーゼの
この使用は英国特許第1225713号および同2101167
号明細書およびドイツ特許第2557623号明細書に
記載される。 オキシダーゼの別の使用は定性および／又は定
量分析の分野に、例えば醗酵液のような調査すべ
き系のアルコール含量を測定するためにある。分
析はパーオキシダーゼが触媒する着色物質の酸化
によつて形成される過酸化水素の分析に基づく。 オキシダーゼは化学合成又は基質の酸化を触媒
するために廃棄物の精製方法のわく組内で使用す
ることもできる。 これらの大部分の使用に対し疑いなく洗浄又は
漂白組成物の成分として、そして分析における助
剤としての使用に対し形成する過酸化水素を分解
するカタラーゼをオキシダーゼが含まないことが
非常に重要なことである。メタノール上で Hansenula polymorpha、Candida boidinii、
Pichia pastorisなどのようなメチロトローフ性
酵母の醗酵によるメタノールオキシダーゼ
（EC1.1.3.13.）のような微生物学的に生産される
オキシダーゼに関する周知の問題は、形成する過
酸化物をほとんど即刻分解し、従つて有効な漂白
剤活性又は基質濃度の正確な分析を全く不可能に
する天然カタラーゼ酵素を常に随伴することであ
る（Veenhuis、M.、van Dijken、J.P.および
Harder、W.（1983）、「Advances in Microbial
Physiology」、Rose、A.H.、Gareth Morris、J.
およびTempest、D.W.、編輯、24巻、１〜82頁、
Academic Press、New York）。生成物からカ
タラーゼを大部分除去し又はこれを不活性化し、
こうして活性カタラーゼを実質的に含まないオキ
シダーゼを得る方法は既知である（例えば英国特
許第2101167号明細書参照）ことは真実である。
しかし、工業的適用に対してはこれらの方法（例
えばイオン交換クロマトグラフイ又はゲル濾過に
よるカタラーゼ除去およびドデシル硫酸ソーダ
（SDS）又はアジ化ソーダによる処理によるカタ
ラーゼの不活性化など）は余りに高価にすぎ、や
つかいで、多くの場合不適当であり、又はアジ化
ソーダの場合毒性物質さえ導入される。 従つてカタラーゼを含まないオキシダーゼを技
術的および経済的に正当な方法で収得しうる方法
の要求がある。カタラーゼ陰性の突然変異体を使
用する微生物学的生産はこの要求を満たすが、こ
れは実行できないようである。その理由は資料に
よればオキシダーゼに対する基質を微生物のすぐ
れた生育およびオキシダーゼの強い形質発現のた
めに添加した栄養培地で培養する場合、カタラー
ゼを有しない生物は死亡の運命にあることは予期
できるからである。 メタノールオキシダーゼ（MOX）の場合、
MOX、ホルミエートデヒドロゲナーゼ、ホルム
アルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロキシアセ
トンシンチターゼおよびカタラーゼの形成はグル
コース抑制、およびグリセロールおよびマンニト
ール抑制に支配されることは既知である。微生物
を非常に低濃度のグルコース、グリセロール又は
マンニトールで培養する場合MOX合成の抑制解
除が起こるが、その場合でもMOX生産は比較的
ごく少量である。 上記および以下の説明の十分な理解を得るため
にいくつかの定義が適当である。 インダクターはプロモータとの相互作用によ
り、有効なリプレツサーの不活性化により、又は
リプレツサー遺伝子の遮断により遺伝子の転写を
促進する化合物である。リプレツサーはプロモー
タとの相互作用により、又はリプレツサータン白
遺伝子の活性化により遺伝子の転写を阻止する化
合物である、遺伝子産物の合成（遺伝子の転写）
は誘導物質の作用（誘導）により、又はリプレツ
サー仲介の抑制（抑制解除）により行なうことが
できる。MOXの場合メタノールはバツチ式およ
び連続式培養の双方で誘導物質として作用する。
グリセロール、ソルビトール、グルコースおよび
エタノールはバツチ式および連続式培養における
既知のリプレツサーである。バツチ培養における
低濃度のグリセロール、ソルビトールおよびグル
コースの条件下で、および定常状態連続培養にお
いて低稀釈割合でMOXの抑制解除が起こる。 MOX合成の完全な誘導は微生物を唯一の炭素
源としてメタノール上で、又はメタノールとグル
コース、グリセロール又はマンニトールの特定混
合物上で培養する場合のみ起こることは既知であ
る〔Eggeling and Sahm、Arch Microbiol.127
（1980）119〜124およびArch.Microbiol.130
（1981）362〜365参照〕。これらの著者は代謝産物
ではないメタノール自体はMOX合成の誘導の原
因となることを酵母Hansenula polymorphaに対
する彼らの試験から結論している。これらの刊行
物から抑制又は抑制解除状況における発現レベル
は誘導状況における発現レベルに比較して低い、
すなわち完全なクルコース抑制下で１〜２％、連
続培養における低生育割合でグルコース又はグリ
セロール抑制解除下で約10％の大きさのオーダで
あることを推量できる。実際に、これらの刊行物
の１つ〔Arch.Microbiol.127（1980）119〜124〕
には、突然変異体55／11としHansenula
polymorphaのカタラーゼ陰性突然変異体が記載
され、この突然変異体はメタノール上で生育でき
ないため、抑制解除の条件下でグリセロール上に
生育させる場合、メタノールオキシダーゼを生産
する。バツチ培養ではカタラーゼ陰性突然変異体
のMOX生産は野生型、すなわちカタラーゼ生産
性の、菌株がグリセロール上に生産する量の約50
％であつた。野生型菌株のメタノール上での
MOX生産に比較して、カタラーゼ陰性突然変異
体のMOX生産は約17％に過ぎなかつた。カタラ
ーゼを含まないオキシダーゼ標品はこのような比
較的小さい生産性は工業的規模での生産には不適
である。 上記資料の他に、関連性の低い他のいくつかの
刊行物は挙げる価値がある。Chem.Abst.88
（1978）185105wにはG.T.Miwaら．、Arch.
