JPS62501171A - 生化学的アッセイのための方法と装置 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 生化学的アッセイのための方法と装置 本発明は生化学的アッセイの方法とＷＷに関するものであり特に、少くとも一つ の試薬が酵素に連結した免疫アッセイ及び核とプローブのアッセイに関するもの である。

免疫アッセイは例えば抗原や抗体のような、他物質ある。免疫アッセイの技（ネ ｉは家畜の発情を調べるとか、ガンの診断をするとかのようないろんな目的のた めに広範囲の物質、たとえばホルモンの検出のために、医学において大いに使用 されている。核酸プローブアッセイにおいて、細菌のプランや動物の細胞から抽 出されるＤＮＡ又はＲＮＡにおける特定の核酸の配列は、公知配列のヌクレオチ ド塩基を含むコンプリメンタリ−なプローブを用いて検出されうる。

初期の生化学的アッセイは、放射性同位元素の反応の成分の一つ又はラベルとし ての螢光基を用い、そのために特定の反応生成物の存在が定量的及び定性的に得 られることに主として基いていた。

これらの技術の両者はそれによる欠点をもっている。

両者は敏感かつ高価な装置を必要とする。加うる番ご、抗原や抗体にどんな放射 性同位元素がとり込まれているかといった実用上の困難があり、かつ生成物の貯 蔵期間は短い。螢光基の使用は、標準化の困難なアッセイを招来する。何故なら ば生体物質の背景螢光のために定量結果は容易に得られないからである。

免疫アッセイにおける標識としての酵素の使用は近年の発展によるもので、人手 が容易な光化学装置を用いて読みとり得るところのアッセイ終末点、安全な試薬 及び長い貯蔵期間といった利点をもっている。ふつう酵素免疫アッセイは、近年 放射免疫アッセイにおける感度改良が行われる迄は上記の利点をもっていなかっ た。

ＤＮＡプローブアッセイにおいては、ＤＮＡプローブはふつう例えば放射性リン のような放射性原子で、アルカリフォスファターゼのような酵素と直接に、又は プローブ中に入れられたビオチンと間接に標識化され次いで酵素複合体たとえば アヴイジンーアルカリフオスファクーゼ複合体を添加する。ラベルされたプロー ブの核酸中のターゲット配列でのハイブリッド化は、免疫アッセイにおけると同 じように酵素を表面へ固定するのに用いられる。この酵素はその着色生成物）＆ 生により、又は国際特許出願ｐ　ＣＴ　／　ｃ　Ｂ８４１０４３２に開示のよう に電気化学的に検出可能なグルコースオギシダーゼのような電気的活性酵素を用 いて検出することができる。

例えば欧州特許３７０３６．１９６０６．５８６３５及び６０１２３のように、 いわゆる「生化学的アンブリファイア−」を用いる酵素アッセイの感度改善につ いて近年いろんな技術が提案されてる。

現存の生化学的増幅系において、酸素をベースとする免疫アッセイは、通常の直 接アッセイ法よりも大部大きい実質的変化を生じ得るサイクリックな反応系列の ためのトリガー物質を産生ずる。しかし令名のところそのような増幅系は光学的 に測定される色の変化を生ずる生化学的増幅剤のみに限定されている。

実際にはこれらの酵素免疫アッセイは多数（通常は９６）のテストウェル及び光 学的に澄明な底板をもつテスト板を用いて通常行われる。免疫アッセイが完結す ると、テスト板は測定器具に挿入され光学ビームが各々のテストウェルを順序通 過し、それによって種々のテストウェルの光学密度の変化の読みとりを行うよう にする。各々の免疫アッセイはふつう重複して（すなわち少くとも２つのテスト ウェルで）行われ、加うるに得られた結果を補正するためにいろんなブランク値 や標準値を必要とする。各々のウェルでの光学的測定は一定の時間を必要とし、 また板は各測定の間に物理的に移さねばならぬので、単に一つの測定のだめの種 々のテストウオールの走査もかなり長時間を要し、そして光学装置のダイナミッ クレンジには限度があるので、同一のテスト進行中に、テスト物質濃度が大きく 変ったときテスト溶液の正確な結果を得ることは困難１８１（口ＨＧ２−５０１ １．７１　（３）となる。

欧州特許明ａｌｌｔ！Ｊ第１５０９９９号には、たとえばグルコースオキシダー ゼのようなレドックス反応に触媒作用をする酵素ラヘルが免疫アッセイにおける 固定支持体に結合され、そしてそれが触媒作用をするレドックス反応の生成物が 電気化学的にフェロセン仲介体を介して間接的に定量されるような免疫アッセイ 方法を開示している。該特許は、それ自体がレドックス反応に触媒作用をする酵 素ラベルを結合し、その生成物が直接的に又は電極表面で仲介体を介して定量さ れるようなアッセイにのみ関するものである。開示されたアッセイの感度は低く 、屡々おこる低レベルの分析物を検出するに充分鋭敏なようにした実用的なアッ セイというには一般的に充分でない。

