JPS62502614A - モノクロ−ナル抗体及び分析 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 モノクローナル抗体及び分析 〔発明の背景〕 本発明は、モノクローナル抗体、これらモノクローナル抗体を使用する診断方法 、並びに活性化Ｂ−細胞の検出に関するものである。

Ｂ＋　１７７７球は、細菌及びウィルス感染の細胞外相に対する液素性又は循環 性の免疫反応に関与する。特定の抗原若しくはミトゲン刺戟への算出により活性 化されると、ヒ）　Ｂ　−リンパ球は増殖し、次いで抗体分泌性細胞まで分化す る。活性化の期間中、Ｂ−細胞は寸法が増大し、ＤＮＡとＲＮＡとの両者を合成 すると共に、細胞表面構造の変化を受ける。Ｂ−細胞に？ける新生物変化、たと えばＢ−細胞起源の白血症又はリンパ膝も、細胞表面抗原の発現に？ける変化を 誘発する。

トーシーローソン等（１９Ｂ２）、セル、第３０巻、第４１５〜４２５頁は、ミ トゲン又はエプスタイン−パール・ウィルス（ＥＢＶ）による刺戟の２〜３日後 にＢ−リンパ球の表面に出現するＢ−細胞制限抗原（Ｂ−ＬＡＳＴ−１）を記載 している。Ｂ−ＬＡＳＴ−１は分子＠　４５　ｋ　ｄを有する一重鎖ポリペプチ ドである。さらに、Ｂ−ＬＡＳＴ−１は慢性リンパ球白血症（ＣＬＬ）細胞及び 分化の遅れたリンパ腫細胞にも見られる。ネズミ起源の抗−Ｂ−ＬＡＳＴ−１モ ノクローナル抗体のアイソタイプは、ＩｇＧＺｂであると報告されている。

ヨコチ等（１９８２）、ジャーナル・イミュノロジー、第１２８巻、第８２３− ８２７頁は、ＥＢＶ及びミトゲン活性化されたヒト及びその他の非ヒト霊長動物 Ｂ−細胞の表面に出現するＢ−細胞抗原、すなわちＢＢ−１を報告している。Ｂ Ｂ−１抗原の分子量は３ス０００である。発現はＥＢＶ活性化の４〜５日後に検 出され、かつ７日後にピークと力る。さらに、ＢＢ−１は試験された骨髄腫の５ ０チにも見出された。

〔発明の要点〕

本発明は活性化ヒ）Ｂ−細胞に対する抗原決定子を識別するモノクローナル抗体 を提供し、抗原はＢ−ＬＡＳＴ−１〔トーシーローソン等（１９８２）、セル、 第３０巻、第４１５−４２５頁に記載されている〕及びＢＢ−１〔ヨコチ等（１ ９８２）、ジャーナル・イミュノロジー、第１２８巻、第８２３−８２７頁〕と は異なる蛋白であることを特徴とする。この抗体は、未刺戟のヒトＢ−Ｓ胞に対 し実質的に反応しない。

さらに本発明は、還元性条件下で約７５，０００ダルトンの見掛分子量を有しか つ非還元性条件下で６７．　ＯＯＯダルトンの見掛分子量を有する一本鎖ポリベ ブチドの抗原決定子と実質的に同一の抗原決定子を有するほぼ純粋な蛋白をも提 供し、−重鎖ポリベブチドは活性化ヒトＢ−細胞の表面に存在する蛋白である。

他の面において本発明は、抗ＩＭ、蛋白の製造方法を提供し、この方法はエプス タイン−バール・ウィルス、ヤマゴボウミトゲン、蛋白Ａ又は抗−免疫グロブリ ンにより活性化された宋梢若しくは膵臓−ヒ）Ｂ−細胞を培養し、またはパーキ ットのリンパ膝細胞ラインＲａｍｏ　ｓ若しくはプラスマ細胞白血症ラインＲＰ Δ（Ｉ　８２２６を培養し、かつこれら細胞から蛋白を分離することを特徴とす る。

さらに本発明は、本発明の抗原を発現する細胞の存在につき生物学的試料を分析 しかつ本発明の抗原を発現する細胞に対する抗体の存在につき生物学的試料を分 析するのに有用なキットをも提供する。これらのキットは１個若しくはそれ以上 の容器を備え、そのそれぞれは別々に検知可能に標識した又は標識されていない 抗体、或いは不発明の抗原を含有すると共に、他の分室には免疫複合体の形成を 検出する手段を備える。