Biochem.Biophys.187（1978）464〜475を引用
し、これにはチトクロームｐ−450および
NADPHを含有するカタラーゼおよびアルコー
ルデヒドロゲナーゼを含まない再構成系によるエ
タノールの直接酸化が記載される。NADPHの
存在を必要とすることからみてこの系は分子状酸
素によりアルコール化合物を酸化できるMOXの
ようにオキシダーゼとして作用しないであろう。
従つてオキシダーゼを産生するカタラーゼ陰性酵
母突然変異体の使用に関し情報又は方向を全く与
えない別の系が記載される。 EP−Ａ−0019937（PHILLIPS PETROLEUM
CO.）にはアルコールオキシダーゼの生産方法が
記載され、この方法ではメタノール−資化性
Pichia−型微生物、例えばPichia Pastorisが使
用される。Pichia属のエタノール−資化性微生物
から、反応 RCH2OH＋O2→RCHO＋H2O2 （式中、Ｒ＝Ｈ、CH3、C2H5又はC3H7）を触媒
する酵素標品が記載され、ここにはカタラーゼを
含まない酵素がいくつかの精製処理後に製造され
る。この方法には上記した不利がある。さらに特
許公報自体が精製アルコールオキシダーゼ中に尚
いくつかの酵素が存在することを示唆している。 EP−Ａ−0071990（PHILLPS PETROLEUM
CO.）には水性液から環境酸素の除去が記載さ
れ、この除去はアルコールの存在で、任意にはカ
タラーゼを含むアルコールオキシダーゼを含む酵
素的脱酸素化系により触媒される。 Hansenula属およびPichia属の酵母は使用でき
るが、本発明によるカタラーゼ陰性突然変異体の
使用は記載も示唆もされていない。反対にカタラ
ーゼの存在は承認され、従つて使用酵素標品の性
質および目的は本発明のものとは異る。 驚くべきことに、カタラーゼを含まないメタノ
ールオキシダーゼの微生物学的生産は、酵母
Hansenula polymorphaのカタラーゼ陰性突然変
異体をメタノールおよびグルコースのような他の
炭素源の存在で酵母に適する栄養培地に生育させ
る場合、序文で述べたような方法により工業的規
模で実現できることがわかつた。この場合メタノ
ールはオキシダーゼ遺伝子の発現を誘導し、そし
て他の炭素源に加えてオキシダーゼに対する基質
となりうるものであり、一方形成する過酸化物の
毒性効果はメタノール対他の炭素源の適当な混合
比を使用することにより防止できる。カタラーゼ
陰性突然変異体の形成過程で何が起るかは明らか
ではないが、いくつかの突然変異が同時に起こる
ことは十分にありうるであろう。例えば、一層正
確な試験後Hansenula polymorphaのカタラーゼ
陰性突然変異体はチトクローム−Ｃ−パーオキシ
ダーゼの含量を増加させる結果となつたが、これ
は多分カタラーゼが行なうのと同じ方法で形成
H2O2を無毒化するらしい。これは突然変異によ
り、又はカタラーゼ陰性酵母の適応性により起こ
るかについては尚明らかでない。 上記カタラーゼ陰性Hansenula polymorphaの
代りに、他のカタラーゼ陰性酵母も使用できる。
生産されるオキシダーゼにより、メタノール以外
の化合物、例えばアミンオキシダーゼの製造にお
けるメチルアミンは基質であることもでき、誘導
剤として使用することもできる。従つて本発明は
メタノールオキシダーゼの生産のみに限定されな
い。 各種炭素源はグルコースの代りに使用できる。
従つて一般的意味では本発明は酵母がオキシダー
ゼを生産する条件下で酵母の好気醗酵を行ない、
所望の場合生産オキシダーゼを酵母細胞から単離
するオキシダーゼ含有組成物の製造方法を含み、
その特徴は酵母のカタラーゼ陰性突然変異体を次
の物質の存在で酵母に適する栄養培地に生育させ
ることである： (a) オキシダーゼ遺伝子の発現を誘導し、オキシ
ダーゼに対し基質ともなりうるいわゆる誘導基
質、および (b) 選択した酵母種に対し適する別の炭素源、誘
導基質対他の炭素源のモル比は形成酵母および
形成オキシダーゼが誘導基質の酸化により有害
作用を受けないような比率である。 本明細書において「組成物」は各種成分の混合
物およびいわば、例えばカプセル形にオキシダー
ゼを包装した標品の双方を意味する。 本発明に従つてHansenula属又はPichia属、特
にHansenula polymorpha種又はPichia
pastoris種の酵母のカタラーゼ陰性突然変異体、
例えばカタラーゼ陰性突然変異体Hansenula
polymorpha55／11、ATCC46059を使用するこ
とは好ましい。本発明は疑いなくこの１種の突然
変異体に限定されるものではない。他のカタラー
ゼ陰性突然変異体はランダムに任意の突然変異を
導入し、得た突然変異体を次に選択することによ
り、又は特にヨーロツパ特許出願0173378（A2）
明細書に記載のように定方向突然変異方法により
得ることができる。 本発明に従つてオキシダーゼに対する遺伝情報
は強いプロモータの制御下にある酵母を使用する
ことがさらに好ましくその結果大収量のオキシダ
ーゼを得ることができる。この例はMOXプロモ
ータ、特にHansenula polymorpha CBS4732の
MOXプロモータである。これは上記Hansenula
polymorpha55／11、ATCC46059酵母に天然に
存在するが、他の酵母については既知のDNA組
換え技術により達成できる。プロモータの強さは
メタノール上で培養したHansenula polymorpha
の野生型菌株のMOX含量が細胞タン白の30％の
大きさのオーダにある事実から明らかである。 他の強いプロモータの例はメチロトローフ性酵
母のジヒドロキシアセトンシンテターゼ（DAS）
プロモータおよびアミンオキシダーゼを生産する
酵母のアミンオキシダーゼプロモータである。 工業的規模での生産と関連して本発明に係る酵
母は連続式醗酵で培養することが好ましい。しか
し、「バツチ式」醗酵又は「フエドバツチ式
（fedbatch）」醗酵は除外しない。「フエドバツチ
式」とは基質を初めに１回で添加せずに、全醗酵
中調整できる基質濃度を達成するように徐徐に添
加する「バツチ式」醗酵を意味する。 本発明に従つてオキシダーゼ遺伝子として好ま
しくはメタノールオキシダーゼ遺伝子、例えば
Hansenula polymorpha CBS4732の既知MOX
と同じアミノ酸配列又は酵素工学により得たこの
配列の誘導体、又は実際に機能性を有するその修
飾体を有するメタノールオキシダーゼをコードす
るメタノールオキシダーゼ遺伝子を使用すること
が好ましい。メタノールオキシダーゼと合せてメ
タノールを誘導基質として使用することが好まし
い。メタノールに対すると同様にMOX酵素は地
の各種基質、例えばエタノール、ｎ−プロパノー
ル、ｎ−ブタノール、ｎ−アミルアルコールに対
し、および僅かな程度であるがメチルセルロシ
ブ、エチレングリコール、ベンジルアルコール、
イソプロパノール、イソアミルアルコールおよび
プロピレングリコールのような物質に対し活性を
有するらしい。エタノールのようなこれらの物質
のいくつかは、洗滌および漂白組成物にメタノー
ルオキシダーゼを使用する場合基質として供する
のに非常に適する。これは比較的安価で毒物学的
に許容できるからである。 醗酵中、Hansenula又はPichiaのような酵母に
適する栄養培地が使用され、これはこの微生物に
適する炭素源を含有しなければならない。適当な
炭素源は当業者には既知であり、又は試験により
容易に決定できる。例えばグルコースは適する
が、他の糖、例えばソルボース、キシロース、ソ
ルビトールおよびグリセロールなどのような他の
物質も炭素源として使用することができ、又糖密
のような商業的に入手しうる炭素源も考慮しう
る。適当な栄養培地はEgliら．、Arch.Microbiol.
