JPS6258164A - クロマトグラフイ−用担体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、主として高速液体クロマトグラフィー用の充
填剤として用ハ、溶液中のタンパク賞やアミノ酸などを
高精度で分離するクロマトグラフィー用担体に関する。

（従来の技術） 液体クロマトグラフィーにおいて、シリカゲルそのもの
を充填剤として用ハると、該クロマトグラフィーの適用
範囲が限定され、さらにカラムを安定に保ち、再現性の
ちるクロマトグラムを得るのが難しい。一方、高速液体
クロマトグラフィー用の充填剤として有機質ゲルを用い
ると、高圧・高流速時に機械的強度に欠け、かつ粒子径
や細孔容積などの物理的形状が変１ヒしやすく、削溝ｉ
ｉ　Ｏ担体としては無機質粒子よりも劣っている。この
ため、クロマトグラフィー用担体として／リカゲルなど
の無機質粒子を用い、この表面をＭ１幾ノラン化合物で
有業官能基を導入すると、有機溶媒から水浴液まで広い
範囲の溶媒を溶離液の成分として使え、揮発性の乏しい
生体成分の分離分析も容易である。

ただし／リカゲルなどの無機質粒子を化学的（で表面処
理しても、表面／ラノール基が１００係反応したわけで
なく、未反応ンラノール基がかなり残存しているので、
溶離液の使用ｐＨ範囲が限定され、特に生木試料を用・
ハる場合にはカラムの寿命が短い。さらに無機質粒子の
表面において、未反応ンラノール基が遊離していると、
ある種の溶質は強く吸着されてカラム外へ出てこす、分
離性能自体も十分でない。こうした問題を改善するため
に、たとえば特開昭５５−５９４１号では、多孔性無機
質粒子の表面にエポキシ基を末端（て有する有機シラン
化合物をｆヒ学結訃し、前記エボキ／基にさらにエポキ
／基含有有機吻を付加して、表１倉ｉを親水性高分子で
覆って吸着性を低下させている。

また特開昭５６−９３０４３号では、粒子表面；（エボ
キ／基を末端て有する有機ンラ／化合物を反応させ、該
ｆヒ合物を介して単５糖＠まだは多塩類を化学結合する
ことにより、無機前担体にタンパク質を吸着することを
防止している。特開昭５８−２２３０６２号では、化学
的に表向処理したシリカゲルを用いる際に、あらかじめ
タンパク質を飽和吸着させることにより、除タンパク質
α理することなく、低分子量の生理活性物質、薬剤を迅
速・に分離している。特開昭５９−１１２２６０号では
、／リカゲルなどの基体表面にアミン官能基を化学結合
し、さらにスフフンイミド単位を有するポリマーと反応
させて、ポリアスパラギン酸の被覆を形成している。

（発明が解決しようとする問題点） 多孔性無機質担体の狡面改買は、単なる有機ンリル化剤
による処理のほかに、残存シラノール基の影響を魯力避
けるためて前記のように種々存在し、さらにカーボワノ
クス、トリメチルアノモニウムなどによる処理も知られ
ている・しかし従来の担体では、特に水溶性タンパク質
を溶質とする、際に分離性能が未だ十分で７ｔく、溶質
の回収率から考慮して若干の吸着が認められ、かつこれ
らの担体を用いたクロマトグラフは比較的ブロードとな
り、分離てかなりの時間を要することになる。

まだ特開昭５８−２２３０６２号では、ンラン処理ノリ
力ゲルをさらにタンパク質で処理するといっても、この
タンパク質な検体の除タンパク質処理を省くために／す
力ゲルに吸着させるにすぎず、この充填剤で分離できる
のは低分子量の生理活性物質、薬剤などだけである。特
開昭５９−１１２２６０では、ノリ力ゲル表面にポリア
スパラギン酸の被覆を形成するけれども、それはポリス
クシンイミド−シリカを介して固定されるにすぎず、目
的物り生成に要する時間が長いうえに、完全にポリアス
パラギン酸被覆になったか否かを確認することか相当に
困・誰である。