〔好適実施例の説明〕

図面において、第１図は抗−Ｉｇ抗体で活性化されたＮ、。１ＩｉＢ−細胞に対 する抗−Ｂ１及び抗−Ｂ５モノクローナル抗体の反応性を示す一連の棒グラフで あり、第２図は抗−Ｉｇ抗体で活性化する前（Ａ）及び活性化した後（Ｂ）にお ける膵臓Ｂ−細胞に対する抗−Ｂ１及び抗−Ｂ５モノクローナル抗体の反応性を 示す一対の棒グラフであり、 第３図は抗−Ｉｇ抗体で活性化されていない（Ａ）及び抗−Ｉｇ抗体で活性化さ れている（Ｂ）牌豚Ｂ−細胞、並びに活性化されていない単核細胞（Ｃ）に対す る抗−Ｂ１及び抗−Ｂ５モノクローナル抗体の反応性を示す一連の棒グラフであ り、 第４図は抗−Ｂ５モノクローナル抗体により免疫沈澱された標誠紀胞表面蛋白の ５ＤＳ−ＰＡＧＥ特性化である。

活性化Ｂ−細胞の作成 正常なヒ）弾臓Ｂ−’Ｊンパ球を、１０チのＦｅ２と２ｍＭのグルタミンと１ｍ Ｍのピルビン酸ナトリウムとを補充したＲＰＭ１１６４０中にて組織培養フラス コ内でｔ５Ｘ１０’個の細胞／−にてそれぞれ４回異々る刺戟を与えながら１日 間、３日間及び６日間培養した。（１）ヤマゴボウミトゲン（ＰＷＭ）：　１： 　３００の最終濃度。

１日間、６日間及び６日間にわたり全ｗＪＦｓ単核細胞を使用した。（２）抗− Ｉｇ：親和性精製したウサギ抗−ヒトルブミン、抗−Ｂ１若しくは抗−Ｂ２抗体 （それらはいずれもＢ細胞刺戟を示さない）に結合されているアフイゲ／ｌ／　 ７０２ビーズを試験することにより特異性を検査した。１日目及び３日目の刺戟 につき抗−Ｉｇビーズを、高度に精製されたＢ細胞と共に培養し、これらＢ細胞 は膵臓単核細胞のＥロゼツテ陰性フラクションを抗−Ｍｏ１、抗−Ｍｏ２、抗− Ｔ４及び抗−丁８で溶解させかつ次いで補充することにより得られた。６日目の 刺戟は、未分画の膵臓単核細胞を使用した。（３）蛋白Ａ：蛋白Ａは１０ｇ／− の最終濃度で使用した。上記したように、高度精製したＢ細胞はｔ５Ｘ１０’＠ ／−の濃度にて１日間及び６日間培養した、６日目の刺戟は未分画の膵臓単核細 胞を利用した。（，４）Ｅ　Ｂ　Ｖ　：膵臓単核細胞のＥロゼッテ陰性フラクシ ョンをＥＢＶ（ＥＢＶ産生するキヌザル細胞ラインＢ９５５からの１：４希釈上 澄液）と共に１日間、３日間及び６日間培養した。全活性化試料の発現型分析な 先立ち、これら細胞を収車しかつ抗−Ｍ　ｏ　１　、抗−Ｍｏ２、抗−Ｔ４及び 抗−Ｔ８で溶解させ、次いで補足してそれぞれ単核細胞及びＴ細胞を清澄させ、 かつこれら試料からＢた３胞フラクシヨンを濃縮した。

６週令の雌Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃネズミに、リン酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）における 凍結保存したＢ細胞拡散組織性リンパ腫（ＤＨＬ）細胞の５Ｘ１０’＠を腹腔的 接種した。