124（1980）115〜121から既知である。 本発明に従つて醗酵中炭素源量と誘導物質、例
えばメタノール量間の適比を確定することは重要
である。 本発明の好ましい態様は選択した酵母種に適す
る炭素源、例えばグルコースおよびメタノールの
存在で培養することを特徴とし、メタノール：グ
ルコースのモル比は（0.025〜３）：１であり、好
ましくは（0.8〜1.8）：１である。 カタラーゼ陰性突然変異体Hansenula
polymorpha55／11，ATCC46059の0.1時間-1の
稀釈割合について連続醗酵でこれらのメタノー
ル／グルコース混合物による試験では、メタノー
ル上で培養したカタラーゼ生産性野生型菌株の
MOX収量の50％の大きさのオーダにあるMOX
収量を得た。これらの収量はカタラーゼを欠く点
からみても工業規模で使用するに適する。 本発明の好ましい態様によれば、カタラーゼ陰
性オキシダーゼ含有酵母は連続醗酵終了後オキシ
ダーゼ酵素が失活しない乾燥処理にかけ、又は細
胞を透過性にし又は不活性化ささせる別の処理に
かける。凍結乾燥処理は適するようである。 このような乾燥処理の利点は乾燥処理により不
活性化した細胞は５から少なくとも300ミルモ
ル／のメタノール濃度を使用して直ちにH2O2
生産を開始することである。反対に、生活細胞サ
スペンジヨンは75〜300ミリモル／のメタノー
ル濃度を使用する場合遅れ時間を示し、75ミリモ
ル／以下ではH2O2生産は起こらないことがわ
かつた。これはカタラーゼと同様のH2O2分解作
用を有する生活細胞サスペンジヨン中のチトクロ
ームＣパーオキシダーゼの存在により生ずる。こ
の存在は上記した。 メタノール使用濃度が高すぎ、および／又はグ
ルコースに対するメタノールの比が高すぎる場
合、MOX収量は低下し、カルチヤーは死滅さえ
する。メタノール濃度が低すぎると生産が不十分
になるので、オキシダーゼの収量が低い結果にな
る。メタノールを使用しないグルコースのみによ
る突然変異体の生育では野生型菌株の場合におけ
るように、明らかにグルコース抑制の結果として
同じ低MOX活性を得る。 意図的使用に対し、そのまま培養酵母細胞を使
用することを望まないか又はできない場合、酵母
細胞、特にペルオキシソームに蓄積されたオキシ
ダーゼを細胞から単離すべきである。これを行な
うために、ガラス球による細胞の物理的破壊、い
わゆるフレンチプレスにおける処理、又はマント
ンガウリン均質機、超音波処理および酵素的方
法、例えばチモリアーゼによる方法のような細胞
崩壊の通例方法は適用できる。 本発明はこのような酵母生産に本発明方法を利
用することにより得たオキシダーゼを含有し、カ
タラーゼ陰性の酵母突然変異体、およびオキシダ
ーゼ又は本発明により酵母からオキシダーゼを単
離し、できれば次にオキシダーゼを加工し、こう
して他の成分を有する組成物に単離することによ
つて得るオキシダーゼ含有組成物にも関する。 さらに、本発明は本発明によるオキシダーゼ含
有、カタラーゼ陰性の酵母突然変異体の使用、又
は洗浄又は漂白方法における過酸化水素のその場
所での形成に対しオキシダーゼに対する基質と共
にそこから単離したオキシダーゼの使用に関す
る。特にアルコールオキシダーゼを使用する場
合、エタノールはこのような洗浄方法において基
質として使用することが好ましい。 本発明によるオキシダーゼ含有、カタラーゼ陰
性の酵母突然変異体、又はこれらから単離したオ
キシダーゼを含有する洗浄又は漂白剤は本発明の
一態様である。 さらに、本発明は本発明によるオキシダーゼ含
有、カタラーゼ陰性の酵母突然変異体の使用、又
は化学合成又は廃棄物の精製方法のわく組内のオ
キシダーゼの基質に対する酸化に対し、又はオキ
シダーゼに対する基質の定性および／又は定量測
定に対する触媒としてそこから単離したオキシダ
ーゼの使用に関する。 本発明はさらに次の試験部分で説明する。 醗酵条件および培地 Hansenula polymorphaは酵母ペプトンデキス
トロース寒天からのカタラーゼ陰性コロニーとし
て使用し、EgliらのArch.Microliol.124（1980），
115〜121記載の、単独炭素源としてグルコースを
含む培地で37℃で１日予備培養した。 培養は２の培地を含有する３醗酵器で連続
的に行なつた、通気、PHおよび撹拌を調整し、溶
解酸素圧は25％飽和以下に決してしないように注
意した。PHおよび泡の形成は４：１〜１：１比の
シリコン油規準の消泡剤を含有する濃アンモニア
溶液により調整した（Rhone Poulencからの
Rhodorsil426R）。PHは5.0±0.05PHユニツトに調
整した。温度は37±0.2℃に保持した。出入する
培地流を測定し、蠕動ポンプにより所望流速に調
整した。メタノール濃度はカルチヤーをメタノー
ルに適応させるために徐徐に増加した。醗酵の安
定状態は呼吸パラメータを測定することにより
（呼吸商、二酸化炭素の発生割合および酸素呼吸
割合）、および細胞サスペンジヨンおよび細胞溶
解質中のMOX含量を検査することにより試験を
行なつた。 分 析 MOXおよびカタラーゼの測定 細胞サスペンジヨンのMOX活性、細胞を含ま
ない抽出物およびカタラーゼ活性はvan Dijken
らのArch.Microbiol.111（1976），137〜144に従
つて測定した。１ユニツトは7.5のPHを有する空
気飽和0.1Mリン酸塩バツフアー中で37℃で１分
当り使用される1μモルメタノールに相当する。 タン白 タン白はLowryらのJ.Biol.Chem.193（1951），
265〜275の方法に従つて測定した、牛血清アルブ
ミンは標準として使用した。 バイオマス バイオマスの乾燥重量は洗浄細胞サスペンジヨ
ンを100℃で恒量まで乾燥することにより測定し
た。 グルコース、メタノール、蟻酸およびホルムア
ルデヒドはHPLCおよび標準酵素分析により測定
した。 細胞の破壊 崩壊細胞は超音波処理又はチモリアーゼによる
インキユベーシヨンにより得た。 超音波処理 超音波処理は０℃で7.5のPHを有する0.1Mリン
酸カリ溶液により行なつた。この溶液は３ｇのガ
ラスビーズ（平均直径100μｍ）と共に５mlの洗
浄細胞サスペンジヨンを含有した。細胞サスペン
ジヨンはBransonの細胞破壊機タイプＢ−12
（Branson Sonic Power Company）により１分
間５回処理した。処理間に１分の冷却期間を守つ
た。５mlの溶液につき70ワツトの出力を導入し、
そのためにミクロチツプを使用した。 例 メタノール／グルコース上のMOX生産の最適
条件化 Hansenula polymorpha ATCC46059は表Ａ記
載の培地に生育させた。この培地は各種比のメタ
ノール対グルコースを含有した。 図１および表Ｂは４〜５滞留期間後の平衡状態
にある細胞から得た細胞溶解質のMOX比活性を
示す。0.095時間-1の一定稀釈割合でメタノール
対グルコースの比に対し１〜1.8モルメタノール
対１モルグルコースの最適範囲が図１からわかつ
た。 表Ｃには、メタノール、ホルムアルデヒドおよ
びグルコースの残留濃度値を示す。明らかに、最
適比以上のメタノール対グルコース比では、メタ
ノールおよび／又はホルムアルデヒドの濃度は非
常に高くなるので酵母およびオキシダーゼに対し
毒物的に作用し始め、図１からわかるように