本発明者は次のことを見出した。すなわち酵素免疫アッセイが、結合された酵素 ラベルが直接レドックス反応に触媒作用できる酵素ではなく、反応（それは典型 的には加水分解であり、すなわちサイクリックな化学反応又は一連の反応のため のトリガー物質を生産し、電極での電気化学的レドックス反応の一部を占め得る 別の生産物を産生しうる反応）に触媒作用をするような酵素免疫アッセイが行わ れると、実質的に高められた感度の電気化学的免疫アッセイが成され得るのであ る。上記における生産物という用語は、サイクルの実施中に連続的に生成され消 費されるところのサイクリックな反応生産物を包含する。

通常、サイクリックな化学反応は、非レドックスザイクルではあってもそれ自体 はレドックスサイクルであって、その生産物のひとつは電極で電気化学的酸化又 は還元にあとで関与する別の生産物を産生ずるか又は電極で別の反応をすること ができる。

そのようなレドックスサイクルにおいては該サイクルの生産物のひとつ（たとえ ばＮＡＤ十／ＮＡＤＨサイクルにおけるＮＡＤＨやカテコール／キノンサイクル におけるキノン）は電極自体で夫々酸化又は還元されて測定可能な電気化学的変 化を生じるか又は適当な酵素の活性部位を経てもしくは溶液中の何れかで仲介体 の酸化状態の変化を生じることができ、次いで電極において電気化学的に測定さ れる。該サイクリック反応がＮＡＤ／ＮＡＤＨのとき、生成するＮ　Ａ　Ｄ　Ｈ はチオニンやベンゾキノンのような適当な修飾剤でドープされた適当な電極たと えばグラファイト電極で直接測定され得る。別のそして好ましい実施態様におい ては、例えばフェロセン、ヘキサシアノフエレート又はツェナジニウム・メチル サルフェート（ＰＭＳ）の如き可溶性仲介体又はその組み合せを用いる。

化学的仲介体を用いるときは、金属電極たとえば金又は白金の電極が利用できる 。

電極におけるレドックス反応の測定は標準的な電圧電流技術により成され得る。

免疫アッセイは適当な表面たとえばテストセルのウオール又は欧州特許明細書第 １５０９９９号に開示のような磁気粒子表面上の酵素ラベルを固定するようにし て行うことができる。または酵素ラベルを直接に電極表面で固定化しても良い。

免疫アッセイにおいては、その各々が印刷回路板のトラックに接続した電極をも つ複数のテストセルと組合せるのが特に有利である。これは、たとえば電算機を 用いて比較的短い時間々隔で別々の免疫アッセイを表わす多数の酵素反応の進行 を同時にモニターすることを可能とする。

従って本発明の第２の観点においては、テスト液を含有する少くとも１個のテス トセル、該テストセル中の１対の電極及び該セル中の表面に結合した生化学的リ ガンドより成る生化学的テストセルアセンブリーが提供される。ここにおいて該 リガンドは対応する抗リガンドと特異的に結合するようになっており、然して該 電極上の電気的効果の手段、好ましくは、該電極−ヒの電気的効果をレドックス サイクルに用いる別の化学反応の引金となる能力によって直接又は間接に検出し うる酵素ラベルを該表面上に固定化する。

上述のようにこのアセンブリーは好ましくは複数たとえば少くとも８個のテスト セルを含有し、その夫々は該アセンブリーの一部を形成するところの印刷回路板 のトラックに接続されている。印刷回路板はまた好ましくは多方向コネクターを もち、測定装置を該アセンブリー中のいろんな電極対と同時接続できるようにす る。該測定装置はマイクロプロセッサ−を含むマイクロ電算機をもつことができ 、それはたとえば単一のアナログ・デジタル変換器や順序スイッチを用いて電極 対からの連続した値を反覆して読みとり、そして各々の読みとりに関連した値を 貯えるように装着されており、然して経時的に各電極対に対応する該電気的埴の 変化のプロファイルを提供する。

リガンドが結合されている表面は電極表面のひとつであり得、そのため酵素ラベ ルが付着している抗リガンドが対応する電極に接して配置され、電気化学的レド ックス反応に役割をもつ物質と電極表面の間の電子転移を容易ならしめるように する。

生化学的増幅剤が用いられるときく即ち上述のようにサイクリックな化学反応の ためのトリガー物質が生産される反応を該酵素ラベルが触媒作用をするとき）、 リガンドは電極表面に結合している必要はない。何故ならば電子転移を高めるた めに電極表面に固定化され得るところの一部又はすべての、若しくは自由に拡散 し得るところの生化学的「増幅剤」の成分に対するトリガー効果により該酵素ラ ベルは間接的に測定しうるからである。

本発明の別の実施態様において、その又は各々の対の一つの電極はテストセルの 除去可能カバ一部に取付性１（口１６２−５０１１７１　（４）けうる。すなわ ち本発明の別の観点においては、各々の対の電極の少くともひとつがその表面に 結合した生化学的リガンドをもつ、カバーにマウントされそこから放出する複数 の電極対から成るテストセルアセンブリーのカバーを提供する。