これらのｈ鵜細胞は、モノクローナル細胞表面ＩｇＭ、Ｒ並びにＢ細胞関連抗原 Ｉａ、Ｂ１及びＢ４を発現する点においてＢ細胞起源である。これに対し、これ らの腫瘍細胞は、一般回な急性白血症抗原（ＣＡＬＬＡ）；　Ｔ細胞抗原Ｔ５、 Ｔ４、Ｔ８及びＴ１１；並びに！＃髄性／単核細胞抗ｆｆｌＭｏ　１、Ｍｏ　２ 及びＭＹ７に指向するモノクローナル抗体に対し非反応性であった。２８日後、 この動物にＳＸ１［１’個の腫瘍細胞を静脈内接種し、かつナドラー等により〔 ジャーナル・イミュノロジー（１９８０）、第１２５巻、纂５７０頁〕に記載さ れた改変を伴うコー２−及びミルスフィン〔ネイチャー（１９７７）、第２５６ 巻、第４９５頁〕の方法により体細胞のハイブリッド化を行なった。ネズミＦ＃ 細胞（ｔｓｘｌｏｓ）に、３０チボリエテレングリコール並びに２Ｘ１０１個の Ｐ３／Ｎ５−１／１−Ａｇ４−１骨髄膝細胞を有するデュルペツコのＭＥＭを融 合させた。融合後、これら細胞をアミノプテリン含有培地中で５％ＣＯ，の湿潤 算囲気下に３７℃で培養した。１０〜２８日後、約３００種の巨視的クローンを 同定し、そのうち１２５種が間接的免疫螢光分析で枳１ｊ定して免疫化ＤＨＬ細 胞に対し反・応性であった。要するに、α５〜ＩＸ１’０’個の洗浄した生存Ｄ ＨＬ細胞を、増殖を阻止するハイプリドーマ培養物からの上澄液１００μ！で処 理し、４℃にて３０分間培養しかつ３回洗浄した。次いで、細胞をヤギ抗−ネズ ミＩｇＧ及びヤギ恍−ネズミＩｇＭの１：５０希釈物１００μノで処理し、フル オレシンインチオシアネートと結合させ、４℃にて３０分間培養し、３回洗浄し 、ＥＰＩＣ８Ｖ細胞ソータで分析した。陽性細胞の割合を、ＥＡＳＹ免改プログ ラムを用いて測定した。次いで、産生クローンを分画末梢血液及び腫瘍細胞のパ ネルでスクリーニングした。抗−Ｂ５と命名した１種のハイブリッドクローンは 、免疫化ＤＨＬ細胞、数種の他のＢ細胞ＤＨＬ細胞ラインと反応することが判明 したが、これらは分画末梢血液単核細胞に対しては反応性でなかった。次いで、 ／・イブリッドクローン抗−Ｂ５を制限希釈により３回サブクローン化させ、か つＢＡＬＢ／Ｃネズミに移して悪性腹水を生成させた。上澄液及び腹水抗−Ｂ５ は、間接的免疫螢光分析により同様な反応性パターンを有することが示された。

Ｂ５腹水は、１　／　５０．ＯＯＯのバックグランドまで減少する１／２０．０ ００の希釈まで免疫化ＤＨＬ細胞に対し反応性を示した。Ｂ５抗体は、ネズミＩ ｇＭアイソタイプであることが決定された。その後の全実験において、Ｂ５腹水 を使用した。

ハイブリドーマＢ５と命名した抗−Ｂ５−産生ノ・イブリドーマ細胞ラインをア メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル在、ＭＤにＷ託ｔ、 、ＡＴＣＣ受託番号第ＨＢ　８７１６が付与された。

第１表に示したように、培養前にはこれら細胞はＢ５を発現しなかった。培地の みの存在下では３日間の培養後に約１０〜１５％の細胞がＢ５を発現したが、こ れら細胞の生存性は僅か１０〜２０％であった。第１図に示したように蛋白Ａ、 抗−Ｉｇ抗体又はＥＢＶで刺戟すると（生存性は約７０〜８０％）、約１０〜１ ５％の細胞が１日後にＢ５を弱く発現したのに対し、３日間の培養により６５チ の細胞がより強度に抗原を発現した。６日目のＢ５の発現レベルは１日目と同様 であり、かつ１００日目抗−Ｉｇ抗体の存在下）ではＢ５抗原の発現が再びバッ クグランドレベルとなった。ｐＷＭは、細胞がＢ５並びに抗−Ｉｇ抗体、ＥＢＶ 若しくは蛋白Ａを発現するよう誘発させないと思われ、細胞の個数はバックグラ ンドの僅か２倍であった。

第　■　表 インビトロでｔｉ！戟した膵臓Ｂ−細胞におけるＢ５及びＢ１抗原の発現＊ 日数　試験抗原　インビロトで刺戟した際の陽性細胞チ培地　蛋白Ａ　抗−Ｉｇ Ｇ　ＥＢＶ　ＰＷＭＱ　Ｂ１　８０　８０　’８０　８０　８０Ｂ５　〈５　〈 ５　〈５　〈５　〈５ １　Ｂ１　７４　６８　８０　８４　５６Ｂ５　６　３８　１４　１２　１８ ３　Ｂ１　４４７８　９０　８０６９ Ｂ５　１０　４５　６８　６４　２５ ６　Ｂ１　４６４８　５７　７１　３１Ｂ５　２　５　１６２４　４ ＊　３種の実験の１つはＢ５発現誘発の同一のパターンを示した。

Ｂ５が活性化Ｂ細胞で発現されるのをさらに証明するため、Ｂ細胞につき濃縮し た牌臓羊核細胞をビーズに結合された抗−Ｉｇで３日間刺戟した。生存細胞を収 穫し、かつ直接にフルオレシン化した抗−Ｂ１及び直接にビオチニル化した抗− Ｂ５で標識し、テキサス−レッド−アビジンで発色させ、次いで二重レーザー７ ０−血球計算分析によって測定した。第２図に示したように、パネルＡの未ｔｌ ｌ戟細胞はＢ１抗原のみを発現したか、Ｂ５を発現しなかった。抗−Ｉｇと共に ３日間培養した後、全細胞はＢ５を発現すると共にＢ１抗原をも発現した。

