JPS627499B2

JPS627499B2 -

Info

Publication number: JPS627499B2
Application number: JP53110771A
Authority: JP
Inventors: Motoko Yoshida; Michio Ito
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1978-09-11
Filing date: 1978-09-11
Publication date: 1987-02-17
Also published as: JPS5539209A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、二次元電気泳動用平板ゲルを用いた
電気泳動法に関する。

従来、血清など体液の臨床化学検査の分野で、
セルローズアセテート膜を用いる一次元電気泳動
法が知られているが、この方法では同時に５種程
度の血清蛋白が分析できるわけであり、最近の医
化学の進歩に伴う検査項目数の増加という要求を
満たすことができなかつた。

上記の問題を解決するため、ポリアクリルアミ
ドゲルを支持体とする二次元電気泳動法を用いる
ことも提案されている。この方法は、一次元目の
電気泳動は、両性電解質を含む細長い円筒状のゲ
ルを用いて等電点の差による試料の分離を行な
い、このゲルをアクリルアミドの濃度勾配を有
し、両性電解質を含まない平板状のゲルの上部一
端に乗せて改めて通電して二次元目の電気泳動を
行ない、分子量差による分離を行なうものであ
る。

しかしながら、一次元目の細長いゲルは柔らか
く、上述のように平板ゲルに密着させる操作を機
械的方法により行なうことは困難であり、人手に
頼らざるを得ない。従つて、再現性に問題もあ
り、また電気泳動装置の自動化を妨げていた。

本発明の目的は、上記欠点を改良した二次元電
気泳動用平板ゲルを用いた電気泳動法を提供する
ことにある。

本発明は、一次元目と二次元目に用いるゲルを
区別せず、同一の平板ゲルを用いて二次元電気泳
動を行なうものである。

すなわち、本発明は、平板の一方向にアクリル
アミドなどの分子篩効果をもつポリマーゲルの濃
度勾配を有し、ゲル全体又はポリマーゲル濃度の
低い部分に両性電解質を加えた平板ゲルを用い、
上記ポリマーゲルの濃度一定方向に一次元目の電
気泳動を行ない、ついで上記ポリマーゲルの濃度
勾配方向に二次元目の電気泳動を行なうものであ
る。

上記平板ゲルの大きさは、一辺の長さ40〜300
mm程度の正方形若しくは矩形、例えば60×80mmあ
るいは110×180mm程度、厚み１〜10mm、好ましく
は２〜４mm程度の容器内に収められ、2.5〜40％
程度、好ましくは４〜30％程度のポリマーゲル濃
度勾配を有する。

このポリマーゲルは、例えばポリアクリルアミ
ドゲルの場合アクリルアミド（モノマー）と、架
橋剤であるNN′メチレンビスアクリルアミドと重
合触媒などを混合し、前記容器内に入れ重合させ
てポリマーゲルとする。NN′メチレンビスアクリ
ルアミドは、アクリルアミドに対し0.5〜15重量
％が望ましい。

具体的例を示せばつぎの通りである。

第液トリスアミノメタン 36.6ｇ IN HCl 48mg NNN′N′テトラメチレンジアミン 0.35ml を水に溶かして100mlとする。

第液アクリルアミド 16ｇ NN′メチレンビスアクリルアミド 0.8ｇを水に溶かして100mlとする。

第液アクリルアミド 60ｇ NN′メチレンビスアクリルアミド２ｇを水に溶かして100mlとする。

第液過硫酸アンモニウム 140mg を水に溶かして100mlとする。

これらの液を：：水：＝１：２：１：４
の比率で混合して４％ゲル用溶液を得る。また
：：＝１：４：３の比率で混合して30％ゲ
ル用溶液を得る。これにそれぞれ１％相当量の両
性電解質を加え、ゲル用溶液の量を容器の内容量
から計算して定め、30％ゲル用溶液を前記容器に
注入すると共に、４％ゲル用溶液を等速で30％ゲ
ル用溶液に加える。それ故容器に注入される液の
アクリルアミド濃度は除々に稀薄になる。このよ
うにしてゲル用溶液を注入したのち、室温で30分
〜１夜放置し、容器の下部30％、上部４％のゲル
濃度勾配を有する平板ゲルが得られる。

前記両性電解質は、必らずしも４％と30％の両
ゲル用溶液に入れる必要はない。後述するように
一次元目の電気泳動は、ゲル濃度の薄い部分でゲ
ル濃度一定方向に行なうのであるから、ゲル用溶
液の稀薄の方にのみ加えておいてもよい。また全
く両性電解質を加えることなく容器への注入を開
始し、溶液が容器の80〜90％程度入つた時点で残
りのゲル用溶液に両性電解質を加えてもよい。