MOXの低収量となる。 上記カルチヤーから得た細胞溶解質ではカタラ
ーゼ活性は全く検出できなかつた。 カタラーゼ陰性突然変異体Hansenula
polymorpha55／11，ATCC46059が誘導される
野生型菌株Hansenula polymorpha CBS4732を
多くのメタノール含有培地（メタノール／グルコ
ース，メタノール／グリセロール）上で同一条件
下で培養した。 こうして得たMOX収量は表Ｄに示す。これか
ら最適条件下でカタラーゼ陰性突然変異体は細胞
タン白mgにつき生成したMOXユニツトとして表
わして、メタノールで培養した野生型菌株に対し
49％のMOX遺伝子の発現を示すと思われる。 メタノール／グルコース上で培養した野生型菌
株に対し、突然変異体は最適条件下で52〜62％を
示した。 例 MOXの単離 Hansenula polymorpha ATCC46059は0.095
時間-1の稀釈割合で表Ａに示す培地上で生育させ
た。メタノール対グルコースのモル比は1.13：１
であつた。 細胞の超音波処理に続いて15分12000ｇで遠心
分離し、空気安定性の細胞を含まない抽出物を得
た。 細胞を含まない溶解質のMOX活性は65％飽和
硫酸アンモニウム溶液により沈澱させた。こうし
て得た沈澱は室温で安定であつた。カタラーゼ活
性は沈澱物中に全く検出できなかつた。 硫酸アンモニウムにより得た沈澱は本明細書の
序文に記載の使用に対し適用できる。 例 乾燥細胞の使用 Hansenula polymorpha ATCC46059は2.5
醗酵容器で0.095時間-1の稀釈割合で表Ａ記載の
培地に生育させた。メタノール対グルコースのモ
ル比は1.13：１であつた。 例記載の硫酸アンモニウム方法により単離し
たMOXの比活性は3.3MOXユニツト／mgタン白
であつた。サスペンジヨン中の（全体の）もとの
ままの細胞は0.58MOXユニツト／mgバイオマス
のMOX活性を示した（乾物重量規準で）。細胞
は凍結乾燥装置で150℃で２日減圧乾燥した。乾
燥試料を7.5のPHを有する0.05Mリン酸カリバツ
フア中にサスペンジヨンに復元し、好気条件下で
超音波処理後の活性は1.4MOXユニツト／mgバイ
オマス（乾燥重量）であつた。乾燥後、細胞は少
なくとも１ヶ月室温で安定であつた。乾燥細胞は
カタラーゼ活性を全く含有しなかつた。 表Ａ−生育培地の組成 ｇ／-1 グルコース ５ メタノール ０−2.2 NH4Cl 7.63 KH2PO4 2.81 MgSO4・7H2O 0.59 CaCl2・2H2O 0.055 FeSO4・7H2O 0.0375 MnSO4.H2O 0.014 ZnSO.7H2O 0.022 CuSO4.5H2O 0.004 CoCl2.6H2O 0.0045 Na2MoO4.2H2O 0.0026 H3BO3 0.004 KJ 0.0026 EDTA 0.45 ビオチン 0.000075 チアミン HCl 0.00625 メソ−イノシトール 0.06 ピリドキシン 0.0015 Ｄ−パントテン酸 0.03 【表】 【表】 【表】 【表】
で酵母を好気醗酵させ、所望の場合産生されたオ
キシダーゼを酵母細胞から単離することによるオ
キシダーゼの製造方法に関する。 オキシダーゼはある基質の特異的酸化反応を触
媒し、それによつてH2O2を産生する酵素である。
オキシダーゼの一つとして、ハンゼヌラ・ポリモ
ルフア（Hansenula polymorupha）、カンジ
ダ・オイジニイ（Candida boidinii）、ピキア・
パストリス（Pichia pastoris）等のメタノール
資化（メチロトローフともいう）酵母がメタノー
ル中で生育できるようにするメタノールオキシダ
ーゼ（MOX）がある。MOXはメタノールのホ
ルムアルデヒドと過酸化水素への酸化を触媒とす
るが、このとき分子状酸素が電子受容体として作
用する。生成したホルムアルデヒドは、異化作用
（この場合、ホルムアルデヒドはギ酸、最終的に
は二酸化炭素に編纂される）又は同化作用（この
場合、細胞物質がキシロース−リン酸経路で合成
される）に用いられる。ホルムアルデヒド生成後
のこれらの過程においては、MOX以外の酸素が
重要な役割を果たしている。即ち、同化過程にお
いてはジヒドロキシアセトンシンテターゼが重要
であり、異化過程においてはホルムアルデヒドデ
ヒドロゲナーゼとホルミエートデヒドロゲナーゼ
が鍵を握る酵素である。オキシダーゼによつて生
成した過酸化水素は生体に対して非常に強い毒性
を有しているが、現在理解されているところによ
れば、他の酵素、即ちカタラーゼによつて直ちに
無毒化される。 オキシダーゼの他の例は他のアルコールオキシ
ダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グリセロール
オキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、アル
デヒドオキシダーゼ、アミンオキシダーゼ、アリ
ールアルコールオキシダーゼ、ガラクトースオキ
シダーゼ、ソルボースオキシダーゼ、尿酸オキシ
ダーゼおよびキサンチンオキシダーゼである。 オキシダーゼは各種目的に対し使用できる。重
要な使用は洗浄および漂白分野にある。洗浄又は
漂白処理中オキシダーゼの存在は同時にオキシダ
ーゼに対する適当な基質が存在する場合その場所
で過酸化水素を形成することができる。過酸化水
素は漂白剤活性を示しTAED（テトラアセチルエ
チレンジアミン）のような漂白剤前駆体と協力し
て過酸のような低温で活性である漂白剤を形成す
ることができる。洗浄剤又は漂白剤自体は過酸化
水素を含有しないが、洗浄又は漂白工程中その場
所で過酸化水素の形成を触媒する酵素のみを含む
この系の重要な利点は貯蔵および輸送中プロテア
ーゼ、リパーゼなどのような洗浄組成物成分の不
活性化が防止されることである。オキシダーゼの
この使用は英国特許第1225713号および同2101167
号明細書およびドイツ特許第2557623号明細書に
記載される。 オキシダーゼの別の使用は定性および／又は定
量分析の分野に、例えば醗酵液のような調査すべ
き系のアルコール含量を測定するためにある。分
析はパーオキシダーゼが触媒する着色物質の酸化
によつて形成される過酸化水素の分析に基づく。 オキシダーゼは化学合成又は基質の酸化を触媒
するために廃棄物の精製方法のわく組内で使用す
ることもできる。 これらの大部分の使用に対し疑いなく洗浄又は
漂白組成物の成分として、そして分析における助
剤としての使用に対し形成する過酸化水素を分解
するカタラーゼをオキシダーゼが含まないことが
非常に重要なことである。メタノール上で Hansenula polymorpha、Candida boidinii、
Pichia pastorisなどのようなメチロトローフ性
酵母の醗酵によるメタノールオキシダーゼ
（EC1.1.3.13.）のような微生物学的に生産される
オキシダーゼに関する周知の問題は、形成する過
酸化物をほとんど即刻分解し、従つて有効な漂白
剤活性又は基質濃度の正確な分析を全く不可能に
する天然カタラーゼ酵素を常に随伴することであ
る（Veenhuis、M.、van Dijken、J.P.および
Harder、W.（1983）、「Advances in Microbial
Physiology」、Rose、A.H.、Gareth Morris、J.
