JPS6287092A - 接着依存性細胞の担体粒子への接着方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、接着依存性細胞の担体粒子への接着方法およ
び装置に関するものである。

〔従来の技術〕

一般に細胞の培養においては、培養対象細胞が浮遊増殖
性細胞、すなわち液体培地中に細胞自体が浮遊した状態
で増殖することが可能な細胞である場合には、その栄養
源である液体培地中に浮遊させることにより培地と接触
させるが、細胞が接着依存性細胞、すなわち液体培地中
における生育および増殖において基質に対する接着が竪
・須の細胞である場合には、適当な基質の表面に当該細
胞を接着させたうえで液体培地と接触させることが必要
である。そして接着依存性細胞を接着させる基質として
は、大きな接着面積を容易に得ることができることから
、最近においては小径の担体粒子（以下、単に「担体粒
子」という。）が用いられるようになってきている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかして目的とする接着依存性細胞（以下、単に「細胞
」という。）の培養を高い効率で行うためには、培養対
象細胞を担体粒子に接着させる際に、当該細胞の混合さ
れた液体培地中において担体粒子を高い分散度で分散さ
せることができれば、当該細胞の接着に利用することが
できる担体粒子の表面の有効利用面積が大きくなり、培
養効率を高めるうえで極めて有利である。

従来において、培養対象細胞を担体粒子に接着させる方
法としては、液体培地中に培養対象細胞と担体粒子とを
混合した系を回転翼によって攪拌する方法が一般的であ
るが、しかしながらこの方法は、液体培地、細胞および
担体粒子からなる混合系に剪断力を加えて分散を行う方
法であるため、回転翼を回転した状態、すなわち細胞お
よび担体粒子の分散を行っている状態では、当該細胞を
担体粒子に接着させることが困難である。したがって細
胞を担体粒子に接着させるために、静置工程と攪拌工程
とを繰り返して実行しなければならず、その結果、担体
粒子に接着する細胞の数に偏りが生じやすく、結局担体
粒子の表面の有効利用面積が小さくなり、接着効率を十
分高めるに至っていない。

このような問題点を解消するために種々の方策が研究さ
れてはいるが、かかる問題点を本質的に解決する細胞の
担体粒子への接着方法および装置は未だ開発されていな
いのが現状である。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、以上のような事情に基いて鋭意研究を重ねた
結果完成されたものであって、その目的とするところは
、液体培地中において細胞を担体粒子に高い効率で接着
させることができる接着方法および装置を提供すること
にある。

本発明方法の特徴とするところは、液体培地、細胞およ
び担体粒子よりなる混合系を実質的に充満するように充
填した容器を水平に対し０〜５５６の範囲の角度に保持
した軸の周りに自転するように回転させて当該混合系を
前記容器と共に定常的に回転させ、これにより当該混合
系内において担体粒子に細胞を接着させる点にある。

また本発明装置の特徴とするところは、水平に対しＯ〜
５５°の範囲の角度に軸支された回転軸を有する容器と
、この容器をその軸の周りに自転するよう回転させる駆
動機構とを有してなり、前記駆動機構は前記容器内に実
質的に充満するように充填された液体培地、細胞および
担体粒子よりなる混合系を容器と共に定常的に回転させ
る機能を有するものである点にある。

以下、本発明について具体的に説明する。

本発明においては、第１図および第２図に示すように、
例えば円筒状の密閉された容器１内に、細胞および担体
粒子２を混合した液体培地３を、容器ｌの内部空間に実
質的に充満されるように充填し、容器１の軸Ｘを水平面
（Ｈ）に対し、０〜５５°、好ましくは０〜４５″、特
に好ましくはＯ〜５″′の範囲の角度（α）に保持させ
た状態で、この軸Ｘの周りに容器１を一定の回転速度で
自転させる。このとき角度（α）が過大であると細胞お
よび担体粒子の液体培地中への分散性が低下し、すなわ
ち細胞および担体粒子２が液体培地３の一部に偏って存
在するようになって効率的な接着を行うことが困難とな
る。