本発明の方法はＤＮＡプローブアッセイにも同様に適している。本発明によるＤ ＮＡプローブアッセイにおいて使用されるラベルは該酵素たとえばフォスファタ ーゼ又はヒドロラーゼで、それらはそれ自体ではレドックス反応に触媒作用せず 、上述のようなトリガー物質生成反応に触媒作用をする。この場合にＤＮＡやＲ ＮＡのハイブリッド化アッセイにおいては、マトリックスの低い表面に結合した 一対の平らな白金電極と直接に接しているニトロセルロース又はナイロンの腹又 はフィルターの中で行うのが特に有利である。このようにして生化学的増幅剤の 活性は、単に適当な試薬をフィルターに加えそして電極に適当な電位を付与する ことにより検出できる。

本発明の特定の実施態様を、以下に添付の図面を参照しつつ説明しよう。ここに 第１図は本発明による反応のひとつを模式的に表したものであり；第２図のａか らｅまでは他の反応のい（つかを模式的に表わしたものであり；第３図は電極と ＮＡＤＨをもっレドックスサイクルにおけるリボアミドデヒドロゲナーゼ活性部 位の動作の模式的表現であり；第４図は本発明によるテストセルアセンブリーの 模式図であり；第５図は第４図のテストセルアセンブリーと共に用いるに適した 電算機システムの模式図であり；そして第６．７及び８図は免疫アッセイで得ら れた実験的プロットである。

第１図で模式的に示した本発明の実施態様において、たとえばテストセルのウオ ールであっても良いところのテストセル中の表面１、該テストセル中の磁気粒子 又は電極表面は抗体２、好ましくはモノクローナル抗体をその表面に結合するこ とにより作られる。測定されるべき抗原３は適当な濃度で作られ、抗体内で選択 的に反応するようにされる。酵素５たとえばアルカリフォスファターゼをもって おり、そこへ接続されている第２のモノクローナル抗体４は、公知の「サンドウ ィッチ」免疫アッセイ技術により抗原３と反応させられる。

本発明の方法は、たとえば固定化抗体において抗原が抗原−酵素接合物と競うよ うないわゆる「競合Ｊアッセイの如き非サンドウィッチ型のアッセイにもまた同 様に用い得る。競合アッセイは特に小さい抗原やハプテンのアッセイに適してい る。結合酵素ラベルの電気化学的検出はアッセイの特異的メカニズムが何であろ うとも同様である。

表面工に接続しているアルカリフォスファターゼの量はサンプル中の抗原３の量 に比例しており、次のようにして電気的に測定できる。結合アルカリフォスファ ターゼと共に支持体を渋滞し、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフォスフ ェート（Ｎ　Ａ　Ｄ　ｐ＋　）含有溶液を加える。

このＮＡＤＰ＋は、燐酸エステル化学結合の加水分解によるニコチンアミドアデ ニンジヌクレオチド（ＮへＤ＋）の生成に触媒作用をすることろのアルカリフォ スファターゼ基質を提供する。このＮＡＤ＋はサイクリックな反応のトリガー物 質（いわゆる生化学的増幅剤）として作用し、過剰の基質の酸化たとえばエタノ ールをアセトアルデヒドに変え、そしてたとえばアルコールデヒドロゲナーゼの ようなＮＡＤ十特異的デヒドロゲナーゼにより触媒作用をうけてのＮΔＤ＋のＮ 　Ａ　Ｄ　Ｈへの還元を招来する。このようにして形成されたＮＡＤＨは、それ 自体が電極面で電解酸化を引続きうけるところの酵素ジアホラーゼの活性部位に より再酸化される。これは測定可能な電流を生じさせ、その大きさは免疫アッセ イの酵素ラベルにより産生されるＮＡＤ＋の■に依存する。酵素アルコールデヒ ドロゲナーゼとジアホラーゼの大きな特異性は、アルカリフォスファターゼ基質 （ＮＡＤＰ＋）はレドックス系中に入らぬことを意味する。

第１図に示す例において、電極は酵素ジアホラーゼの活性部位から直接に電子を 受容する。他の実施！Ｉ３様において、適当に変化させた電極は酵素ジアホラー ゼを用いることなしくこＮ　Ａ　Ｄ　ｔ（から電子を受容すイ１で、ｂうう。

このような系（２こおいては、抗体２が電極面へｌＣＬ接粘今され、ることは必 ・頂で：７．）なく、表面１１を例えば子ストセルの・”ｙＡ・−ルのよう・７ 【デスト液中のいかなる面を４）表わすことかできろう 第３図は電極１１ｎ、１′、八Ｉ）の分子とジスルフィド架（喬として、模式的 に示されている活性部位のりボアミド（系統的にはりボアミドデヒドロゲナーゼ とし７て知ら材でいるもの）及びＮ　Ａ　Ｄ　Ｈを含むレドソクスザイクルの反 応模式をより詳しく示すものである。まずＮへＤ　Ｈは第３図の工程１に示すよ うに硫黄原子のひとつと結合し遊離基を形成する。次いでＮＡＤ＋は活性部位か ら離れ（工程２）、転位がおこり（工程３）Ｆ八りを再酸化し残った硫黄を還元 する。ついで活性部位は工程４の仲介体又は電極と接触して充分に再酸化され、 そこにおいて電子は仲介体又は電極へ供与されジスルフィド架橋が再形成される 。

ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋レドックス系のＥｏ’（直は一３２０ｍＶであり、一方リボ アミドデヒドロゲナーゼ活性部位のＦＡＤＨ”／ＦＡ、Ｄ系のそれはＯｍＶに近 い。電子受容体たとえばフェリシアニド（Ｅｏ’、＝　＋４１８ｍＶ　）又はフ ェロセン誘導体（Ｅｏ”＋３００から＋６５０ｍＶ　）又は適当な電位における 電極はジアホラーゼ活性部位を再酸化する。

第２図ａは第１図の反１５模式と似たものを示す。但しザ・イクリック反応で産 生ずるＮΔＤ　Ｈは仲介体（フェリシアニド・イオン）をフェロシアニドに還元 するのに用いられ、プロセスはジアホラーゼの活性部位によりｊ１１１媒作用を うける。一方フェＯシアニドば＋４５０ｍＶの電位で白金作動電極により酸化さ れ電流を生ずる。

生成するフェロシアニドのｍは生化学的増幅剤のサイクリック反応に４人される ＮＡＤ千の量の依存的でありそれは次いで表面１に結合するアルカリフオスファ タ・−ゼ５の里に依存的であるので、電極において産生される定常状態電流は免 疫アッセイにおいて結合された抗原３の量に直接に依存的である。

さらに別の模式を第２図すに示す。ここで付加的仲介体たるフェロセンはＮＡＤ 十／ＮＡＤＨサイクルとフェリシアニド／フェロシアニドサイクルの間へ挿入さ れる。この場合、ＮＡＤ＋のサイクリック反応で帝生されたＮＡＤＨは、ジアホ ラーゼにより触媒作用をうけてフェリセンをフェロセンに還元し、次いでフェリ シアニドをフェロシアニドに還元する。再びフェロシアニドは＋４５０ｍＶの電 位で白金作動電極で酸化され、。

測定される電流を生じる。

上述の生化学的レドックス増幅サイクルにおいて不活性である前駆物質からＮＡ Ｄ＋を生成するためには多くの他の化学的手段がある。アルカリフォスファター ゼ反応についての一つの変法では酵素ラベルとじてＮＡＤ＋グリコヒドロラーゼ を用いる。この酵素は、過剰のニコチンアミドにより駆動される転移反応による 類似体たるＮＡＤ＋ジヒドロキシアセトンからＮへＤ＋を生成する。

第２図Ｃとｄは別の反応模式を示す。第に図Ｃの例において結合したアルカリフ ォスファターゼ５はチオ燐酸エステルを加水分解し′ｔｉ離チオール（、Ｒ３Ｈ ）を生成するために用いられる。遊離チオールはサイクリック反応においてトリ ガー物質として作用し、そこでチオールはジスルフィドＲ３５Ｒとなりまた元に 戻る。

この反応は適当な酵素により触媒作用をうけ過剰のＮＡＤ千の影響下に行いうる 。チオールがリボ酸のとき酵素はジアホラーゼであり得、また千オールがグルタ チオンのとき酵素はグルタチオンレダクターゼであり得る。

第２図Ｃにおいてチオールは、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ系（Ｅｏ’　＝　−３２０ｍ Ｖ）に影響を与えることなく、選択されたチオール化合物に対応する適当な電位 で白金作動電極（陰極）におけるジスルフィド化合物の電気化学的還元により再 生成される。チオール化合物の電気化学的酸化を用いた他のレドックス系は第２ 図ｄに示される。ここで白金作動電極（陽極）はＲ−Ｓ　Ｉ−１から電子を受け とり、ジスルフィドはジアホラーゼ又はグルタチオンレダクターゼを介しＮ　Ａ 　Ｄ　Ｈの過剰により還元される。

第２図ｅに示す反応模式において、免疫アッセイにおける酵素ラベルはβ−ガラ クトシダーゼである。この酵素はｐ−ヒドロキシフェニル−β−ガラクトシドの 加水分解に触媒作業をして１．４−ベンゾキノール又はカテコールを生成する。

これは酵素ラフカーゼを用いる生化学的増幅剤のためのトリガー分子である。カ テコールは酸素の消費により、１．４−ベンジンキノンに酸化され、白金作動電 極（陰極）がキノンからキノール（Ｅｏ’−＋　０．２８Ｖ）への還元に用いら れ、そして電流が測定される。