およびTempest、D.W.、編輯、24巻、１〜82頁、
Academic Press、New York）。生成物からカ
タラーゼを大部分除去し又はこれを不活性化し、
こうして活性カタラーゼを実質的に含まないオキ
シダーゼを得る方法は既知である（例えば英国特
許第2101167号明細書参照）ことは真実である。
しかし、工業的適用に対してはこれらの方法（例
えばイオン交換クロマトグラフイ又はゲル濾過に
よるカタラーゼ除去およびドデシル硫酸ソーダ
（SDS）又はアジ化ソーダによる処理によるカタ
ラーゼの不活性化など）は余りに高価にすぎ、や
つかいで、多くの場合不適当であり、又はアジ化
ソーダの場合毒性物質さえ導入される。 従つてカタラーゼを含まないオキシダーゼを技
術的および経済的に正当な方法で収得しうる方法
の要求がある。カタラーゼ陰性の突然変異体を使
用する微生物学的生産はこの要求を満たすが、こ
れは実行できないようである。その理由は資料に
よればオキシダーゼに対する基質を微生物のすぐ
れた生育およびオキシダーゼの強い形質発現のた
めに添加した栄養培地で培養する場合、カタラー
ゼを有しない生物は死亡の運命にあることは予期
できるからである。 メタノールオキシダーゼ（MOX）の場合、
MOX、ホルミエートデヒドロゲナーゼ、ホルム
アルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロキシアセ
トンシンチターゼおよびカタラーゼの形成はグル
コース抑制、およびグリセロールおよびマンニト
ール抑制に支配されることは既知である。微生物
を非常に低濃度のグルコース、グリセロール又は
マンニトールで培養する場合MOX合成の抑制解
除が起こるが、その場合でもMOX生産は比較的
ごく少量である。 上記および以下の説明の十分な理解を得るため
にいくつかの定義が適当である。 インダクターはプロモータとの相互作用によ
り、有効なリプレツサーの不活性化により、又は
リプレツサー遺伝子の遮断により遺伝子の転写を
促進する化合物である。リプレツサーはプロモー
タとの相互作用により、又はリプレツサータン白
遺伝子の活性化により遺伝子の転写を阻止する化
合物である、遺伝子産物の合成（遺伝子の転写）
は誘導物質の作用（誘導）により、又はリプレツ
サー仲介の抑制（抑制解除）により行なうことが
できる。MOXの場合メタノールはバツチ式およ
び連続式培養の双方で誘導物質として作用する。
グリセロール、ソルビトール、グルコースおよび
エタノールはバツチ式および連続式培養における
既知のリプレツサーである。バツチ培養における
低濃度のグリセロール、ソルビトールおよびグル
コースの条件下で、および定常状態連続培養にお
いて低稀釈割合でMOXの抑制解除が起こる。 MOX合成の完全な誘導は微生物を唯一の炭素
源としてメタノール上で、又はメタノールとグル
コース、グリセロール又はマンニトールの特定混
合物上で培養する場合のみ起こることは既知であ
る〔Eggeling and Sahm、Arch Microbiol.127
（1980）119〜124およびArch.Microbiol.130
（1981）362〜365参照〕。これらの著者は代謝産物
ではないメタノール自体はMOX合成の誘導の原
因となることを酵母Hansenula polymorphaに対
する彼らの試験から結論している。これらの刊行
物から抑制又は抑制解除状況における発現レベル
は誘導状況における発現レベルに比較して低い、
すなわち完全なクルコース抑制下で１〜２％、連
続培養における低生育割合でグルコース又はグリ
セロール抑制解除下で約10％の大きさのオーダで
あることを推量できる。実際に、これらの刊行物
の１つ〔Arch.Microbiol.127（1980）119〜124〕
には、突然変異体55／11としHansenula
polymorphaのカタラーゼ陰性突然変異体が記載
され、この突然変異体はメタノール上で生育でき
ないため、抑制解除の条件下でグリセロール上に
生育させる場合、メタノールオキシダーゼを生産
する。バツチ培養ではカタラーゼ陰性突然変異体
のMOX生産は野生型、すなわちカタラーゼ生産
性の、菌株がグリセロール上に生産する量の約50
％であつた。野生型菌株のメタノール上での
MOX生産に比較して、カタラーゼ陰性突然変異
体のMOX生産は約17％に過ぎなかつた。カタラ
ーゼを含まないオキシダーゼ標品はこのような比
較的小さい生産性は工業的規模での生産には不適
である。 上記資料の他に、関連性の低い他のいくつかの
刊行物は挙げる価値がある。Chem.Abst.88
（1978）185105wにはG.T.Miwaら．、Arch.