このように容器１を自転させることによって、自転開始
直後の初期期間を経過した後は、容器１内の液体培地３
と細胞および担体粒子２との混合系が液体培地３の粘性
により容器１といわば一体的に機械的な流れのない状態
で軸Ｘの周りに定常的に回転するようになる。従って細
胞および担体粒子２は、容器１内の液体培地３に対する
相対的位置をほとんど変えることなく容器１外に対する
存在位置を変えることとなり、このため容器１内の細胞
および担体粒子２には順次具なる方向から重力が作用す
る状態となり、これにより細胞および担体粒子２が液体
培地３中に高い分散度で分散するようになる。このよう
な状態は、細胞および担体粒子２の比重および大きさ、
液体培地３の比重および粘性、容器１の回転速度などを
適宜に選定することによって実現することができる。

このような回転操作期間中において、混合系内の細胞お
よび担体粒子２に着目すると、１個の細胞または担体粒
子は、第３図に模式的に示すように、液体培地３内にお
いて、相対的に矢印Ａに示すような円運動をすることと
なり、この運動力により細胞および担体粒子２が液体培
地３内において均一に分散するようになるものと推察さ
れる。

この分散は、条件にもよるが極めて速やかに生ずるもの
であり、細胞および担体粒子２は軸Ｘ方向にも分散する
ようになるため、極めて高い分散度で細胞および担体粒
子２を液体培地３内に分散させることができる。

本発明においては、容器内に液体培地、細胞および担体
粒子を充填するために特殊な方法を必要とするものでは
なく、例えば事前に混合された液体培地、細胞および担
体粒子の混合系を充填してもよく、あるいは液体培地に
細胞を加え、次いで担体粒子を加えてもよく、また液体
培地に担体粒子を加え、次いで細胞を加えてもよい。

本発明の適用においては、用いる細胞は担体粒子への接
着性を有するものであれば何ら制限されるものではなく
、例えばヒト子宮ガン細胞１１ｅＬａ。

チャイニーズ−ハムスター肺繊維芽細胞Ｖ”−７９゜ヒ
ト胎児肺細胞ＭＲＣ−５．チンパンジー肝繊維芽細胞、
ヒト包皮細胞、ニワトリ胎児繊維芽細胞、初代サル腎細
胞、マウス転移繊維芽細胞、脳下垂体腫瘍細胞、リンパ
球系細胞などを挙げることができる。

本発明の適用において、用いる液体培地は特に限定され
るものではなく、公知の培地をそのまま使用することが
でき、例えば１〜３０％（Ｖ／Ｖ）の子牛血清または牛
脂児血清を含むミニマルーエッセンシャル培地（ｍｉｎ
ｉｓ＋ａｌ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｍｅｄｉｕｍ　：汎
用細胞培養用基礎培地）、１〜３０％（Ｖ／Ｖ）の子牛
血清または牛脂児血清を含むダルベツコ変法イーグル培
地、　ＨＢ　１０１（ハナバイオロジクス社製）。

ＨＢ１０２（ハナバイオロジクス社製）などを挙げるこ
とができる。これらの液体培地の比重は１．ＯＯ〜１．
０５のものが一般的である。なおこれらの液体培地には
、通常、酸素および炭酸ガスを溶存させることか必要で
ある。また細胞の担体粒子への接着時の液体培地の温度
は、通常、３０〜４０℃であり、好ましくは３７℃であ
る。

本発明の適用において、用いる担体粒子は特に限定され
るものではなく、細胞の接着性さらには増殖性に適した
ものであればよく、例えばポリスチレンなどの合成高分
子材料、またはタン白質、多糖類などの天然高分子材料
により表面が形成された粒子を挙げることができる。か
かる担体粒子は、磁性を存するものであることが有利で
あり、そのような担体粒子を用いるときには、磁石を用
いて担体粒子の補集、移動、処理、その他の取扱いを簡
便に、且つ迅速に行うことが可能となる。