本発明の方法においては種々の他のレドソクスザイクルが可能である。ＦＡＤ　 （フラビンアデニンジヌクレオチド）はジアホラーゼ活性部位（第３図）の成分 である。それはまた多くのレドックス酵素により用いられる。グルコースオキシ ダーゼの場合は、電気化学的に不活性なアポ酵素が作られる。ガラクトシドのよ うな前駆物質から免疫アッセイにおける酵素ラベルにによるＦＡＤの売主はグル コースオキシダーゼの活性化を招き、次いでそれは過剰のグルコースと共に生化 学的増幅剤として働く　（そこにおいてレドックスザイクルはグルコースオキシ ダーゼの活性部位のＦＡＤ／ＦＡＤＨ２である）、欧州特許明細書第１５０９９ ９号は、可溶性仲介体フェロセンモノカルボン酸及びグラファイト電極を用いて グルコースオキシダーゼの活性を電気化学的に測定する方法を開示している。別 の例においては、共因子ｐＱＱ（ピロロキノリンキノン）がメタノールデヒドロ ゲナーゼのようなあるレドックス酵素により用いられる。免疫アッセイにおける 酵素ラヘルによる燐酸塩のような前駆物質からのＰＱＱの産生はメタノールデヒ ドロゲナーゼの活性化を招き、そして過剰のメタノールにより駆動されるレドッ クス゛す゛イクルｐｑｃｉ／ｐｑｑＩｔ、は適当な仲介体を用いて適当な電極を 還元することができる。

第４図は本発明によるテストセルアセンブリーの模式図である。このアセンブリ ーはそこに８個の孔３２を有する厚さが約ｌＯ龍のポリスチレンブロック３１よ り成る。このブロック３１はエポキシ接着剤により印刷回路板３３に固着される 。印刷回路板３３は、その表面に結合されている８対の電極すなわち３４ａ　、 ３５ａ　、３６ａ等及び３４ｂ、３５ｂ、３６ｂ等をもっている。電極３４ａ、 ３５ａ、３６ａ等は共通の銅トラック４０により末端４１に接合されて共通の又 は基礎の末端を形成する。電極３４ｂ、３５ｂ、３６ｂ等は夫々対応する銅トラ ック３７．３８．３９等により対応する末端４２．４３．４４等と接合される。

すなわち末端４１〜４９は公知の回路板技術において用いられるようなふつうの 周縁コネクターを構成する。

銅のトラック３９〜４０は、ブロック３１の回路ｖｉ、３３への接着と抵触せぬ ように印刷回路板３３の下側に好ましくは形成されうる。ブロック３１の一部５ ２は回路板３３の縁が周縁コネクターとして用いられるように切りとってお持表 昭６２−５０１１７１（６） く。すなわもブロック３１が仮３３上の位置で接着されるときテストセルアセン ブリーは孔３２で定義される？Ｕ敗のテストセル中底板３３より成って形成され 、その各々は１対の電極をもち、末端、１１〜４９により構成される周縁コネク ターによりアクセスされ得る。

図示した８×１のテストセルの排列は単に説明的のもので、実際には多分１２Ｘ ８（合計９６コのテス（・セル）でその各々が二つの電極をもつような排列が用 いられよう。

テストセルの表面はリガンド物質た左えばモノクローナル抗体が、公知方法たと えばテストセル中へ抗体の適当な溶液を単に導入し放置しそして液を傾瀉するこ とにより被覆することができる。

第５図は第４図のテストセルアセンブリーを用いる電気化学的免疫アッセイを実 施するための面易化された電算機排列を示す、第４図のアセンブリーの末端４１ 〜４９と接続するようにした９方向のコネクター７５が９方向のリボンケーブル ７４を介してソフトウェア駆動連続スイッチ７０に接続している。連続スイッチ ７０は次いで電極３４ｂ、３５ｂ、３６ｂ等の各々とアナログ−デジタルコンバ ーター７１を接続し、次いでマイクロＮ　算ａ　７３と接続する。マイクロ電算 機７３はセル３２の各々を一定間隔たとえば毎秒毎に採取しそれを関連する電流 値を保存するようにされている。いったんその値が保存されると、その値は酵素 アッセイの進行の動的測定を提供すべく所望に応じてアクセスすることができる 。

別の実施態様において？ｉｔ極は、印刷回路板上に形成された’ｆＭＲのビンに より形成されそして、たとえばＮＵＮＣにより生成されるような仮のような通常 の光学的マイクロタイ−ター板の壁の中へ下向きに注入されるようになっている 。そのような回路板は上述のような周縁コネクターを備えることができる。

電極は金属、金属処理されたプラスチック炭素又はその他の電導性のもしくは半 導体材料で形成されうる。

特にＮＡＤＨの直接酸化のためには、グラファイトをヘンゾキノン、更に好まし くはチオニンと処理して適当な電極を作ることができる。

本発明の多くの特定の実施！環様を以下の実施例において説明する。

実施例１ 第２図ａに概要を示した原理を用い、次の方法に従ってヒト前立腺酸フォスファ ターゼの電気化学的免疫アッセイを行なった。

９６−ウェルのポリスチレン仮（ＮＵＮＣ免疫プ免疫プレートウェルを、ヒトＰ ＡＰ　（前立腺酸フォスファターゼ）に対するモノクローナル抗体を１．０　ｍ Ｍ炭酸ソーダ緩衝液（ｐ！＋　９．０）中で５μＢ／ｍｌの濃度に稀釈しそして 各ウェルへ１００μｌの溶液をピペット注入するこ左により該抗体で被覆する。