Biochem.Biophys.187（1978）464〜475を引用
し、これにはチトクロームｐ−450および
NADPHを含有するカタラーゼおよびアルコー
ルデヒドロゲナーゼを含まない再構成系によるエ
タノールの直接酸化が記載される。NADPHの
存在を必要とすることからみてこの系は分子状酸
素によりアルコール化合物を酸化できるMOXの
ようにオキシダーゼとして作用しないであろう。
従つてオキシダーゼを産生するカタラーゼ陰性酵
母突然変異体の使用に関し情報又は方向を全く与
えない別の系が記載される。 EP−Ａ−0019937（PHILLIPS PETROLEUM
CO.）にはアルコールオキシダーゼの生産方法が
記載され、この方法ではメタノール−資化性
Pichia−型微生物、例えばPichia Pastorisが使
用される。Pichia属のエタノール−資化性微生物
から、反応 RCH2OH＋O2→RCHO＋H2O2 （式中、Ｒ＝Ｈ、CH3、C2H5又はC3H7）を触媒
する酵素標品が記載され、ここにはカタラーゼを
含まない酵素がいくつかの精製処理後に製造され
る。この方法には上記した不利がある。さらに特
許公報自体が精製アルコールオキシダーゼ中に尚
いくつかの酵素が存在することを示唆している。 EP−Ａ−0071990（PHILLPS PETROLEUM
CO.）には水性液から環境酸素の除去が記載さ
れ、この除去はアルコールの存在で、任意にはカ
タラーゼを含むアルコールオキシダーゼを含む酵
素的脱酸素化系により触媒される。 Hansenula属およびPichia属の酵母は使用でき
るが、本発明によるカタラーゼ陰性突然変異体の
使用は記載も示唆もされていない。反対にカタラ
ーゼの存在は承認され、従つて使用酵素標品の性
質および目的は本発明のものとは異る。 驚くべきことに、カタラーゼを含まないメタノ
ールオキシダーゼの微生物学的生産は、酵母
Hansenula polymorphaのカタラーゼ陰性突然変
異体をメタノールおよびグルコースのような他の
炭素源の存在で酵母に適する栄養培地に生育させ
る場合、序文で述べたような方法により工業的規
模で実現できることがわかつた。この場合メタノ
ールはオキシダーゼ遺伝子の発現を誘導し、そし
て他の炭素源に加えてオキシダーゼに対する基質
となりうるものであり、一方形成する過酸化物の
毒性効果はメタノール対他の炭素源の適当な混合
比を使用することにより防止できる。カタラーゼ
陰性突然変異体の形成過程で何が起るかは明らか
ではないが、いくつかの突然変異が同時に起こる
ことは十分にありうるであろう。例えば、一層正
確な試験後Hansenula polymorphaのカタラーゼ
陰性突然変異体はチトクローム−Ｃ−パーオキシ
ダーゼの含量を増加させる結果となつたが、これ
は多分カタラーゼが行なうのと同じ方法で形成
H2O2を無毒化するらしい。これは突然変異によ
り、又はカタラーゼ陰性酵母の適応性により起こ
るかについては尚明らかでない。 上記カタラーゼ陰性Hansenula polymorphaの
代りに、他のカタラーゼ陰性酵母も使用できる。
生産されるオキシダーゼにより、メタノール以外
の化合物、例えばアミンオキシダーゼの製造にお
けるメチルアミンは基質であることもでき、誘導
剤として使用することもできる。従つて本発明は
メタノールオキシダーゼの生産のみに限定されな
い。 各種炭素源はグルコースの代りに使用できる。
従つて一般的意味では本発明は酵母がオキシダー
ゼを生産する条件下で酵母の好気醗酵を行ない、
所望の場合生産オキシダーゼを酵母細胞から単離
するオキシダーゼ含有組成物の製造方法を含み、
その特徴は酵母のカタラーゼ陰性突然変異体を次
の物質の存在で酵母に適する栄養培地に生育させ
ることである： (a) オキシダーゼ遺伝子の発現を誘導し、オキシ
ダーゼに対し基質ともなりうるいわゆる誘導基
質、および (b) 選択した酵母種に対し適する別の炭素源、誘
導基質対他の炭素源のモル比は形成酵母および
形成オキシダーゼが誘導基質の酸化により有害
作用を受けないような比率である。 本明細書において「組成物」は各種成分の混合
物およびいわば、例えばカプセル形にオキシダー
ゼを包装した標品の双方を意味する。 本発明に従つてHansenula属又はPichia属、特
にHansenula polymorpha種又はPichia
pastoris種の酵母のカタラーゼ陰性突然変異体、
例えばカタラーゼ陰性突然変異体Hansenula
polymorpha55／11、ATCC46059を使用するこ
とは好ましい。本発明は疑いなくこの１種の突然
変異体に限定されるものではない。他のカタラー
ゼ陰性突然変異体はランダムに任意の突然変異を
導入し、得た突然変異体を次に選択することによ
り、又は特にヨーロツパ特許出願0173378（A2）
明細書に記載のように定方向突然変異方法により
得ることができる。 本発明に従つてオキシダーゼに対する遺伝情報
は強いプロモータの制御下にある酵母を使用する
ことがさらに好ましくその結果大収量のオキシダ
ーゼを得ることができる。この例はMOXプロモ
ータ、特にHansenula polymorpha CBS4732の
MOXプロモータである。これは上記Hansenula
polymorpha55／11、ATCC46059酵母に天然に
存在するが、他の酵母については既知のDNA組
換え技術により達成できる。プロモータの強さは
メタノール上で培養したHansenula polymorpha
の野生型菌株のMOX含量が細胞タン白の30％の
大きさのオーダにある事実から明らかである。 他の強いプロモータの例はメチロトローフ性酵
母のジヒドロキシアセトンシンテターゼ（DAS）
プロモータおよびアミンオキシダーゼを生産する
酵母のアミンオキシダーゼプロモータである。 工業的規模での生産と関連して本発明に係る酵
母は連続式醗酵で培養することが好ましい。しか
し、「バツチ式」醗酵又は「フエドバツチ式
（fedbatch）」醗酵は除外しない。「フエドバツチ
式」とは基質を初めに１回で添加せずに、全醗酵
中調整できる基質濃度を達成するように徐徐に添
加する「バツチ式」醗酵を意味する。 本発明に従つてオキシダーゼ遺伝子として好ま
しくはメタノールオキシダーゼ遺伝子、例えば
Hansenula polymorpha CBS4732の既知MOX
と同じアミノ酸配列又は酵素工学により得たこの
配列の誘導体、又は実際に機能性を有するその修
飾体を有するメタノールオキシダーゼをコードす
るメタノールオキシダーゼ遺伝子を使用すること
が好ましい。メタノールオキシダーゼと合せてメ
タノールを誘導基質として使用することが好まし
い。メタノールに対すると同様にMOX酵素は地
の各種基質、例えばエタノール、ｎ−プロパノー
ル、ｎ−ブタノール、ｎ−アミルアルコールに対
し、および僅かな程度であるがメチルセルロシ
ブ、エチレングリコール、ベンジルアルコール、
イソプロパノール、イソアミルアルコールおよび
プロピレングリコールのような物質に対し活性を
有するらしい。エタノールのようなこれらの物質
のいくつかは、洗滌および漂白組成物にメタノー
ルオキシダーゼを使用する場合基質として供する
のに非常に適する。これは比較的安価で毒物学的
に許容できるからである。 醗酵中、Hansenula又はPichiaのような酵母に
適する栄養培地が使用され、これはこの微生物に
適する炭素源を含有しなければならない。適当な
炭素源は当業者には既知であり、又は試験により
容易に決定できる。例えばグルコースは適する
が、他の糖、例えばソルボース、キシロース、ソ
ルビトールおよびグリセロールなどのような他の
物質も炭素源として使用することができ、又糖密
のような商業的に入手しうる炭素源も考慮しう
る。適当な栄養培地はEgliら．、Arch.Microbiol.