磁性を有する担体粒子としては、磁性体粉を前記高分子
材料により結着してなるもの、磁性を有するコアを前記
高分子材料により被覆してなるものなどを例示すること
ができ、磁性体粉または磁性を有するコアを形成するた
めの磁性体の具体例としては、鉄、コバルト、ニッケル
、これらの合金、低炭素鋼、ケイ素鋼、γ−酸化鉄、フ
ェライト、マグネタイトなどを挙げることができる。担
体粒子の比重は、液体培地の粘性および比重などによっ
ても異なるが、一般的に１．０〜１．５の範囲内のもの
とされる。また担体粒子の粒径は４０〜５００ｎ程度が
好ましく、形状は球形が望ましいが、顆粒状、円筒状な
どであってもよく、不定形のものであっても差支えない
。

液体培地１＋ｄ当りの細胞の播種量は、一般的にはｌＸ
ｌ０’〜ｌＸｌ０’個であり、また使用する担体粒子の
数は、通常、液体培地１ｄ当りｌＸｌ０’〜ｌＸｌ０’
個程度であり、担体粒子１個当たりの播種細胞数は、一
般的には１〜１０個程度である。

本発明においては、容器内には液体培地、細胞および担
体粒子の混合系が、空間が存在しないように充満状態に
充填されていることが望ましく、これによって当該混合
系を容易に容器と共に回転させることが可能となり、空
間が存在するときにもそれが僅かであればその空間が存
在することによる液体培地における撹乱は容器内の混合
系の上層部分の僅かな領域に限定されるので、事実上本
発明による効果を無効とするものではない。しかし容器
内の空間の割合が多くなると混合系を実質的に撹乱する
ことなく容器と共に回転させることが困難となる傾向が
生じ、本発明の目的を達成することができない。従って
本発明においては、容器内における混合系の充填割合が
８０容量％以上の場合を実質的な充満状態とし、好まし
くは９０容量％以上であり、特に好ましくは９８容量％
以上である。

本発明において、容器の自転における回転速度は、細胞
または担体粒子の大きさおよび比重、液体培地の粘度、
容器の形状および大きさなどを勘案して選定され、−概
に規定することはできないが、通常は５〜５０　ｒ、ｐ
、＋＋、　、好ましくは１０〜３０ｒ、ｐ、ｍ、程度の
回転速度となるように容器を回転させる。

また容器の形状は、既述の例におけるように、円筒状で
あることが好ましいが角筒状、あるいは球状であっても
何ら支障がなく、回転方式も特に限定されるものではな
く、すなわち容器の上下が入れ替わるように実質的に鉛
直面内で回転されればよく、例えば第４図に示すように
、回転軸１０の周りに回転するアーム１１の先端に容器
１２を保持させて鉛直面内で円運動させるようにしても
よく、またあるいは第５図に示すように、円筒状容器２
０をその半径方向に伸びる軸Ｙの周りに自転するよう回
転させてもよい。

また、本発明においては、液体培地を交換しながら細胞
の担体粒子への接着を行うこともできる。

第６図は本発明に係る装置の一例を示すものであり、こ
の図の例においては、底板３０と有底筒状の容器本体３
１とにより容器が構成されている。すなわち、容器本体
３１は底板３０に固定して設けた押え機構３２によって
底板３０に０−リング３３を介して押圧され、その内部
空間が接着操作領域とされる。

底板３０は回転スリーブ３５に固定され、この回転スリ
ーブ３５は、ドライベアリング３６を介してスタンド３
７によって保持された外套部材３８に回転自在に保持さ
れ、この回転スリーブ３５の軸Ｚは、水平面（Ｈ）に対
しＯ〜５５　’　、好ましくは０〜４５″、特に好まし
くは０〜５°の範囲の角度（α）に保持されている。底
板３０はその中央に開口を有し、この開口は、液体培地
は透過するが細胞および担体粒子を透過しないフィルタ
一部材、例えばメツシュ４０により塞がれており、この
メツシュ４０を貫通して容器本体３１の内部に伸びる内
導管４１がメツシュ４０に固定されている。この内導管
４１は、容器本体３１の内部に位置された一端に開口４
３を有し、他端は回転スリーブ３５内を通って外方に伸
び、その端部が連結シール部５０において外部よりの供
給管５１に連通ずるようにこれに回転自在に連結されて
いる。