Ｂ５はＢ−細胞起源の細胞ライン及び腫瘍細胞で発現される。第２表に示すよう に、抗−Ｂ５はＥＢＶ形質形質転換リンパ芽球脳細胞ラインーキットリンパ腫ラ イン、５種のＤＨＬラインのうち４種、及びプラスマ細胞白血病＋８胞ラインＲ ＰＭＩ　８２２＋５の全てを包含するＢ系列の細胞ラインに対し反応性であった 。早期の新生物Ｂ＃３胞起源であることが知られた非ＴＩ＃Ｕ胞ＡＬＬラインＬ ａｚ　２２０及びＣＭ　ＬプラストフライシスラインＮａ１ｍ　ｌの両者は抗− Ｂ５に対し非反応性であった。Ｔ細胞ライン又はＩａ＋Ｔ細胞クローンについて は反応性が見られなかった。これらの結果、並びにＢ５骨髄性細胞ラインＨＬ− ６０、ＫＧ−１、Ｕ９３７及び５Ｕ−ＤＨＬ　１及びエリスロイド細胞ラインに ５６２０発現欠如は、抗−Ｂ５がＢ細胞誘導体の細胞に対し制限された反応性を 有することを示している。

第　２　表 Ｂ５　ＢＩ　Ｂ２　Ｂ４　ｋ／Ｉ　ＩａＥＢＶ！Ｊン％芽球　１５６　＋　−Ｈ ÷＋　＋＋　＋＋ＳＢ　−）−）−−１＋＋−＋←＋÷ パーキット　’　Ｒａｊｉ　−）−）−−１＋１−−１−ｔ−−）−＋−＋＋Ｒ ａｍｏｓ　−）−Ｈ−−Ｈ＋　０＋÷０Ｄａｕｄｉ　＋−１＋−）＋＋Ｏ＋＋÷ 非Ｔｌｌ胞ＡＬＬ　Ｌａｚ２２１　０　０　０　什　＋り）＋ＣＭＬブラストク ライシス、Ｎａ１ｍ−１０＋　Ｑ　−１＋　＋（ｕ）＋＋＋ＤＨＬ　５Ｕ−ＤＨ Ｌｌ　０　０　０　０　０　０ＳＵ−ＤＨＬ２　＋　−）＋＋０　０　０　０Ｓ Ｕ−ＤＩ−Ｂ４　−Ｈ−−）＋ｔ−ｏ　−Ｈ−＋＋５Ｕ−ＤＨＬ６　−１−十　 斗＋＋−ｏ　＋＋　−ｔ−＋＋−＋＋＋−８Ｕ−ＤＨＬＢ　＋　ｏ　ｏ　−）） −十　÷骨髄腫　Ｐ、ＰＭＩ８２２６−１−＋−＋−０−１−１−００−１−１ −１−１ｖＩｅＣａｒ　Ｏ−ｉ−＋−０−））−０−）−）−ｔ−Ｔ−ＡＬＬＨ ３Ｂ　ｏ　ｏ　ｏ　ｏ　ｏ　。

ＣＥＭ　０　０　０　０　０　０ Ｉａ＋Ｔｍ胞　ＥＬ１５６　ＣＩ　Ｏ（１００＋骨髄腫　ルー６０　０　０　０ 　０　０　０ＫＧ−１０００００−１−＋− Ｕｉ７００００００ エリス“イド　Ｋ５６２　０　０　０　０　０　０ａ、陽性程度はフロー血球測 定によって定量評価した。

０：バックグランドと比較して検出しうる反応性なし；＋：弱乃至中庸（１８目 のＢ５、第２図）；＋＋：強力（３８目のＢ５、第２図）；＋＋＋：最も強力な 反応性（３８目のＢｌ、第２図）。

各種のＢ−＋ｆＢ胞悪性に対する抗−Ｂ５の反応性を次いで検査した（第３表） 。このシリーズのネオブラスムは、正常なり細胞分化の段階を示す。試験した非 Ｔ細胞急性リンパ芽球白血病（ＡＬＬ）は全て、Ｉａ及びＢ４の発現によりＢ− Ｎ胞起源であった。これら早期の新生物Ｂ細胞は、いずれもＢ５を発現しなかっ た。Ｂ細胞慢性リッツ球白血病（ＣＬＬ）及び検査したＤＨＬの約半数はＢ５を 発現し、それより小割合の貧弱に分化したリンパ球リンパ腫（ＰＤＬ）は抗原を 発現した。検査したワルデンストロームの高分子グロブリン血症細胞及び骨髄腫 におけるＢ５の発現欠如と共に、Ｂ５抗原の発現は正常Ｂ　１Ｍ１１！胞分化の 〒間段階に相当する細胞に限ぎられた。す／パ芽球リンパ腫及びＤＨＬを含めＴ 細胞由来のＡＬＬ。

