JPS63129985A - 遺伝子組み換えで造成された新規プロモ−タ−プロ−ブベクタ−および該ベクタ−を用いて得られる新規プロモ−タ− - Google Patents
遺伝子組み換えで造成された新規プロモ−タ−プロ−ブベクタ−および該ベクタ−を用いて得られる新規プロモ−タ−Info
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- JPS63129985A JPS63129985A JP61277379A JP27737986A JPS63129985A JP S63129985 A JPS63129985 A JP S63129985A JP 61277379 A JP61277379 A JP 61277379A JP 27737986 A JP27737986 A JP 27737986A JP S63129985 A JPS63129985 A JP S63129985A
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規プロモータープローブベクターおよび該ベ
クターを用いて得られるプロモーターに関する。
クターを用いて得られるプロモーターに関する。
さらに詳細には、エシェリキア・コリ(Escheri
chia Co11)起源のy−グルタミル−し−シス
ティン合成酵素(以下、G S H−Iと略称する)遺
伝子のサツカロミセス(Saccharomyces
)属およびエシェリキア・コリでの発現を検出すること
により新規プロモーターのクローニングを行う方法およ
び得られるプロモーターに関する。
chia Co11)起源のy−グルタミル−し−シス
ティン合成酵素(以下、G S H−Iと略称する)遺
伝子のサツカロミセス(Saccharomyces
)属およびエシェリキア・コリでの発現を検出すること
により新規プロモーターのクローニングを行う方法およ
び得られるプロモーターに関する。
近年、遺伝子組み換えに関する研究、技術が発達し、そ
の産業への利用が行われている。その際、外来遺伝子に
コードされたポリペプチドの宿主内での生合成を如何に
効率よく進行させるかは重要な研究開発a*gの一つで
ある。その;inに対し強情性プロモーターの利用は外
来遺伝子を効率よく発現させるために重要な手段であり
、従来より強情性プロモーターを得るために種々の工夫
がなされている。大腸菌におけるプロモータープローブ
ベクターP M C1403(Casadaban、
M、 J、 et an 、、 J、Bacterio
l、 。
の産業への利用が行われている。その際、外来遺伝子に
コードされたポリペプチドの宿主内での生合成を如何に
効率よく進行させるかは重要な研究開発a*gの一つで
ある。その;inに対し強情性プロモーターの利用は外
来遺伝子を効率よく発現させるために重要な手段であり
、従来より強情性プロモーターを得るために種々の工夫
がなされている。大腸菌におけるプロモータープローブ
ベクターP M C1403(Casadaban、
M、 J、 et an 、、 J、Bacterio
l、 。
143、97](1980)]は開開発用されているも
のの一つである。酵母においてもP M C1518(
Caqadaban、M、J、 et aQ 、、M
ethods inEnzymology、 100.
293 (1983))が開発利用されているが、この
場合クローニングされたプロモーター断片と指標酵素で
あるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が融合してしまい、結
果として発現する融合指標酵素の強弱によりプロモータ
ーのクローニングを行うことの欠点を有している。
のの一つである。酵母においてもP M C1518(
Caqadaban、M、J、 et aQ 、、M
ethods inEnzymology、 100.
293 (1983))が開発利用されているが、この
場合クローニングされたプロモーター断片と指標酵素で
あるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が融合してしまい、結
果として発現する融合指標酵素の強弱によりプロモータ
ーのクローニングを行うことの欠点を有している。
そのために、場合によっては強力な活性をもつプロモー
ターが検索されずに終ってしまうこともあった。この欠
点を補うためいろいろな対策が検討されているが、以下
に示すようなβ−ガラクトシダーゼ以外の指標酵素を用
いる。新たなプロモータープローブ系を開発して、より
広い観点からプロモーターを検索することも考慮されて
いる。
ターが検索されずに終ってしまうこともあった。この欠
点を補うためいろいろな対策が検討されているが、以下
に示すようなβ−ガラクトシダーゼ以外の指標酵素を用
いる。新たなプロモータープローブ系を開発して、より
広い観点からプロモーターを検索することも考慮されて
いる。
かかる現状に鑑み本発明者らは、鋭意、研究の結果、従
来のクローニング系では容易に得られなかった種類のプ