回転スリーブ３５の内周には外温管４２が内導管４１を
囲む二重管構造となるよう固定して設けられ、外温管４
２の一端開口４４は底板３０の開口に連通ずるよう連結
されており、その他端は連結シール部５０において外部
よりの排出管５２に連通ずるようにこれに回転自在に連
結されている。６０は回転スリーブ３５に固定した被動
歯車であり、この被動歯車６０はモータ（図示せず）に
よって駆動される駆動歯車６１と噛合している。

以上の如き構成の装置においては、駆動歯車６１が駆動
されることによって回転スリーブ３５が回転し、これに
よって底板３０と容器本体３１とにより構成される容器
がその軸Ｚの周りに回転され、同時に内導管４１および
外温管４２も共に回転する。

しかしてこの装置においては、液体培地、細胞および担
体粒子の混合系を容器内に実質的に充満するよう充填し
た状態で、容器を水平に対して０〜５５′の範囲の角度
に軸支された軸Ｚの周りに自転するように回転させなが
ら接着操作が行われるため、容器内において、実質上剪
断力を与えることなく高い分散度で細胞および担体粒子
を分散させることができ、従って細胞および担体粒子の
分散を行いながら細胞と担体粒子との接触頻度を十分大
きくすることができ、この結果担体粒子に細胞を効率よ
く接着させることができる。

さらに、この装置においては、液体培地の交換を連続的
に行うことができるために、接着に引き続く培養を効率
よく行うこともできる。

〔実施例〕

以下、本発明の実施例について説明する。

実施例１ 細胞：チャイニーズハムスター肺繊維芽細胞由来のｒＶ
−７９Ｊ細胞 液体培地：酸素および炭酸ガスを溶存する１０％（Ｖ／
Ｖ）牛胎児血清を含むｒ　ＭＥＭ　Ｊ培地（粘度：　０
．０１ｐｏｉｓｅ　、比重：　１．０１）担体粒子：デ
キストラン粒子ｒ　Ｃｙｔｏｄｅｘ　３　Ｊ（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ社製） （粒径：　　１８０ｎ、比重：　１．０３）容１３００
ｔＺの筒状容器中に、乾燥重量で７５０　ａｉｒ（約２
．５　Ｘ　１０’個）の上記担体粒子を入れると共に上
記液体培地を満し、これに８Ｘ１０’個の上記細胞を播
種し、空気が入らないように密閉した後、容器の回転軸
を水平に保持した状態で、温度３７℃の環境下において
４時間に亘り回転数１５ｒ、ｐ、ｍ、で容器を回転させ
、もって細胞の担体粒子への接着操作を行った。

その結果、細胞が接着しなかった担体粒子の割合は約５
％であり、細胞が接着した担体粒子の個々における接着
細胞数は２〜４個（平均３．２個）であり、全担体粒子
上の細胞数は７．５　Ｘ　１０’個であった・ 実施例２ 第６図に示した構成の内容積がＩＩｌの容器を有する装
置を用い、実施例１におけると同様の細胞、液体培地お
よび担体粒子を用いて細胞の接着操作を行なった。すな
わち液体培地１１に対して乾燥重量で３ｇ（約１．０Ｘ
１０’個）の担体粒子を用い、３Ｘ１０’個の細胞を播
種し、容器内に空気が入らないようにしてこれら液体培
地、細胞および担体粒子の混合系を充填し、容器の回転
軸を水平とした状態で、温度３７℃の環境下において４
時間に亘り回転数１２ｒ、ｐ、ｓ、で容器を回転させ、
もって細胞の担体粒子への接着操作を行った。

その結果、細胞が接着しなかった担体粒子の割合は約４
．８％であり、細胞が接着した担体粒子の個々における
接着細胞数は２〜５個（平均２．８個）であり、全担体
粒子上の細胞数は２．７６　Ｘ　１０？個であった。

比較例１ 内容量２ｊ！のスピンナービンを用い、実施例１におけ
ると同様の細胞、液体培地および担体粒子を用いて細胞
の接着操作を行なった。すなわちスピンナービンに液体
培地１ｘに対して乾燥重量で３ｇの担体粒子を加え、つ
いで３Ｘ１０’個の細胞を播種し、温度３７℃の環境下
において回転子の回転数を３０ｒ、ｐ、ｍ、として４時
間に亘り回転させた。