124（1980）115〜121から既知である。 本発明に従つて醗酵中炭素源量と誘導物質、例
えばメタノール量間の適比を確定することは重要
である。 本発明の好ましい態様は選択した酵母種に適す
る炭素源、例えばグルコースおよびメタノールの
存在で培養することを特徴とし、メタノール：グ
ルコースのモル比は（0.025〜３）：１であり、好
ましくは（0.8〜1.8）：１である。 カタラーゼ陰性突然変異体Hansenula
polymorpha55／11，ATCC46059の0.1時間-1の
稀釈割合について連続醗酵でこれらのメタノー
ル／グルコース混合物による試験では、メタノー
ル上で培養したカタラーゼ生産性野生型菌株の
MOX収量の50％の大きさのオーダにあるMOX
収量を得た。これらの収量はカタラーゼを欠く点
からみても工業規模で使用するに適する。 本発明の好ましい態様によれば、カタラーゼ陰
性オキシダーゼ含有酵母は連続醗酵終了後オキシ
ダーゼ酵素が失活しない乾燥処理にかけ、又は細
胞を透過性にし又は不活性化ささせる別の処理に
かける。凍結乾燥処理は適するようである。 このような乾燥処理の利点は乾燥処理により不
活性化した細胞は５から少なくとも300ミルモ
ル／のメタノール濃度を使用して直ちにH2O2
生産を開始することである。反対に、生活細胞サ
スペンジヨンは75〜300ミリモル／のメタノー
ル濃度を使用する場合遅れ時間を示し、75ミリモ
ル／以下ではH2O2生産は起こらないことがわ
かつた。これはカタラーゼと同様のH2O2分解作
用を有する生活細胞サスペンジヨン中のチトクロ
ームＣパーオキシダーゼの存在により生ずる。こ
の存在は上記した。 メタノール使用濃度が高すぎ、および／又はグ
ルコースに対するメタノールの比が高すぎる場
合、MOX収量は低下し、カルチヤーは死滅さえ
する。メタノール濃度が低すぎると生産が不十分
になるので、オキシダーゼの収量が低い結果にな
る。メタノールを使用しないグルコースのみによ
る突然変異体の生育では野生型菌株の場合におけ
るように、明らかにグルコース抑制の結果として
同じ低MOX活性を得る。 意図的使用に対し、そのまま培養酵母細胞を使
用することを望まないか又はできない場合、酵母
細胞、特にペルオキシソームに蓄積されたオキシ
ダーゼを細胞から単離すべきである。これを行な
うために、ガラス球による細胞の物理的破壊、い
わゆるフレンチプレスにおける処理、又はマント
ンガウリン均質機、超音波処理および酵素的方
法、例えばチモリアーゼによる方法のような細胞
崩壊の通例方法は適用できる。 本発明はこのような酵母生産に本発明方法を利
用することにより得たオキシダーゼを含有し、カ
タラーゼ陰性の酵母突然変異体、およびオキシダ
ーゼ又は本発明により酵母からオキシダーゼを単
離し、できれば次にオキシダーゼを加工し、こう
して他の成分を有する組成物に単離することによ
つて得るオキシダーゼ含有組成物にも関する。 さらに、本発明は本発明によるオキシダーゼ含
有、カタラーゼ陰性の酵母突然変異体の使用、又
は洗浄又は漂白方法における過酸化水素のその場
所での形成に対しオキシダーゼに対する基質と共
にそこから単離したオキシダーゼの使用に関す
る。特にアルコールオキシダーゼを使用する場
合、エタノールはこのような洗浄方法において基
質として使用することが好ましい。 本発明によるオキシダーゼ含有、カタラーゼ陰
性の酵母突然変異体、又はこれらから単離したオ
キシダーゼを含有する洗浄又は漂白剤は本発明の
一態様である。 さらに、本発明は本発明によるオキシダーゼ含
有、カタラーゼ陰性の酵母突然変異体の使用、又
は化学合成又は廃棄物の精製方法のわく組内のオ
キシダーゼの基質に対する酸化に対し、又はオキ
シダーゼに対する基質の定性および／又は定量測
定に対する触媒としてそこから単離したオキシダ
ーゼの使用に関する。 本発明はさらに次の試験部分で説明する。 醗酵条件および培地 Hansenula polymorphaは酵母ペプトンデキス
トロース寒天からのカタラーゼ陰性コロニーとし
て使用し、EgliらのArch.Microliol.124（1980），
115〜121記載の、単独炭素源としてグルコースを
含む培地で37℃で１日予備培養した。 培養は２の培地を含有する３醗酵器で連続
的に行なつた、通気、PHおよび撹拌を調整し、溶
解酸素圧は25％飽和以下に決してしないように注
意した。PHおよび泡の形成は４：１〜１：１比の
シリコン油規準の消泡剤を含有する濃アンモニア
溶液により調整した（Rhone Poulencからの
Rhodorsil426R）。PHは5.0±0.05PHユニツトに調
整した。温度は37±0.2℃に保持した。出入する
培地流を測定し、蠕動ポンプにより所望流速に調
整した。メタノール濃度はカルチヤーをメタノー
ルに適応させるために徐徐に増加した。醗酵の安
定状態は呼吸パラメータを測定することにより
（呼吸商、二酸化炭素の発生割合および酸素呼吸
割合）、および細胞サスペンジヨンおよび細胞溶
解質中のMOX含量を検査することにより試験を
行なつた。 分 析 MOXおよびカタラーゼの測定 細胞サスペンジヨンのMOX活性、細胞を含ま
ない抽出物およびカタラーゼ活性はvan Dijken
らのArch.Microbiol.111（1976），137〜144に従
つて測定した。１ユニツトは7.5のPHを有する空
気飽和0.1Mリン酸塩バツフアー中で37℃で１分
当り使用される1μモルメタノールに相当する。 タン白 タン白はLowryらのJ.Biol.Chem.193（1951），
265〜275の方法に従つて測定した、牛血清アルブ
ミンは標準として使用した。 バイオマス バイオマスの乾燥重量は洗浄細胞サスペンジヨ
ンを100℃で恒量まで乾燥することにより測定し
た。 グルコース、メタノール、蟻酸およびホルムア
ルデヒドはHPLCおよび標準酵素分析により測定
した。 細胞の破壊 崩壊細胞は超音波処理又はチモリアーゼによる
インキユベーシヨンにより得た。 超音波処理 超音波処理は０℃で7.5のPHを有する0.1Mリン
酸カリ溶液により行なつた。この溶液は３ｇのガ
ラスビーズ（平均直径100μｍ）と共に５mlの洗
浄細胞サスペンジヨンを含有した。細胞サスペン
ジヨンはBransonの細胞破壊機タイプＢ−12
（Branson Sonic Power Company）により１分
間５回処理した。処理間に１分の冷却期間を守つ
た。５mlの溶液につき70ワツトの出力を導入し、
そのためにミクロチツプを使用した。 例 メタノール／グルコース上のMOX生産の最適
条件化 Hansenula polymorpha ATCC46059は表Ａ記
載の培地に生育させた。この培地は各種比のメタ
ノール対グルコースを含有した。 図１および表Ｂは４〜５滞留期間後の平衡状態
にある細胞から得た細胞溶解質のMOX比活性を
示す。0.095時間-1の一定稀釈割合でメタノール
対グルコースの比に対し１〜1.8モルメタノール
対１モルグルコースの最適範囲が図１からわかつ
た。 表Ｃには、メタノール、ホルムアルデヒドおよ
びグルコースの残留濃度値を示す。明らかに、最