ＣＬＬ及びＴＩ！１］ｌｌ胞非ホジキンス氏リンパ腫を有する患者からの細胞は 抗−Ｂ５に対し非反応性であった。さらに、Ｂ５抗原は急性骨髄芽細胞白血病（ ＡＭＬ）を有する患者からの細胞で発現し乏かった。これらの観察はＢ５のＢ細 胞＃ｆ異性を確認すると共に、Ｂ５が正常Ｂ細胞分化の中間段階におけるＢリン パ球の集団で発現されることを示している。

第　３　表 Ｂ細胞　Ｂ５　Ｂ４　ＢＩ　Ｉａ　Ｔ５非−ＴＡＬＬ　２１　０　２１　８　２ １　０Ｂ−ＣＬＬ　２４　１２２４２４２４　０ＤＨＬ　１８　８　１８　１８ １８　０ＰＤＬ−Ｎ　７　５　７　７　７　０ ＰＤＬ−Ｄ　８　０　８　８　８　０ ワルデンストローム　２　０２２２０ 骨髄厭　２　ｏｏｏｏ。

Ｔ細胞 ＡＬＬ　８　０　０　０　ＮＤ　８ 骨髄性 ＡＭＬ／Ａ？ｖｉＭＯＬ　１２　０　０　０　１２　０＊　ワンデンストローム の高分子グロブリン血症。

＊　リンパ芽球リンパ腫及びＴ細胞ＤＨＬを含む。

失活した分画末梢血球並びに正常なリンパ性及び骨髄性組織に対する抗−Ｂ５の 反応性を検介した。フィコール−ハイパツク密度法度沈降によって分離した末梢 血液単核細胞（Ｐ　ＢＭＣ）の１％未満が抗原を発現した（第４表）のに対し、 これらはＢ−細胞、Ｔ−細胞及び単核細胞抗原に指向するモノクローナル抗体に 対し顕著な反応性を示した。

第　４　表 増殖リンパ性及び骨髄性細胞に対する抗−Ｂ５の反応性Ｂ５　ＢＩ　Ｔ３　Ｍｏ ｌ　Ｉａ 末梢血液 ＰＢＭＣ４１±１　５±２　５０±５６１±８　１８±４Ｅ＋ｆｉ　６　１±１ 　１±１　９０±５　８±５　２±１Ｅ　−非付眉ｕ（Ｂ）　３１±１２２±４ 　２±１２４±３　４２±５単核細胞　３　１±１　２±１　９±３５４±６　 ７１±５顆粒細胞　５　０±１　１±１　ｏ±１８８±１０　１±１ＲＢＣＳ　 ｏ±１　０±１　０±１　０＋：ｏ　ｏ±０血小板　５　０±１　０±１　０± １　０±１　ｏ±１Ｅ−ロゼツト化により分離したＴ＃！胞は、検出可能なり５ 発現を同様に欠如した。Ｂ−細胞、単核細胞及びゼロ細胞を含有するＥ−ロゼッ テ陰性フラクションを、さらに付着性によりＢ細胞につき濃縮した。Ｂ細胞濃縮 したＰＢＭＣを、直接的にフルオレシン化した抗−Ｂ１及び直接的にビオチン結 合した抗−Ｂ５で染色し、アビジン−テキサス−レットで発色させた。二重レー ザーフロー血球計算分析を用いて、抗−Ｉｇ抗体による刺戟の前（パネルＡ）及 び３日後（パネルＢ）に、第５図に示したように細胞を検査した。パネルＡに見 られるように、極めて少数の二重標識細胞力；観察されたのに対し、パネルＢに おりては明らかにＢ　１　＋Ｂ　Ｓ＋細胞が検出されたことを示した。さらに単 核細胞を、直接にフルオレシン化した抗−Ｍｏ１及び直接的にビオチン結合した 抗−Ｂ５で染色し、アビジン−テキサス−レッド（バネ＃Ｃ）で染色しかつ同様 に分析した。付着性単核細胞が、分析した細胞の１０〜２０％につきＢ５を弱く 発現することが認められた。しかしながら、単核細胞を表現系分類の前に１０％ ヒト血清中で１時間培養したが、いずれの細胞もＢ５とＭｏ１とを発現しなかっ た。同様に、顆粒剤　胞、ＲＢＣ及び血小板調製物は抗−Ｂ５に対する反応性を 欠如した。リンパ性組織におけるＢ５を有するフィコール−ハイバック単核８胞 の割合を第５表に示す。