その結果、細胞が接着しなかった担体粒子の割合は約４
８．６％であり、細胞が接着した担体粒子の個々におけ
る接着細胞数は０〜７個（平均１．４個）であり、全担
体粒子上の細胞数は１．５２　Ｘ　１０’個であった。

実施例３ 第６図に示した構成の内容積が１１の容器を有する装置
を用い、実施例１におけると同様の細胞、液体培地およ
び担体粒子を用いて細胞の接着操作を行なった。すなわ
ち液体培地１１に対して乾燥重量で３ｇ（約１．０Ｘ１
０’個）の担体粒子を用い、３Ｘ１０’個の細胞を播種
し、容器内に空気が入らないようにしてこれらの液体培
地、細胞および担体粒子の混合系を充填し、容器の回転
軸の角度を水平面に対して４５°とした状態で、温度３
７℃の環境下において４時間に亘り回転数１５ｒ、ｐ、
ｍ、で容器を回転させ、もって細胞の担体粒子への接着
操作を行った。

その結果、細胞が接着しなかった担体粒子の割合は約５
％であり、細胞が接着した担体粒子の個々における接着
細胞数は２〜４個（平均２．５個）であり、全担体粒子
上の細胞数は２．４　Ｘ　１０’個であった。

〔発明の効果〕

以上詳細に説明したように、本発明によれば、容器内に
液体培地、細胞および担体粒子の混合系を実質的に充満
するよう充填した状態で、しかも容器を水平に対し０〜
５５″の範囲の角度に保持した軸の周りに自転するよう
に回転させるので、容器内において、実質上剪断力を与
えることなく高い分散度で細胞および担体粒子を分散さ
せることができ、従って細胞および担体粒子の分散を行
いながら細胞と担体粒子との接触頻度を十分大きくする
ことができる。この結果、担体粒子に細胞を効率よく接
着させることができ、結局、細胞の担体粒子への接着を
高い効率で達成することができる接着方法および装置を
提供することができる。

そしてこのように細胞を担体粒子に高い効率で接着させ
ることができるので、担体粒子の有効利用面積が大きく
なり、通常、細胞の接着操作に続いて行われる細胞の・
培養工程においても効率的に細胞の培養を行うことが可
能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は本発明の一例についての説明用斜
視図および断面図、第３図は液体培地中における担体粒
子の運動についての説明図、第４図および第５図はそれ
ぞれ本発明の他の例を示す説明用断面図および斜視図、
第６図は本発明に係る装置の一例を示す説明用断面図で
ある。 １．１２．２０・・・容器 ２・・・接着依存性細胞および担体粒子３・・・液体培
地　　　　　３０・・・底板３１・・・容器本体　　　
　　３２・・・押え機構３３・・・０−リング　　　　
３５・・・回転スリーブ３６・・・ドライヘアリング　
３７・・・スタンド３８・・・外套部材　　　　　４０
・・・メツシュ４１・・・内導管　　　　　　４２・・
・外導管５０・・・連結シール部　　　５１・・・供給
管５２・・・排出管　　　　　　６０・・・被動歯車６
１・・・駆動歯車 乍ＩｒＢ 夛２Ｒ 孝３図 ＼−＝コ二

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）液体培地、接着依存性細胞および担体粒子よりなる
   混合系を実質的に充満するように充填した容器を水平面
   に対し０〜５５°の範囲の角度に保持した軸の周りに自
   転するように回転させて当該混合系を前記容器と共に定
   常的に回転させ、これにより当該混合系内において担体
   粒子に接着依存性細胞を接着させることを特徴とする接
   着依存性細胞の担体粒子への接着方法。 ２）水平面に対し０〜５５°の範囲の角度に軸支された
   回転軸を有する容器と、この容器をその回転軸の周りに
   自転するよう回転させる駆動機構とを有してなり、前記
   駆動機構は前記容器内に実質的に充満するように充填さ
   れた液体培地、接着依存性細胞および担体粒子よりなる
   混合系を容器と共に定常的に回転させる機能を有するも
   のであることを特徴とする接着依存性細胞の担体粒子へ
   の接着装置。