その板を３７℃で１６時間培養し、過剰の抗体を炭酸塩緩衝液で洗滌して除去す る。次いで６％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミン、１ｍＭ塩化マグネシウム、０． ０５％（Ｖ／Ｖ）　ｌ−リドンＸ７０５及び０．１％（Ｗ／Ｖ）ナトリウム・ア ジドを含むａｌｌ　７．５の１００ｍＭトリエタノールアミン緩衝液中の第二モ ノクロナール抗体及びアルカリフォスファターゼ（イシカワ、カワイ及びミャイ 著「酵素免疫アッセイ」東京、医学凹院、１９８１年に記載の方法で作ったもの ）の複合体の５０ａｇ７ｍｌｌを含む溶液７５μ２を各々のウェルに添加し、そ の直後に一定量のヒトＰＡＰを含むヒト血清２５μｌを添加する。板は２２℃で ２時間培養し、その間に固定化抗体、ＰＡＰ及び複合体がウェルの表面上に形成 される。過剰の複合物と血清は、０．１％トリトンＸ７０５．２５ｍ　Ｍ　）リ ス緩衝液（ａｌｌ　８．０）及び２００ｍ　Ｍ硫酸アニモニウムの溶液でウェル を洗滌することによって除去される。各々ウェルに５０ｍ　Ｍジェタノールアミ ン緩衝液（ｐＨ９，５）中の０．２ｍＭＮＡＤＰ”　（−コチンアミドアデニン ジヌクレオチドフオスフェート）？容液の２００μβを加える２２℃に２０分放 置後、酵素反応を０．１０ｍ　Ｍ　ＦＳ酸ナトリウム（ａｌｌ　７．０）を２０ μｌ加えて停止させる。各々のＰ　Ａ　Ｐ　’／３度での合計１２の複製ウェル は電気化学的セルに充分な材料を提供するためにプールされる。

ＮＡＤＰ＋に対するアルカリフォスファターゼの作用により形成されたＮＡＤ＋ の濃度を、次いで電気化学的に測定する。セルの容■は２ｍｌで、白金の作動（ ３顛×０．５鰭、ワイヤー）及びカウンター（３ｃｍ×・　０．５ｉｍ）電極な らびに、毛細管で作動セルに接続される第二室中の標準的な恨／塩化玉参照を含 有している。

セル内容物を攪拌するために磁気撹拌棒が用いられる。

追加的の装置は電位差安定装置にューキャッスル・アボン・フィンのトムソン・ エレクトロケミカル製）より成り、セル中の電流の流れは抵抗箱＜　ｉｏｏ、ｏ ｏｏオーム）とチャート記録器（サザンブトンのＪ、Ｊ、インスッルメント製） でモニターされる。使用の前に、作動電極は毎秒１ボルトの掃引速度で１０分間 −６００ｍＶから＋６００ｍＶの電位掃引により前処理される。（各測定のあと で電極は蒸留水で洗い、アルミナ（０，３μｍ）スラリーで磨き次いで再び洗う ）。２５ｍＭ燐酸塩燐酸塩緩衝液（ａｌｌ　７．０）　中に０．２曙のアルコー ルデヒドロゲナーゼ、０．２■のブタ心臓ジアホラーゼ、１０％（Ｖ／Ｖ）エタ ンジオール、８５　ｍＭ塩化ナトリウム及び３％（Ｖ／Ｖ）エタノールを含有す る生化学的「増幅剤」の１．０ｍ＃をセルに加え、次いで免疫アッセイからのプ ールされていたＮＡＤＰ＋溶液（いろんな量のＮＡＤ”を含有している）の１． ０ｍｌ１を加える。セル中の電流は、最終濃度が２５ｍＭとなるようにフェリシ アニドを加えそして＋４５０ｍＶ電位を与えたあとで測定する。電流は測定の最 初の５分間は直線的に増大し、２０分後には恒常値に達する。増大率と恒常状！ ！：４値はサンプル中のＮＡＤ十濃度に比例する。電流の増大率（μＡ／分）を ヒト血ｌＥ］Ｕ６２−５０１１７１　（７） 清サンプル中のＰ　Ａ　Ｐ　濃度に対してブロントシその結果を第６図に示す。

ゼロ標準に対する標傅偏差の２．５倍として定義される電気化学的免疫アッセイ におけるＰＡＰの検出可能最低濃度は０．２４　／Ｊ　ｇ／　ｍ　ｌ又は抗原の ６０アットモルであった。

むろん本発明による電気化学的免疫アッセイで測定される抗原３の性質が不適切 であっても良＜、幾つものエピトープを含有するに充分の大きさをもつ如何なる 所望の抗体であっても、表面１に結合する抗体２及び酵素ラベル５に接合する抗 体５を適切に選択することによって測定が可能である。プロゲステロンのような 小さな抗原の場合は、抗原と酵素ラベル化抗原の間の競合反応は、抗体２で結合 されている酵素ラベル５の量すなわち存在する抗原量と逆比例のものを招来する 。この場合、電気化学的シグナルは抗原濃度の増大に伴って減少する。