第５嵌 リンパ組織に対する抗−Ｂ５の反応性 反応する細胞　チ リンパ結節　４　６±２　２８±８ Ｆ４臓（全体）　７　２±１　４５±５牌臓（Ｅ−）　３　ｓ±３　７２±１２ 扁桃　５　４±２　５４±９ 胸腺　３　０±１　０±１ 骨髄　３　１±１　６±３ 正常リンす結節、扁桃及び膵臓から分離した単核細胞は抗−Ｂ５に対し剥皮応性 であり、分析した細胞の６％未満が陽性であった。細胞の７０〜８０チがＢ１抗 原を発現する正常膵臓のＥ−集団も同様にＢ５を弱く発現した。胸腺及び骨髄か らの単核細胞は抗−Ｂ５に対し非反応性であった。

活性化した分画末梢血球に対する抗−Ｂ５モノクローナル抗体の反応性も決定し た。Ｅ−ロゼツト化し、付着させ、次いで残存細胞を抗−Ｔ細胞（Ｔ４及びＴ８ ）及び抗−単核細胞（Ｍ　ｏ　１及びＭ　ｏ　２　）抗体で溶解させかつ補足す ることによりＢ細胞を作成した。このＢ細胞濃縮したフラクション（５０％Ｂ１ ＋）を、ビーズに結合した抗−Ｉｇ抗体の存在下で培養した。３日後、これら細 胞（６０チＢ１＋）を収穫し、その生存性は６０〜８０チの範囲であった。これ らの細胞は、’Ｈ”ＴｄＲの吸収により測定して増殖性であったので（刺戟指数 ＝５〜１０）、活性化されたと考えられ、次いで細胞の形態学上約２／３がリン パ芽球の出現で拡大された。次いで、Ｂ５発現につき間接的免疫螢光性及びフロ ー血球分析により細胞を検査した。増殖している末梢血液Ｂ細胞とは異なり、細 胞の約２５チ力ＺＢ５を発現した。Ｂ５の発現が活性化Ｂ細胞に限られることを 示すため、細胞をフルオレシンに直接結合された抗Ｂ１及びビオチンに結合され た抗−Ｂ５で標識し、次いでテキサス−レッド−アビジンで発色させた。二重レ ーザーフロー血球分析を用いて、未刺戟細胞の大部分がＢ１のみを発現し、僅か な細胞がＢ１とＢ５とを発現したことが明らかに示された（第３図）。しかしな がら、抗−Ｉｇ抗体と共に３日間培養した後、ＩｖＩ胞の２５チがＢ５を発現し かつ全細胞がＢ５を発現すると共にＢ１をも発現した。これに対し、Ｅ−ロゼツ ト化により分離したＴ細胞をＰＨＡと共に６日間培養した。生存細胞を分離し、 かつ２日間及び６日間の刺戟後に細胞表面の表現屋を検査した。これらの細胞は その強力な’ｌ’１１の発現により均一なＴ細胞であり、Ｉａ（細胞の３０チが ６日目にＩａを発現した）及びＩＬ−２リセブタ（細胞の９０チが２日目にＩ　 Ｌ−２Ｒを発現し、７０チが６日目に発現した）の発現により決定されるように 活性化していた。これらの活性化Ｔ細胞は、検出しうるＢ５抗原を示さなかった 。同様に、単核細胞をＰＴ（Ａ−白血球状態調節した培地（ＰＨＡ−ＬＣＭ）で １晩活性化させ、これらの細胞はＭ　ｏ　１　、Ｍ　０２及びＩａを強力に発現 したが、Ｂ５を発現しなかった。

Ｂ５の生化学的特性化 パーキットのリンパ厄細胞ラインＲａｍｏｓ及びプラスマ細胞白血病細胞ライン ＲＰＭＩ　８２２６を、Ｂ５細胞表面抗原の分離用に使用した。ボイド等、ジャ ーナル・イミュノロジー（１９８１）、第１２６巻、第２４６１頁に記載されて いるラクトペルオキシダーゼ結合沃素化技術の変法を用いて、Ｉ　ｌｔｓにより 細胞１表面蛋白を標識した。この手順で得られた沃素化細胞を冷ＰＢＳで２回洗 浄し、かつ氷上で細胞溶解物５１液（５０ｍＭ）リスＨＣＩ、　（Ｌ４Ｍ　Ｎａ Ｃ１，１％　ト　リ　ト　７Ｘ−１００、２アセタミド、ｐＨ８）にて溶解させ た。３０分後、溶解伸を８００ｇにて１０分間遠心分離して未溶解の細胞、核及 びその他の不溶性物質を除去した。上澄液を免疫沈澱により分析するまで一８０ ℃で凍結させた。

細胞上澄液と細胞溶解物とをＩＱ、０００，９にて３０分間遠心分離し、かつ新 たな試験管に移した。免疫沈澱に先立ち、細胞溶解物を２０■のウサギ抗−ヒト エｇ抗体と混合し、４回予備消澄させた。さらに、パンソルビンで４℃にて１時 間にわたり２回、かつセファロース４Ｂビーズで１回、最後にウサギ抗−ネズミ 抗体と不適切々ネズミ免役グロブリンとの予備生成複合体で処理した。