（問題へを解決するだめの手段） 不発明番らは、従来の高速液体クロマトグラフィー用の
充填剤て関する問題を種々検討した結果、水系ゲル浸透
クロマトグラフィー分離体としてはまず表面が親水基で
被覆または化学結合されているうえに、遊離まだは残存
／ラノール基を十分にマスクすることを要するために、
表面改質に際して、親水性基を持ちかつ吸着傾向の少な
い−ＮＨＣＯ−（ペプチド鎖）を有するタンパク質を用
いることにより、天竜のクロマトグラフィー分離まだ（
は分取に適応する高圧・高流速処理が可能であることを
見出した。

本発明に係るクロマトグラフィー用ｍ体で：ま、可溶性
タンパク質まだはポリペプチド類を架橋結合し、この架
橋高分子化合物で多孔性無機質粒子の表面を被覆する。

この無機質粒子は、あら刀・しめその表面に有機／ラン
化合物を化学結合しておいてもよく、この１余７ｒＣは
架橋高分子化合物ｌま粒子表面の残存／ラノール基を被
覆する。

本発明で用いる多孔性無１幾質粒子は、たとえ：ばシリ
カ、アルミナ、ノリ力・アルミナ、チタニア。

ケイノウ土、ケイ酸ガラス、アルミノケイ酸塩。

クレーカオリ／、タルク、ゼオライトなどであり、ガラ
スピーズ表面にシリカゲル微拉子などをまぶしてもよく
、その形状は球状または破砕状であって、天然産または
人造物の°ハずれであってもよい。

この無機質粒子は、１〜５００μｍ２表面積１〜８ｏｏ
ｍ２／ｇ、平均細孔径３０〜４０００Ａの微粒であると
好ましい。代表的な無機質粒子はシリカまたはアルミナ
であって、化学的純度には特別の制限を設ける必要はな
い。また無機質粒子は、使用に先だってあらかじめ鉱酸
処理ケし、その後に１００〜２００℃で数時間乾燥する
と好ましい。

所望に応じて行うシラン処理で用いる有機シラ／化合物
は、たとえばｒ−グリシドキシプロピルトリメトキシシ
ラン、γ−グリシドキシプロピルトリエトキンシラン、
３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプ
ロピルトリエトキシシラン、３−グリシドキシプロビル
ジメチルクロルシラン、Ｎ−２（アミノエチル）−３−
アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−２（アミノエ
チル）−３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、
３−シアノプロピルトリクロルシラン、３−アセトキシ
グロビルジメチルクロルシラン、３−アセトキシプロピ
ルメチルジクロルシラン、イソシアネートプロピルジメ
チルクロルシラン、イソシアネートプロピルトリエトキ
シシラン、３−メルカプトプロピルトリエトキシシラン
などであり、エポキシ基、アミン基、シアン基、インシ
アナート基、メルカプト基などの親水性官能基またはト
リメチルクロルシランのように短い官能基を有するシラ
ン化合物が好ましい。また前記のシラン化合物以外でも
、カルボキシル基などの親水性官能基または低級炭素鎖
を有する官能基を持つシラン化合物については適用可能
である。無機質粒子と有機シラン化合物との結合反応は
、公知のように該シラン化合物の分解を避ける条件を選
択するのが好ましく、かつ無機質粒子の表面に存在する
シラノール基と可能な限り多く化学結合させると好まし
い。

本発明で用いるタンパク質は、可溶性であればそのまま
出発材料として使用することが可能であり、ゼラチン、
メタプロティン、グロテオース。

ペプトン、ペプチドなどの誘導タンパク質、カゼインな
どのリンタンパク質、ムコタンパク質などの糖タンパク
質、アルプミ／、グロブリン、グルテリン、ヒスト／、
プロタミンなどの単純タンパク質が例示できる。またケ
ラチンのような硬タンパク質は、可溶性でないけれども
、水との煮沸または酵素、酸、アルカリなどで変性して
可溶性にすればよく、出発材料としてはタンパク質その
ままを使用しても、酵素、酸、アルカリなどで適度に加
水分解したものを使用してもよい。またタンパク質の代
りに、天然または合成のポリペプチド類も使用可能であ
り、１種または２種以上のα−アミノ酸類を縮重合した
ホモポリマーまたはコポリマーであるポリアミノ酸もポ
リペプチド類として包含する。タンパク質またはポリペ
プチド類の分子量は、約５ｏｏｏ以上好ましくは約１０
０００以上であれば、カルボニル化合物による架橋結合
によって十分な被覆強度を得るものと推定でき、この分
子量が力きくなればなるほど、一般にカルボニル化合物
の添加量を少なくすると好ましい。代表的なタンパク質
は、分子量約５０００〜２０００００のゼラチンであり
、ゼラチンは分子量の制御が比較的容易でありかつ比較
的安画である点でも好ましい。