実施例２ チオニンで修飾したグラファイト電極を次のようにして作る。チオニン１０■を ９０％エタノール２ｍｌに溶解する。３龍径のグラファイト円キ反をこの７容液 に浸し１０分間放置する。円板を取り出し蒸留水で完全に洗う６次いで円板をア セトン中で洗い最後に蒸留水中で５分間超音波処理する。このグラファイト円板 を、銀含有エポキシ樹脂を用いて白金線にくっつける。

作動容ｆｆ１２ｍ１の二室ガラスセルを用いて電気化学約４（す定を実施する。

作動グラファイト／チオコン電極に加え、該セルはカウンターとして３０の長い 白金線（直径０．５＋ｕ）及び参照として飽和打水電極を有している。セルの作 動室は磁気撹拌棒を用いて燥業中は１１２拌し得られ、付加物は討入港を経由し てセルへ直接に行うことができる。サイクリックな電圧電流図は幾つかのピーク を有する複雑な図であるが、＋１５０ｍＶ電位のところで、満足すべき電流がＮ ＡＤＨ含ｆ溶液からは、０．１Ｍ燐酸ソーダ緩衝液（ａｌｌ　７．０）中の１０ ０　μＭのＮ　Ａ　Ｄ　Ｉ−１ｔＱ度までは電極のレスポンスは迅速で直線的で あることを示す。常状嘘電流は、Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈの注入後、実際的には即時に得 られそれはさらに１０分もの間安定に保たれる。

ＰＡＰの免疫アッセイは次いで、第１図に示した原理を用い実施例１に述べた一 般的方法にしたがって行われる。各々のＰ　Ａ　Ｐ　９度で形成されたＮＡＤ＋ ？ｉ度はチオニン修飾グラファイト電極で測定した。実施例１におりると木質的 に同一の、生化学的増幅剤混合物（ただしジアホラーゼのみを省略）のＩ　ｍｌ をセルに加える。次いで免疫アッセイからの各々プールされたＮＡＤＰ＋溶液１ 　ｍＡを加え、定常状態電流を測定する。セルは測定の間に、蒸留水で洗う。セ ル中の定常状態電流を、ヒト血清サンプル中のＰ　Ａ　Ｐ　４度に対しプロット しその結果を第７図に示す。検出しうる最低濃度は１．９８μｇ／ｍｊ！である 。

実施例３ 生化学的テストセルアセンブリー中のと１・前立腺酸フォスファターゼの電気化 学的免疫アッセイを第２図ａに示す反応複式を用いて次のように行う。８ウエル のポリスチレン紐（ＮＵＮＣ）のウェルを、実施例１記載の方法によりヒトＰＡ Ｐに対するモノクローナル抗体で被覆する。ウェルに１００μｌのＮＡＤＰ＋溶 液を加えるまで、実施例にのべた免疫アッセイを行う。

この基質と共に２２℃で２０分培養したあと、実施例１におけると木質的に同一 の生化学的増幅剤（ただしさらにフェリシアニド２５ｍＭ含有）混合物の１００ μβを各々のウェルに添加する。生化学的増幅剤中の燐酸塩緩衝液は酵素ラベル とアルカリフォスフターゼのこれ以上の反応を阻害し、各々のウェル中で形成さ れたＮＡＤ十は生化学的増幅剤を誘発しうる。各ウェルに生化学的増幅剤の添加 した直後、各ウェルに白金の作動及びカウンター電極の一対（各々３ｍｍＸ　０ ．５ｍｍ）より成るフタを、この８ウエルの紐の上に置く。これらの白金電極は 各々のウェル中の溶液中へ充分に浸し、銀含有エポキシ樹脂を用いて直径２ｍｌ の絶縁銅ビンにセメンチージョンする。銅ピンは、８　ｃｍ　ｘ　１　ｃｍ　ｘ 　３　ｍｍの大きさのポリスチレンシートにあけた孔にさしこんでフタを形成し 、各々ビンは第５図に示すようにソフトウェア駆動スイッチに接続する。使用前 に、白金作動電極は、蒸留水中で−６００ｍＶから＋６００ｍＶの電位範囲によ り前処理され、各作動電極はアルミナスラリー（０，３μｍ）で麿かれる。次い でテストウェル組合せとフタはタイクーチツク・プレート・シェーカー（フロー ・ラボラトリーズ製）の最上部のプレートヘテーブされ、はげしく攪拌してＩＮ 拌セルをシミュレートする。

次いでＢＢＣのマイクロ電算機（２つの電極系から電流を記録し電位を平衡させ るための適当なラフ１−ウェアをもっている）のユーザーボートを介して各々の 電極に＋４５０ｍＶの電位を与える。各々のウェルにおけるる。電流増加速度（ μＡ／分）をヒト血清サンプル中のＰ　Ａ　Ｐ　濃度に対してプロットしその結 果を第８図に示す。

この実施例においては、免疫アッセイにおける酵素ラベル活性は生化学的増幅剤 の添加前に停止する。別法として、活性を継続することは、測定期間を通じてト リガー分子Ｎ　Ａ　Ｄ＋の連続的出現によりおこる電流発生が一段と複雑な反応 機構となるため行われなかった。