予備清ざ化させた試料を次のいずれかと混合した：（１）抗−ＢＳＳウサギ−ネ ズミＩｇ複合体：（２）ウサギ抗ネズミＩｇとの不適切なモノクローナルＩｇＭ 複合体；　（３）　Ｂ　５−結合セファロース４Ｂ；又は（４）不適切なＩｇＭ −結合セファ−ロース４Ｂ０これらの混合物を氷上で０℃にて２時間保った後、 試料をＩＱ、０００，９にて５分間遠心分離し、かつ上澄液を捨てた。ベレット をＲＩＰＡ緩贅液（α２ｒｎＭ　リン醗ナトリウム、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、５ｍ　 Ｍ　Ｅ　Ｇ　Ｔ　Ａ　、１　ｍ　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｆ　、　ｐ　Ｈ７，４）における １％トリトンＸ−１００／α２チデオキシコリン酸ナトリウムで４回洗浄した。

第４図に示すように、これら沈澱物を非還元性条件（レーン１〜５）及び還元性 条件（５０ｍＭ　ジチオスレイト−／Ｉ／）（レーン６〜１０）の下で１ｏ％５ Ｄｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した：　Ｒａｍｏｓ　細胞ラ イン：セファ−ｐ−ス４Ｂに結合した抗−ＢＳ（レーン１及び５）を、セファ− ロース４Ｂに結合した不適切な抗体（レーン２及び６）と比較した。ＲＰＭＩ　 ８２２６細胞ライン：抗−Ｂ５ウサギ抗−ネズミＩｇ予備生成複合体（レーン４ 及び８）を不適切な抗体クサギー抗−ネズミＩｇ−ｙ−備生成複合体（レーン３ 及び７）と比較した。還元性条件下における７５キロダルトン（Ｋｄ）及び非還 元性条件下における６７ＫｄのＢ５の見掛分子ｆｆｉ（ｍ−ｗ−）は、連鎖間の ジスルフィド結合の存在を反映する。（Ｂ５抗原のこの生化学的特性化は、これ が−重鎖細胞表面蛋白であること本発明のモノクローナル抗体は検出可能なラベ ルで標識することができ、たとえば常法によって放射能標識することができ、か つ生物学的試料にて或ｌ／−１はインビボにて活性化Ｂａ胞の定銃測定を可能に する。

Ｂ−細胞分化の中間段階に対応するＢ−細胞起源の新生物に対する特異性のため 、本発明のモノクローナル抗体は生物学的試料におけるこれら細胞型の存在を検 出するのに使用することができる。本発明のモノクローナル抗体は、Ｂ　４１胞 から生ずる各種のリンパ庇及び白血病の細Ｆ＠型を特性化する際の診断助剤とし て使用することができる。さらに、本発明の放射能標識したモノクローナル抗体 を用いるインビボの映像化は、これら細胞型（たとえばリンパ腫瘍）を検出しか つ位置決定するための非侵襲性手段を与えることができる。

本発明のモノクローナル抗体は、さらに活性化Ｂ細胞を特徴とする自家免狡病、 感染及びその他の病気、たとえば器官拒否における活性化Ｂ細胞の役割を規定す るにも有用である。

その他の実施態様については次の請求の範囲に示す。

ＣＥＬＬ　ＮＵＭＢＥＲ 寸 手続補正書（方式） ％式％ 補正をする者 事件との関係　特許出願人 任　所　東京都中央区日本橋３丁目１３番１１号油脂工業会館電話２７３−６４ ３６番 補正の対象 明細書及び請求の範囲の翻訳文　各１通補正の内容　別紙の通り 明ＲＵ薔及び請求の範囲の翻訳文の浄書（内容に変更なし）１°゛−°”°°“ ＩＡｏｏ”４”ｌｌａ°８°ＰＣＴ／ＵＳ８６１００４６０ＡＴＴＡＣ）ＩＥＮ Ｔ Ｕ、Ｓ、ＣＬ、　４３６１５１３．５１８．　５１９．５４８．１１１３