タンパク質またはポリペプチド類自体に架橋結合を生じ
させるカルボニル化合物は、グリオキサール、マロンア
ルデヒド（プロパンジアール）。

コハク酸ジアルデヒド（ブタンジアール）、グルタルア
ルデヒド（ペンタンジアール）、アセトアルデヒド（ヘ
キサンジアール）、ピメリンジアルデヒド、スペリンジ
アルデヒド、マレインジアルデヒド、２−ペンテン−１
，５−ジアルデヒド、　　。

アセチレンジアルデヒド、メンオキサールジアルデヒド
のようなジアルデヒド類、ホルマリン、アセトアルデヒ
ドのようなアルデヒド類またはパラホルムアルデヒドの
ようなアルデヒド系線状高分子などであり、それ自体で
も容易に重合しやすくかつタンパク質またはポリペプチ
ド類と架橋結合しゃすいジアルデヒド類を用いると好ま
しい。アルデヒドやクトンであるカルボニル化合物（ハ
、水。

アルコールなどの適当な溶媒中で、タンパク質ままはポ
リペプチド類の基質であるアミン基と反応して、下記の
ようにして縮合した結果、脱水が起るものと推定できる
。

したがってジアルデヒド類は、２個のアミン基と架橋反
応して次のように化学結合する１ｄずである。

−Ｎ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ＝Ｎ−塘たホルマリン
まだはアセトアルデヒドの結きはたとえば市販のゼラチ
ンに関して、その分子量５０００〜２０００００に対応
する２５茅グルタルアルデヒドの添加量は、ノリ力５ｇ
に対して０．０５〜２０　ｍｌであると、第２図から第
４図に示すようにほぼ近似した液体クロマトグラフを得
ることができる。２５飴グルタルアルデヒドの添’ＪＯ
量’を址、ゼラチンの分子量が犬きくなれば前記の範囲
内で少なくする。

（作用） 多孔性無機質粒子は、直接または適当な有機フラン処理
の後に、可＠注タンパク質まだはポリペプチド類で架橋
結合した高分子化合物で表面被覆する。有機フラン処理
をあらかじめ行った場合には、前記高分子化合物で残存
／ラノール基を表面被覆することになる。タンパク質筐
たはポリペプチド類は、カルボニル化合物によってアミ
ン基を介して架橋結合し、粒子表面（（おいて網目状に
架橋しているものと推定でき、反応条件によっては粒子
表面のンラノール基と局部的に化学結合するかもしれな
い。多孔性無機質粒子の表面は、水。

アルコールなどの溶媒中でタンパク質またはポリペプチ
ド類で被覆きれ、タンパク質またはポリペプチド類とさ
らにカルボニル化合物で網目状に架橋させるから、粒子
表面から溶出することが無く、約４０°Ｃ以下の温度で
はカラムの劣化はほとんど生じない。被覆処理した担体
は、タンノくり質またはポリペプチド類に基づく遊離カ
ルボキシル基を有する親水性基で被われており、これら
の基を他つ１ヒ合物と結合させてさらに改質することも
可能である。

被覆処理した担体（ｄ１粒子表面が親水性基で被われて
いるので、溶質と担体表１面との疎水ヰ相互作用がされ
、力で小さく、水系移動相では分子ふるい効果によって
、アミノ酸、タンパク質などを高精度で分離することが
できる。この担体は、粒子表面の遊離カルボキシル基を
利用して、極呻溶媒移動相においてイオン交換クロマト
グラフィーとしてアミノ酸シタ／バク質などを分離して
もよく、このカラムはいくつかの酵素によってほぼ定置
的に回復させることができる。