ロモーターのクローニングが可能となるよう、新たに指
標酵素としてGSH−Iを用いるクローニング系を開発
し本発明を完成するに至った。以下に本発明のベクター
の作製法、ベクターを使用したプロモーターのクローニ
ングおよび得られたプロモーターの有用性について実施
例をあげて詳細に説明する。
来のクローニング系では容易に得られなかった種類のプ
ロモーターのクローニングが可能となるよう、新たに指
標酵素としてGSH−Iを用いるクローニング系を開発
し本発明を完成するに至った。以下に本発明のベクター
の作製法、ベクターを使用したプロモーターのクローニ
ングおよび得られたプロモーターの有用性について実施
例をあげて詳細に説明する。
なお、実施例1において、エシェリキア・コリ起源のG
S H−1遺伝子をYEpタイプのプラスミドに組み
込んでいるが、もちろんYRp。
S H−1遺伝子をYEpタイプのプラスミドに組み
込んでいるが、もちろんYRp。
YCp、YIpタイプなどのプラスミドベクターに組み
込んで使用することもできる。また、GSH−1遺伝子
の起源としては特にエシェリキア・コリに限るものでは
なく、さらには合成リンターも例示にこだわるものでな
い。実施例2において、酵母染色体をサツカロミセス・
セレビシェ(Saecharomyces Cerev
isiae) Y N N 27より調製しているが、
他のサツカロミセス属、あるいはキャンディダ(Can
dida)属ハンゼヌラ(Hamsenula)属など
の他の酵母起源の染色体を用いても差し支えない。さら
に、実施例3で有用物質製造の例としてグルタチオンの
製造法を述べているが、クローニングしたプロモーター
の下流にG S H−1以外のアミラーゼ、プロテアー
ゼあるいはインターフェロン等の生理活性物質の遺伝子
を接続し、それらの生産を行うことも可能なことは言う
までもない。
込んで使用することもできる。また、GSH−1遺伝子
の起源としては特にエシェリキア・コリに限るものでは
なく、さらには合成リンターも例示にこだわるものでな
い。実施例2において、酵母染色体をサツカロミセス・
セレビシェ(Saecharomyces Cerev
isiae) Y N N 27より調製しているが、
他のサツカロミセス属、あるいはキャンディダ(Can
dida)属ハンゼヌラ(Hamsenula)属など
の他の酵母起源の染色体を用いても差し支えない。さら
に、実施例3で有用物質製造の例としてグルタチオンの
製造法を述べているが、クローニングしたプロモーター
の下流にG S H−1以外のアミラーゼ、プロテアー
ゼあるいはインターフェロン等の生理活性物質の遺伝子
を接続し、それらの生産を行うことも可能なことは言う
までもない。
実施例1
プロモータープローブベクターの作製手順を以下に示す
。
。
以下の説明中組み換えDNAの基本動作は、その分野に
おける常法1例えばモレキュラークローニング(Mol
ecular Cloning、A Labora−t
ory Manual、Co1d Spring
Harbor Labora−tory、 198
2)記載の方法に準拠した。
おける常法1例えばモレキュラークローニング(Mol
ecular Cloning、A Labora−t
ory Manual、Co1d Spring
Harbor Labora−tory、 198
2)記載の方法に準拠した。
まずプラスミドpGSR−100(にJatanabe
。
。
et al、 、 Nucleic Ac1d Re5
earch Vol、 14゜4393 (1986)
]を制限酵素5calで切断、さらにHpa Iで部
分切断し、G S H−1遺伝子を完全に含むDNA断
片を得た後1両端にBa■HIリンカ−を付与した。次
にこのDNA断片をpMC−1585からβ−ガラクト
シダーゼ遺伝子を除いたプラスミドp G S R−1
のBamHI切断部位に挿入しPGSR−150を作製
した。このPGSR−150上のGSH−1遺伝子下流
側のBawHI切断部位をT4ポリメラーゼを用いてフ
ィルインにより除いたプラスミドpGSR−151の上
流側のBamHI部位に、酵母中でプロモーター活性を
発現するDNA断片(P−8)を挿入した。さらに酵母
中での強いGSI−I−I活性の発現のために、pGS
R−1518上のP−8プロモ一ター断片上流側のBa
mHI部位をフィルインにより除いたPGSR−251
8を作製し、残った1ケ所のBamHI切断部位よりエ
キソヌクレアーゼBa131による部分分解を、30℃
、60分間行い切断末端にXholリンカ−を付与した
。次いでT4リガーゼで自己閉環させて、酵母中でGS
H−I活性が発現するプラスミドPGSR−2518−
4を作製した。第1図にこの作成手順を示す。
earch Vol、 14゜4393 (1986)
]を制限酵素5calで切断、さらにHpa Iで部
分切断し、G S H−1遺伝子を完全に含むDNA断
片を得た後1両端にBa■HIリンカ−を付与した。次
にこのDNA断片をpMC−1585からβ−ガラクト
シダーゼ遺伝子を除いたプラスミドp G S R−1