両性電解質は、たとえば２級アミノ基をもつア
ミン（トリエチレンテトラミンなど）と、α・β
不飽和酸（アクリル酸など）の反応生成物が使用
される。これらの合成法は、Acta.Chom、
Scand.、23、2653、1969などに記載されてい
る。ただし、蛋白質の吸収が280μｍ付近にある
ことから上記アミン及び不飽和酸として280ｍμ
付近に吸収をもつもの、あるいは着色しているも
のは好ましくない。

上記アミンと不飽和酸との比率あるいはアミン
及び不飽和酸の種類を変えることにより種々のPH
の両性電解質を得ることができる。、例えばPH３
〜10、PH３〜６、PH５〜８、PH７〜10、PH３〜
５、PH４〜６、PH５〜７、PH６〜８、PH７〜９又
はPH８〜10などのものが得られる。

これらの両性電解質は、ゲル用溶液に対して
0.5〜２％重量％、好ましくは１〜２重量％の範
囲で用いられる。0.5％未満では等価点差による
分離を行なうことが困難であり、さらにより効果
的に分離を行なうには１％以上であることが好ま
しい。両性電解質の量が２％を越えても等電点差
による分離を行なうことができるが、量を増やし
ても効果にほとんど差がなく、かつ両性電解質が
高価であることから２％以下が好ましい。

電気泳動は、前述の平板ゲルのポリマーゲル濃
度の稀薄部分の中央部付近又は中央からアルカリ
側になる端に寄つた部分に試料をつけ、一次元目
の電気泳動を行なう。

すなわち、ポリマーゲル濃度一定方向の両端に
一次元目の電気泳動のための電極をつける。この
際、上述のように、試料が端部に近い所に被着さ
れているときは、それに近い側を陰極とし、たと
えば0.04NのNaOH溶液を電解液として配置す
る。他の側は陽極とし、たとえば0.16NのH₃PO₄
溶液を配置する。これらの電極により通電し、等
電点の差による分離を行なう。ついでポリマーゲ
ル濃度勾配方向に二次元目の電気泳動を行ない分
子量差による分離を行なう。これはポリマーゲル
濃度勾配方向の両側に電極をつけ、PH8.6〜8.9程
度のバツフアを電解液として配置して通電する。
一次元目及び二次元目の通電共、定電圧又は定電
流のいずれかであることが好ましい。定電圧の場
合、５〜50V／cmより好ましくは15〜30V／cmの
電圧が望ましい。定電流の場合、１〜20ｍＡ／cm²
より好ましくは２〜10ｍＡ／cm²の電流密度が望ま
しい。電圧又は電流密度が上記値より大きいと蛋
白質が変質するおそれがある。

以下実施例により、本発明をより詳細に説明す
る。

前記第液：第液：水：第液の比率１：
２：１：４の混合物を４％ゲル用溶液とする。こ
れにゲル用調製液に対し２％相当量の両性電解質
（トリエチレンテトラミンなどのアミンとアクリ
ル酸などのαβ不飽和酸との反応生成物、“アン
フオライン”（LKB社製、ストツクホルム、
スエーデン）を加える。一方、前記第液、第
液、第液を１：４：３の比率に混合し30％ゲル
用溶液とする。180×110mm厚み（内径）３mmの容
器に、上記30％ゲル用溶液を注入すると共に、上
記４％ゲル用溶液を等速で30％ゲル用溶液に注入
する。約１時間放置し、約４〜30％のポリマーゲ
ル濃度勾配を有する平板ゲルを得る。

この平板ゲルのポリマーゲル濃度勾配の稀薄側
の端部約10mmの所にヒト血清試料を被着させ、こ
の側を陰極とさてポリマーゲル濃度一定方向に
30V／cmの定電圧で18時間通電し、ついでこれと
直角方向に３ｍＡ／cm²の定電流で18時間通電し、
ヒトの血清蛋白を分離し、それに染色および脱染
処理（クーマシーブリリアントブルーＲ−250
（メルク社製）114mg、メタノール225ml、酢酸30
ml、蒸留水195mlの溶液に浸漬したのち７％酢酸
溶液でバツクグラウンドの染料を除去する）を施
こして泳動パターンを得る。

Claims

【特許請求の範囲】１一方向にポリマーゲル濃度勾配を有するよう
配置され、少なくともポリマーゲル濃度の稀薄部
に両性電解質を含み、分子篩効果を有する平板ゲ
ルのポリマーゲル濃度稀薄部に被検試料を被着さ
せ、上記ポリマーゲル濃度一定方向に一次元目の
電気泳動を行ない、ついで上記ポリマーゲル濃度
勾配方向に二次元目の電気泳動を行なうことを特
徴とする二次元電気泳動法。２上記ポリマーゲルがポリアクリルアミドゲル
である特許請求の範囲第１項記載の二次元電気泳
動法。