（実施例） 実施例１ 分子量約１０００００のゼラチ／２０ｇを蒸留水２００
　ｍｌに溶解し、水浴上で５０〜６０℃に定め、直径２
〜４０１ｔｍで細孔径３０ＯＡの多孔性／リカゲル（商
品名ＹＭＣ−Ｃ）ＥＬ　　Ｓ工り、山村化学研究新製）
５０ｇを添加する。この１容夜を均一に攪拌後、２５係
グルタルアルデヒド水浴夜１０ｍ１を１箇下し、攪拌し
ながら３時間反応さする。反応後直ちに、シリカゲル担
体を蒸留水１リツトル、メチルアルコール１リンドルで
濾過洗浄を行い、さらにテトラヒドロフラン１リツトル
、メチルアルコール２リツトル、蒸留水３リツトルで洗
浄し、減圧乾燥器で乾燥する。得た／リカゲル担体の重
量増加は、シリカゲルに対して８％である。

タンパク質の結合確認のため７こ、得たノリ力ゲル担体
１ｇにＮａＯＨ３ｇ、を添加し、蒸留水で全量をｌＱｍ
ｌとしてから１時間煮沸する。この水溶液をＨＣＩで中
和し、ニンヒドリン０．１ｇを蒸留水３０ｍ１に溶かし
た反応試薬を数滴加え、さら（（煮沸。

冷却すると、ニンヒドリン反応によって青紫色ヲ呈する
。この確認試験ｌこおいて、前処理としてＮａＯＨ分解
を行うのは、タンパク質とカルボニル会に由来するもの
であるため、遊離アミン基の存在しないことで直接ニン
ヒドリンを加えても呈色せず、まずＮａＯＨ分解によっ
て遊離アミン基を形成させることを要する・また前記の
洗浄の際に、洗液にニンヒドリン反応およびビウレット
反応を行っても呈色せず、このため（／ｉｌ：シリカゲ
ル担体をカラムクロマトグラフィーとして用ハる時に移
動相を流しても、該担体からタンパク質の脱離し々いこ
とが確認できる。

得たシリカゲル担体を、内径５ｍｍ、長さ３００ｍｍの
ステンレスカラムに乾式充填し、さらにメチルアルコー
ルで加圧して充填する。このカラムを用い、下記の条件
下で水溶媒系のゲル浸透クロマトグラフィー用充填剤と
しての性能を調べる。

（測定条件） 移動相　Ｑ、３ＭＮａＣ１＋Ｑ、１Ｍリン酸塩緩衝液（
ｐＨ７，０） 流速　　０．５ｍｌ／分 温度　　室温 噴出器　紫外線吸光光度計２２０　ｎｍ（Ｑ、５４ａｕ
ｆｓ）試料　　タンパク質混合物 １、　牛血清フィブリノーゲン （分子量３８００００） ２、　牛血清アルブミン （分子量６７０００） ３、　β−ラクトグロブリン （分子量４１０００） ４、　リボヌクレアーゼＡ （分子量１３０００） ５、トレース ５、　　Ｌ−バリン （分子量１７７．１５） 得だクロマトグラフは、第１図に示すようにピークが鋭
く、各成分の分離状態はきわめて良好である。

また同一の測定条件下において、次のタンパク質混合物
のクロマトグラフを第３図に示す。

試料　１．　牛血清フィブリノーゲン ２、　牛血清アルブミン ３、　β−ラクトグロブリン ４、　ミオグロビン（分子量１７５００）５、　チトク
ロームＣ（分子量１６０００）５、　　Ｌ−バリン この分離状態も図示のようにきわめて良好である。

実施例２ 分子量約１００００のゼラチンを用いる以外：は実施例
と同様に製造し、この際の２５係グルタルアルデヒド水
溶液の滴下量は１５ｍ１である。

実施例１と同様の処理および条件下で、水溶媒系のゲル
浸透クロマトグラフィー用充填剤としての性能を調べる
。第３図の場合と同じ試料知よって得たクロマトグラフ
は、第２図に示すようにピークが鋭く、各成分の分離状
態はきわめて良好である。