適比以上のメタノール対グルコース比では、メタ
ノールおよび／又はホルムアルデヒドの濃度は非
常に高くなるので酵母およびオキシダーゼに対し
毒物的に作用し始め、図１からわかるように
MOXの低収量となる。 上記カルチヤーから得た細胞溶解質ではカタラ
ーゼ活性は全く検出できなかつた。 カタラーゼ陰性突然変異体Hansenula
polymorpha55／11，ATCC46059が誘導される
野生型菌株Hansenula polymorpha CBS4732を
多くのメタノール含有培地（メタノール／グルコ
ース，メタノール／グリセロール）上で同一条件
下で培養した。 こうして得たMOX収量は表Ｄに示す。これか
ら最適条件下でカタラーゼ陰性突然変異体は細胞
タン白mgにつき生成したMOXユニツトとして表
わして、メタノールで培養した野生型菌株に対し
49％のMOX遺伝子の発現を示すと思われる。 メタノール／グルコース上で培養した野生型菌
株に対し、突然変異体は最適条件下で52〜62％を
示した。 例 MOXの単離 Hansenula polymorpha ATCC46059は0.095
時間-1の稀釈割合で表Ａに示す培地上で生育させ
た。メタノール対グルコースのモル比は1.13：１
であつた。 細胞の超音波処理に続いて15分12000ｇで遠心
分離し、空気安定性の細胞を含まない抽出物を得
た。 細胞を含まない溶解質のMOX活性は65％飽和
硫酸アンモニウム溶液により沈澱させた。こうし
て得た沈澱は室温で安定であつた。カタラーゼ活
性は沈澱物中に全く検出できなかつた。 硫酸アンモニウムにより得た沈澱は本明細書の
序文に記載の使用に対し適用できる。 例 乾燥細胞の使用 Hansenula polymorpha ATCC46059は2.5
醗酵容器で0.095時間-1の稀釈割合で表Ａ記載の
培地に生育させた。メタノール対グルコースのモ
ル比は1.13：１であつた。 例記載の硫酸アンモニウム方法により単離し
たMOXの比活性は3.3MOXユニツト／mgタン白
であつた。サスペンジヨン中の（全体の）もとの
ままの細胞は0.58MOXユニツト／mgバイオマス
のMOX活性を示した（乾物重量規準で）。細胞
は凍結乾燥装置で150℃で２日減圧乾燥した。乾
燥試料を7.5のPHを有する0.05Mリン酸カリバツ
フア中にサスペンジヨンに復元し、好気条件下で
超音波処理後の活性は1.4MOXユニツト／mgバイ
オマス（乾燥重量）であつた。乾燥後、細胞は少
なくとも１ヶ月室温で安定であつた。乾燥細胞は
カタラーゼ活性を全く含有しなかつた。 表Ａ−生育培地の組成 ｇ／-1 グルコース ５ メタノール ０−2.2 NH4Cl 7.63 KH2PO4 2.81 MgSO4・7H2O 0.59 CaCl2・2H2O 0.055 FeSO4・7H2O 0.0375 MnSO4.H2O 0.014 ZnSO.7H2O 0.022 CuSO4.5H2O 0.004 CoCl2.6H2O 0.0045 Na2MoO4.2H2O 0.0026 H3BO3 0.004 KJ 0.0026 EDTA 0.45 ビオチン 0.000075 チアミン HCl 0.00625 メソ−イノシトール 0.06 ピリドキシン 0.0015 Ｄ−パントテン酸 0.03 【表】 【表】 【表】 【表】
第１図はメタノール／グルコース混合物上に生
育したHansenula polymorpha菌株ATCC46059
のバイオマス収量およびMOX収量を示す。
育したHansenula polymorpha菌株ATCC46059
のバイオマス収量およびMOX収量を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 酵母がオキシダーゼを産生するような条件下
で酵母を好気的に醗酵し、必要に応じて酵母細胞
から該オキシダーゼを単離することによるオキシ
ダーゼ又はオキシダーゼ含有組成物の製造方法に
おいて、 (a) オキシダーゼ遺伝子の発現を誘導しかつオキ
シダーゼに対する基質ともなりうるようないわ
ゆる誘導基質、及び (b) 選んだ酵母種に適した他の炭素源（ただし、
上記誘導基質の他の炭素源に対する量比は、該
誘導基質の酸化によつて生育酵母及び産生オキ
シダーゼが悪影響を受けないような量比であ
る） の存在下で、酵母のカタラーゼ陰性突然変異株を
該酵母に適した栄養培地中で生育させることを特
徴とする方法。 ２ 特許請求の範囲第１項記載の方法において、
前記酵母のカタラーゼ陰性突然変異株として、ハ
ンゼヌラ（Hansenula）属のもの、好ましくはハ
ンゼヌラ・ポリモルフア種（Hansenula
polymorupha）のもの、特にハンゼヌラ・ポリ
モルフア55／11株（ATCC 46059）、又はピキア
（Pichia）属のもの、好ましくはピキア・パスト
リス（Pichia pastoris）種のものを使用するこ
とを特徴とする方法。 ３ 特許請求の範囲第１項又は第２項記載の方法
において、前記オキシダーゼとしてメタノールオ
キシダーゼを産生させ、かつ好ましくは誘導基質
としてメタノールを使用することを特徴とする方
法。 ４ 特許請求の範囲第３項記載の方法において、
ハンゼヌラ・ポリモルフアCBS4732株の既知メ
タノールオキシダーゼと同一のアミノ酸配列を有
するメタノールオキシダーゼ、又は酵素工学的に
得られる該アミノ酸配列の誘導体を産生させるこ
とを特徴とする方法。 ５ 特許請求の範囲第１項乃至第４項のいずれか
１項記載の方法において、グルコース、キシロー
ス、ソルビトール及びソルボース等の糖、糖蜜等
の市販炭素源、並びにグリセロール等の微生物学
で使用される炭素源から成る群から選択される他
の炭素源を含有する栄養培地中で酵母を培養する
ことを特徴とする方法。 ６ 特許請求の範囲第５項記載の方法において、
炭素源として、メタノール対グルコースのモル比
が（0.025〜３）：１、好ましくは（１〜1.8）：１
のメタノールとグルコースを使用することを特徴
とする方法。 ７ 特許請求の範囲第１項乃至第６項のいずれか
１項記載の方法において、酵母を連続醗酵で生育
させることを特徴とする方法。 ８ 特許請求の範囲第１項乃至第７項のいずれか
１項記載の方法において、組換えDNA技術によ
り修飾した酵母又はその継代培養物にして、その
オキシダーゼに関する遺伝情報が強力なプロモー
ター、好ましくはメタノールオキシダーゼ
（MOX）プロモーター、特にハンゼヌラ・ポリ
モルフアCBS4732株のMOXプロモーターの制御
下にある酵母を使用することを特徴とする方法。 ９ 特許請求の範囲第１項乃至第８項のいずれか
１項記載の方法において、醗酵終了後に、オキシ
ダーゼを含有する前記カタラーゼ陰性酵母を、凍
結乾燥等の該オキシダーゼが失活しないような乾
燥処理、又は細胞を透過性もしくは不活性化する
その他の処理に付すことを特徴とする方法。
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| NL8602978 | 1986-11-24 |
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