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. １．活性化ヒトＢ−細胞に対する抗原決定子を識別し、前記抗原決定子はＢ−Ｌ ＡＳＴ−１及びＢＢ−１とは異左る蛋白であり、抗体は未刺載ヒトＢ−細胞に対 し実質的に非反応性であることを特徴とするモノクローナル抗体。
2. ２．抗体が、刺戟若しくは増殖Ｔ−細胞及び単核細胞又は非Ｂ−細胞起源の新生 物又はＢ−細胞分化の中間段階とは異なる分化段階に相当するＢ−細胞起源の新 生物に対し実質的に非反応性である請求の範囲第１項記載の抗体。
3. ３．抗体がＩｇＭアイソタイプである請求の範囲第１項記載の抗体。
4. ４．抗原決定子か活柱化Ｂ−細胞の表面に存在し、還元性条件下で約７５，００ ０ダルトンかつ非還元性条件下で６７，０００ダルトンの見掛分子量を有する蛋 白である請求の範囲第３項記載の抗体。
5. ５．抗原決定子がエブスタインーバール・ウイルス、ヤマゴボウミトゲン、蛋白 Ａ若しくは抗−免疫グロブリンで活性化された末梢若しくは脾臓ヒトＢ−細胞か ら又はバーキツトのリンパ腫細胞ラインＲａｍ０８若しくはブラスマ細胞白血病 ラインＲＰＭＩ８２２６から得られる請求の範囲第１項記載の抗体。
6. ６．抗体が検出可能なラペルで標識されている請求の範囲第１項記載の抗体。
7. ７．標識が放射能標識である請求の範囲第６項記載の抗体。
8. ８．請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体を生成しうるハイブリドーマ細 胞。
9. ９．還元性条件下で７５，０００ダルトンかつ非還元性条件下で６７，０００ダ ルトンの見掛分子量を有する一本鎖ボリペブチドの決定子と実質的に同一の抗原 決定子を有し、前記一本鎖ボリペブチドが活性化ヒトＢ−細胞の表面に存在する 蛋白である実質的に純粋な蛋白。
10. １０．請求の範囲第９項記載の活性化ヒトＢ−細胞表面蛋白である請求の範囲第 ９項記載の蛋白。
11. １１．エブスタインーバール・ウイルス、ヤマゴボウミトゲン、蛋白Ａ若しくは 抗−免疫グロブリンで活性化された末梢若しくは脾臓ヒトＢ−細胞から、又はバ ーキツトのリンパ腫細胞ラインＲａｍｏｓ若しくはブラスマ細胞白血病ラインＲ ＰＭＩ８２２６から得られる請求の範囲第９項記載の蛋白。
12. １２．検出可能に標識された請求の範囲第９項、第１０項又は第１１項記載の蛋 白。
13. １３．不溶往相に結合された請求の範囲第９項、第１０項又は第１１項記載の蛋 白。
14. １４．エブスタインーバール・ウイルス、ヤマゴボウミトゲン、蛋白Ａ若しくは 抗−免疫グロブリンで活性化された末梢若しくは脾臓ヒトＢ−細胞を培養し、又 はバーキツトのリンパ腫細胞ラインＲａｍｏｓ若しくはブラスマ細胞白血病ライ ンＲＰＭＩ８２２６を培養し、かつこれら細胞から蛋白を分離することを特徴と する請求の範囲第１１項記載の蛋白の製造方法。
15. １５．請求の範囲第９項記載の蛋白を発現する細胞の存在につき生物学的試料を 分析するに際し、前記試料を請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体と共に 培養し、かつ免疫複合体が生成されるかどうかを決定することを特徴とする生物 学的試料の分析方法。
16. １６．試料がヒト末梢血液、骨髄又はリンパ組織からなる請求の範囲第１５項記 載の方法。
17. １７．試料がヒトＢ−細胞又はＢ−細胞起源の新生物からなる請求の範囲第１５ 項記載の方法。
18. １８．抗体が請求の範囲第１１項記載の蛋白を識別する請求の範囲第１５項記載 の方法。
19. １９．請求の範囲第９項記載の蛋白を発現する細胞に対する抗体の存在につき生 物学的試料を分析するに際し、前記試料を請求の範囲第９項記載の蛋白と共に培 養し、かつ免疫複合体が生成されるかどうかを決定することを特徴とする生物学 的試料の分析方法。
20. ２０．試料がヒト血液からなる請求の範囲第１５項記載の方法。
21. ２１．請求の範囲第９項記載の蛋白を発現する細胞に対する抗体の存在につき試 料を分析するのに有用なキツトにおいて、近接した範囲内に１個若しくはそれ以 上の容器を収容すべく分室化し、前記容器は請求の範囲第９項記載の蛋白を含む 第１容器と、前記抗体と前記蛋白との間の免疫複合体の生成を検出する手段を含 む第２容器とからなることを特徴とするキツト。
22. ２２．請求の範囲第９項記載の蛋白を発現する細胞の存在につき試料を分析する のに有用なキツトにおいて、近接した範囲内に１個若しくはそれ以上の容器を収 容すべく分室化し、請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体を含む第１容器 と、前記抗体と前記蛋白との間の免疫複合体の生成を検出する手段を含む第２容 器とからなることを特徴とするキツト。
23. ２３．哺乳動物における活性化Ｂ−細胞含有の部位を検出するに際し、前記哺乳 動物へ請求の範囲第１項記載の標識モノクローナル抗体を加え、かつ放射能標識 された免疫複合体を検出することを特徴とする検出方法。