実施例３ 分子量約２０００００のゼラチンを用いる以外は実施例
１と同様に製造し、この際の２５チグルタルアルデヒド
水溶液の滴下量は５ｍｌである。

実施例１と同様の処理および条件下で、水溶媒系のゲル
浸透クロマトグラフィー用充填剤としての性能を調べる
。第３図の場合と同じ試料によって得たクロマトグラフ
は、第４図に示すようにピークが鋭く、各成分の分離状
態はきわめて良好である・ 実施例４ 水１００ｍ１中に入れ、さらにｒ−グリシドキシプロピ
ルトリメトキシシラン５ｇを添加し、ＨＣｌで　　ｐＨ
を４〜５に調整してから、８０℃に加熱して約２時間還
流する。加熱後濾過し、蒸留水１リツトルで洗浄してか
ら６０℃で減圧乾燥する。乾燥したシラン処理シリカゲ
ルに分子量約５ｏｏｏのゼラチン５ｇを加え、さらに２
５％グルタルアルデヒド水溶液２ｍｌを添加して、蒸留
水で全量を２００ｍ１とする。この溶液を均一に攪拌後
、さらに攪拌しながら５０〜６０°Ｃで３時間反応させ
る。反応完了後、シリカゲル担体を蒸留水１リツトル。

メチルアルコール１リツトルで洗浄し、３０℃で減圧乾
燥する。

得たシラン処理ンリ力ゲル担体を、内径６　ｍｍ。

長さ１５０ｍｍのステンレスカラムに充填する。このカ
ラムを実施例１と同様の測定条件下でクロマトグラフを
作成するが、試料のタンパク質混合物は下記の通りであ
る。

試料　１１人血清γ−グロブリン （分子量１６００００　） ２、牛血清アルブミン ３、　チトクロームＣ ４、Ｌ−バリン 得だクロマトグラフは、第５図に示すようにピークが鋭
く、各成分の分離状態はきわめて良好である。

実施例５ 実施例４と同様のシリカゲル５ｇを蒸留水１００ｍ１中
に入れ、さらに３−アミノプロピルトリエトキンシラン
２．５ｇを添加し、ＨＣＩでｐＨを６〜７に調・察して
から、８０℃に加熱して約２時間還流する。この後は実
施例４と同様に処理して、シラン処理シリカゲル担体を
得、これを実施例４と同様の条件下でクロマトグラフを
作成する。

得たクロマトグラフは、第６図に示すようにピークが鋭
く、各成分の分離状態（はきわめて良好である・ （発明の効果） 本発明に係るクロマトグラフィー用担体は、その粒子表
面が架橋ポリペプチド鎖のような親水性高分子で被覆さ
れているため、溶質と粒子表面との疎水性相互作用がき
わめて小さくて低吸着性であり、それ故に高速のゲル浸
透クロマトグラフィー用充填剤としてきわめてすぐれて
いる。この担体の基体はシリカやアルミナなどの無機質
粒子であるので、高圧・高流速時の機械的強度に富み、
しかも網目状の架橋ポリペプチド鎖で表面被覆すること
により、架橋高分子化合物が表面・から溶出したり、常
温の使用でカラムの劣化が生じることはほとんど無い。

したがって本発明の担体は、たとえばタンパク質、ポリ
ペグチド、酵素、ホルモン類などを水系溶媒で分子ふる
い効果で分離することはもとより、他の極性溶媒による
クロマトグラフィー測定などに使用できる。特に本発明
の担体は、水溶性タンパク質やアミノ酸の分離性能が−
ｉ＜−れているから、その分析や分取によって食品工業
、医薬品工業、医療分野に寄与することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図から第６図はそれぞれ本発明（で係る担体を用い
て作成したクロマトグラフの例を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、可溶性タンパク質またはポリペプチド類をカルボニ
   ル化合物によつて架橋結合し、この架橋高分子化合物で
   多孔性無機質粒子の表面を被覆していることを特徴とす
   るクロマトグラフィー用担体。 ２、多孔性無機質粒子が、直径１〜５００μｍ、表面積
   １〜８００ｍ＾２／ｇ、平均細孔径３０〜４０００Åの
   微粒である特許請求の範囲第１項に記載の担体。 ３、多孔性無機質粒子がシリカゲルである特許請求の範
   囲第２項に記載の担体。 ４、可溶性タンパク質が、分子量約５０００〜２０００
   ００のゼラチンである特許請求の範囲第１項に記載の担
   体。 ５、カルボニル化合物として、ジアルデヒド類を用いる
   特許請求の範囲第１項に記載の担体。 ６、多孔性無機質粒子の表面に有機シラン化合物を化学
   結合し、ついで可溶性タンパク質またはポリペプチド類
   をカルボニル化合物によつて架橋結合し、この架橋高分
   子化合物で粒子表面の残存シラノール基を被覆している
   ことを特徴とするクロマトグラフィー用担体。