アセトアルデヒド ＦＩＧ、、！、。

ＦＩＧ、６゜ ｎｇ／ｍｌ　ＰＡＰ ＦＩＧ、　７ ｎｇ　／ｍｌ　ＰＡＰ ｎｇ／ｍｌ　ＰＡＰ 国際調査報告 、、、１．、、、、、、、、、、、、、、、、、、、Ｎ、ＰＣＴ／ＧＢ　８５１ ００５９０１ｍ参ｌｌｌｌｌａＭｍｌ＾＋ｅｕ＋＋ｗＭＮｅ、ＰＣＴ／ＧＢ　８ ５１００５９：）−２−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．試料中の生化学物質の量に対応した量の酵素を固型の支持体に結合するよう にしてアッセイを行い、そして電極におけるレドックス反応により生じる電気的 変化を測定して固型の支持体に電気化学的に結合している酵素の量を測定するこ とから成る試料中の生化学物質の測定方法において、結合した該酵素自身はレド ックス反応に対し触媒作用をせずサイクリックな化学反応又は一連の反応のため のトリガー物質を生産する反応に対し触媒作用をし、但し該反応の生産物の少な くとも一つは該トリガー物質でありそして少くとも他の一つは、電気化学的に測 定される電極で生起するレドックス反応を起し得るものであることを特徴とする 試料中の生化学物質の測定方法。 ２．該トリガー物質がニコチンアミドアデニンジヌクレオチド補酵素である請求 の範囲第１項記載の方法。 ３．該少くとも他の一つの物質がリポアミドデヒドロゲナーゼである請求の範囲 第１項又は第２項記載の方法。 ４．該サイクリックな一連の反応が、ＮＡＤ＋特異的デヒドロゲナーゼの存在下 に行われる脱水素反応である請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。 ５．生化学的リガンドが電極表面に結合し該リガンドは免疫アッセイの間、対応 する反リガンドである、以上の請求の範囲のいずれかの項に記載の方法。 ６．該酵素がフオスフアターゼ又はヒドロラーゼである、以上の請求の範囲のい ずれかの項に記載の方法。 ７．該サイクリックな化学反応がＮＡＤ＋／ＮＡＤＨサイクル、カテコール／キ ノンサイクル、チオール／ジスルフィドサイクル、ＦＡＤ／ＦＡＤＨサイクル又 はＰＧｄ／ＰＱＱＨ２サイクルである、以上の請求の範囲のいずれかの項に記載 の方法。 ８．該酵素がアルカリ性フォスフアターゼ、該サイクリックな化学反応がＮＡＤ ＋／ＮＡＤＨサイクル、そして該トリガー物質がＮＡＤ＋である、請求の範囲第 ６項又は第７項記載の方法。 ９．反応混合物が該少くとも他の一つの物質と電極の間へ電子を転移し得る少く とも一つの電子転移仲介体から成る、以上の請求の範囲のいずれかの項に記載の 方法。 １０．該電子転移仲介体がフエロセン又はその誘導体及び／又はフエリシアニド である請求の範囲第９項記載の方法。 １１．テスト溶液を入れる少くとも１個のテストセル、該テストセル中の一対の 電極及び該セル中で表面に結合した生化学的リガンドから成り、そして該リガン ドは対応する抗リガンドと特異的に結合するように装着されており、それによっ て該電極上でその電気的効果の手段により検出され得る酵素を該表面で固定化す る生化学的セルテストセンブリー。 １２．各々が一対の電極を含む複数のテストセルから成り、該テストセルの電極 の各々はアセンブリーの一部を形成するように印刷回路のトラックに結合されて いる請求の範囲第１１項記載のアセンブリー。 １３．アセンブリーの複数対の電極への、測定装置の同時接続を可能とする多方 面コネクターを含む請求の範囲第１２項記載のアセンブリー。 １４．複数対の電極と関連する電気量を順次読みとる手段を含む請求の範囲第１ ３項記載のアセンブリー。 １５．該読みとり手段が該複数対の電極からの順次の値を反覆して読みとり、そ して各々の読みとりに関連した値を貯えるようにした電算機より成るものであり 、そのようにして経時的に各電極対の該電気的の値に変えるプロフィルを提供す るようにした請求の範囲第１４項記載のアセンブリー。 第１６．該酵素が該電極上で電気的効果をもつサイクリックな反応又は一連の反 応についてのトリガー効果手段によって検出されうる請求の範囲第１３ないし１ ５項の何れかの項に記載のアセンブリー。 １７．少くとも８個のテストセルから成り、各々のセルは一対の電極をもってい る請求の範囲第１３〜１６項の何れかの項に記載のアセンブリー。 １８．その又は各対の電極の少くとも一つの電極が、対応するテストセル用の除 去可能なカバー部分に取付けられる特許請求の範囲第１２〜１７項のいずれかの 項に記載のアセンブリー １９．該リガンドが結合している該表面が、該電極の一つの表面である請求の範 囲第１２ないし１８項のいずれかの項に記載のアセンブリー。 ２０．電極表面のひとつが、レドックス反応を含む生化学的増幅サイクルの成分 を結合している請求の範囲第１２〜１９項のいずれかの項に記載アセンブリー。