のBamHI切断部位に挿入しPGSR−150を作製
した。このPGSR−150上のGSH−1遺伝子下流
側のBawHI切断部位をT4ポリメラーゼを用いてフ
ィルインにより除いたプラスミドpGSR−151の上
流側のBamHI部位に、酵母中でプロモーター活性を
発現するDNA断片(P−8)を挿入した。さらに酵母
中での強いGSI−I−I活性の発現のために、pGS
R−1518上のP−8プロモ一ター断片上流側のBa
mHI部位をフィルインにより除いたPGSR−251
8を作製し、残った1ケ所のBamHI切断部位よりエ
キソヌクレアーゼBa131による部分分解を、30℃
、60分間行い切断末端にXholリンカ−を付与した
。次いでT4リガーゼで自己閉環させて、酵母中でGS
H−I活性が発現するプラスミドPGSR−2518−
4を作製した。第1図にこの作成手順を示す。
このp GS R−2518−4から酵母中でプロモー
ター活性を発現するP−8部分を除去するために、pG
SR−2518−4のP−8とG S H−I遺伝子接
続部分を含むSacI−BglII断片をpGSR−1
518の同じくSac I−Bgl H切断部位に挿入
し、PGSR−1518−4を作製した。以上をまとめ
て第1図に示す。この後、pGSR−1518−4から
酵母中でプロモーター活性を持つP−8部分を除去する
ため、および新たなりローニング部位としてXho I
切断部位を付与するため、pGSR−1518−4をま
ずBaaHIで切断した。その切断末端をDNAポリメ
ラーゼ■クレノウ断片により平滑化、T4DNAリガー
ゼによりXhoIリンカ−d(pC−C−T−C−G−
A−G−G)を平滑末端に付与、つづいてXhoIで切
断後、T4’ DNAリガーゼで自己閉環させ、目的
とした新規プロモータープローブベクターpPG−10
0を作製した。第2図にその作製手順を図示する。
ター活性を発現するP−8部分を除去するために、pG
SR−2518−4のP−8とG S H−I遺伝子接
続部分を含むSacI−BglII断片をpGSR−1
518の同じくSac I−Bgl H切断部位に挿入
し、PGSR−1518−4を作製した。以上をまとめ
て第1図に示す。この後、pGSR−1518−4から
酵母中でプロモーター活性を持つP−8部分を除去する
ため、および新たなりローニング部位としてXho I
切断部位を付与するため、pGSR−1518−4をま
ずBaaHIで切断した。その切断末端をDNAポリメ
ラーゼ■クレノウ断片により平滑化、T4DNAリガー
ゼによりXhoIリンカ−d(pC−C−T−C−G−
A−G−G)を平滑末端に付与、つづいてXhoIで切
断後、T4’ DNAリガーゼで自己閉環させ、目的
とした新規プロモータープローブベクターpPG−10
0を作製した。第2図にその作製手順を図示する。
実施例2
酵母染色体からのプロモーターのクローニングはまずサ
ツカロミセス属酵母YNN27の染色体1) N Aを
通常の方法、例えばクライヤーらの方法(Method
s in Ce1l Biology。
ツカロミセス属酵母YNN27の染色体1) N Aを
通常の方法、例えばクライヤーらの方法(Method
s in Ce1l Biology。
Vol、 12. p34. Academic Pr
ess、 New York(1975) )で抽出し
、次いで適当な制限酵母、例えばXhoIで切断した後
、その断片を実施例1で作製したプロモータープローブ
ベクターのXhoI切断部位へT4 DNAリガーゼ
を用いて挿入した。このプラスミドを用い、サツカロミ
セス属酵母YNN27の形質転換はネイチャ(Natu
re、 275,104(1,978))記載の方法に
より行った6得られた形質転換株からのGSH−I活性
強発現株の選択は、まず形質転換株が生育しているプレ
ートに2%ニトロプルジッド(5%トリクロル酢酸含有
)水溶液を約10mQ加え室温にて3分間静置後、ニト
ロプルジッド溶液を捨て、次に濃アンモニヤ水を3〜5
薦Ωシヤーレに注いで赤く発色する株を選んだ。これら
の株の中の2株からプラスミドを抽出し、プロモーター
プローブベクターに挿入されていた酵母由来DNA断片
の長さをアガロースゲル電気泳動で調べた結果、それぞ
れ2.5Kbρと1.9Kbpであった。
ess、 New York(1975) )で抽出し
、次いで適当な制限酵母、例えばXhoIで切断した後
、その断片を実施例1で作製したプロモータープローブ
ベクターのXhoI切断部位へT4 DNAリガーゼ
を用いて挿入した。このプラスミドを用い、サツカロミ
セス属酵母YNN27の形質転換はネイチャ(Natu
re、 275,104(1,978))記載の方法に
より行った6得られた形質転換株からのGSH−I活性
強発現株の選択は、まず形質転換株が生育しているプレ
ートに2%ニトロプルジッド(5%トリクロル酢酸含有
)水溶液を約10mQ加え室温にて3分間静置後、ニト
ロプルジッド溶液を捨て、次に濃アンモニヤ水を3〜5
薦Ωシヤーレに注いで赤く発色する株を選んだ。これら
の株の中の2株からプラスミドを抽出し、プロモーター
プローブベクターに挿入されていた酵母由来DNA断片
の長さをアガロースゲル電気泳動で調べた結果、それぞ
れ2.5Kbρと1.9Kbpであった。
実施例3
実施例2で選択した2、5Kbpの酵母由来の染色体を
挿入したプラスミド(以下、pPG−200と略称する
)を保持する形質転換株を100■QのSD培地グルコ
ース2%、イーストナイトロジェンベース0.67%、
アデニン硫酸 ・塩0.002%、トリプトファン0.
002%)に1白金耳葉桜種、30℃24時間振どう培
養後、遠心分離により集菌、ガラスピーズで菌体を粉砕
して抽出液を得た。この抽出液を粗酵素液としてジャー
ナルオブジェネラルマイクロバイオロジー(J 、Ge
neral Microbiology、128゜10
47(1982) )記載の方法でG S H−I活性
を測定した結果、コントロールであるYEP−24を保
持するYNN27の活性が10n mol/mgρro
tein/hr以下であるのに対し、本形質転換株の場
合は130n mol/mg protein/hrの
活性を示した。さらに、この抽出液中のグルタチオン含
量をアナリチカル・バイオケミストリー(Anal、B
iochem、* 27,502(1969))の方法
で測定した。結果はPPG−200を保持するYNN2
7株は0.9%(w/w)とYEp−24を保持するコ
ントロールのYNN27の0.5%(%i/w)に比ベ
グルタチオン含址が約2倍に増大していた。
挿入したプラスミド(以下、pPG−200と略称する
)を保持する形質転換株を100■QのSD培地グルコ
ース2%、イーストナイトロジェンベース0.67%、
アデニン硫酸 ・塩0.002%、トリプトファン0.
002%)に1白金耳葉桜種、30℃24時間振どう培
養後、遠心分離により集菌、ガラスピーズで菌体を粉砕
して抽出液を得た。この抽出液を粗酵素液としてジャー
ナルオブジェネラルマイクロバイオロジー(J 、Ge
neral Microbiology、128゜10
47(1982) )記載の方法でG S H−I活性
を測定した結果、コントロールであるYEP−24を保
持するYNN27の活性が10n mol/mgρro
tein/hr以下であるのに対し、本形質転換株の場
合は130n mol/mg protein/hrの
活性を示した。さらに、この抽出液中のグルタチオン含
量をアナリチカル・バイオケミストリー(Anal、B
iochem、* 27,502(1969))の方法
で測定した。結果はPPG−200を保持するYNN2
7株は0.9%(w/w)とYEp−24を保持するコ
ントロールのYNN27の0.5%(%i/w)に比ベ
グルタチオン含址が約2倍に増大していた。
第1図はプラスミドpGSR−1518−4の作製手順
を示す説明図、第2図はプロモータープローブベクター
pPG−100の作製手順を示す説明図である。 第1図 第2図 手んV宇市正書 昭和61年12月24日 特許庁長官 黒 1) 明 雄 殿 1、 事件の表示 昭和61年特許願第277379号 2、 発明の名称 3、補正をする者 事件との関係 特許出願人 → べ 東京都千代田区麹町4丁目5番地(〒102)言 6、補正の内容 (1)明細書第2頁末行r 1518Jの記載をr15
85Jと補正する。 (2) 同書第4頁第12行「リンター」の記載を「
リンカ−」と補正する。 (3) 同書第5頁第12〜14行「まずプラスミド
・・・(中略)・・・制限酵素」の記載を [まず、p G S 100 [K、 l1atana
be、 et al、 。 Nucleic Ac1d Re5earch、Vol
、14,4393(1986)]を制限酵素Pst I
で切断し、GSI(−1遺伝子を含むDNA断片をpB
R327(X、 5oberon et al、 。 Gene、Vol、9,287(1980)]のPst
I部位に挿入してプラスミドpGsR100を作製し
た。次に、このpGSR−100を制限酵素」と補正す
る。 (4) 同書同頁下から3行「次に」の記載を「次い
で、」と補正する。 (5) 同書第7頁第2行「ρGSR−2518−4
のp−8」の記載を「まずpGSR−2518−4のp
−8の一部」と補正する。 (6) 同書同頁第9行「除去するため、および新た
な」の記載を「除去し、同時に新たな」と補正する。 (7)同書第9頁第9行「グルコース2%」の記載を「
(グルコース2%」と補正する。
を示す説明図、第2図はプロモータープローブベクター
pPG−100の作製手順を示す説明図である。 第1図 第2図 手んV宇市正書 昭和61年12月24日 特許庁長官 黒 1) 明 雄 殿 1、 事件の表示 昭和61年特許願第277379号 2、 発明の名称 3、補正をする者 事件との関係 特許出願人 → べ 東京都千代田区麹町4丁目5番地(〒102)言 6、補正の内容 (1)明細書第2頁末行r 1518Jの記載をr15
85Jと補正する。 (2) 同書第4頁第12行「リンター」の記載を「
リンカ−」と補正する。 (3) 同書第5頁第12〜14行「まずプラスミド
・・・(中略)・・・制限酵素」の記載を [まず、p G S 100 [K、 l1atana
be、 et al、 。 Nucleic Ac1d Re5earch、Vol
、14,4393(1986)]を制限酵素Pst I
で切断し、GSI(−1遺伝子を含むDNA断片をpB
R327(X、 5oberon et al、 。 Gene、Vol、9,287(1980)]のPst
I部位に挿入してプラスミドpGsR100を作製し
た。次に、このpGSR−100を制限酵素」と補正す
る。 (4) 同書同頁下から3行「次に」の記載を「次い
で、」と補正する。 (5) 同書第7頁第2行「ρGSR−2518−4
のp−8」の記載を「まずpGSR−2518−4のp
−8の一部」と補正する。 (6) 同書同頁第9行「除去するため、および新た
な」の記載を「除去し、同時に新たな」と補正する。 (7)同書第9頁第9行「グルコース2%」の記載を「
(グルコース2%」と補正する。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、グルタチオン合成に関与する酵素、γ−グルタミル
−L−システイン合成酵素の遺伝子を利用したプロモー
タープローブベクター。 2、プロモーター部分を欠失させたν−グルタミル−L
−システイン合成酵素遺伝子を、サッカロミセス(Sa
ccharomyces)属酵母および大腸菌において
複製可能なベクターに組み込んだプロモータープローブ
ベクター。 3、特許請求の範囲第1項または第2項記載のプロモー
タープローブベクターを用いて得られるプロモーター。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61277379A JPS63129985A (ja) | 1986-11-19 | 1986-11-19 | 遺伝子組み換えで造成された新規プロモ−タ−プロ−ブベクタ−および該ベクタ−を用いて得られる新規プロモ−タ− |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61277379A JPS63129985A (ja) | 1986-11-19 | 1986-11-19 | 遺伝子組み換えで造成された新規プロモ−タ−プロ−ブベクタ−および該ベクタ−を用いて得られる新規プロモ−タ− |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS63129985A true JPS63129985A (ja) | 1988-06-02 |
Family
ID=17582705
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61277379A Pending JPS63129985A (ja) | 1986-11-19 | 1986-11-19 | 遺伝子組み換えで造成された新規プロモ−タ−プロ−ブベクタ−および該ベクタ−を用いて得られる新規プロモ−タ− |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS63129985A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6374980B1 (en) | 1999-02-24 | 2002-04-23 | Kabushiki Kaisha Nippon Conclux | Coin sorting method and device |
WO2010116833A1 (en) | 2009-04-08 | 2010-10-14 | Ajinomoto Co., Inc. | Novel yeast having increased content of sulfur-containing compound, screening method thereof, and culturing method thereof |
-
1986
- 1986-11-19 JP JP61277379A patent/JPS63129985A/ja active Pending
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6374980B1 (en) | 1999-02-24 | 2002-04-23 | Kabushiki Kaisha Nippon Conclux | Coin sorting method and device |
WO2010116833A1 (en) | 2009-04-08 | 2010-10-14 | Ajinomoto Co., Inc. | Novel yeast having increased content of sulfur-containing compound, screening method thereof, and culturing method thereof |
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