JPS62500739A - 総鉄結合能の測定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 総鉄結合能の測定 本発明は血清中の総鉄結合能の測定に関する。

鉄は、血漿中では、トランスフェリンと呼ばれる特異的な担体蛋白質によって運 搬される。この蛋白質は分子ｆｆ１７６．０００〜８０．ＯＯＯで、それぞれ１ 個の鉄原子と結合できる２個の部位を有する。存在するトランスフェリンの総量 が血清の総鉄結合能（Ｔ、１．Ｂ、Ｃ，’）を決定する。

Ｔ、１．Ｂ、Ｃ，の評価は重要な臨床的手段のひとつであり、鉄欠乏性貧血やヘ モクロマト−シスのような症状の診断および治療処置のモニタリングにおける役 割は確立している。鉄欠乏状態ではＴ、１．Ｂ、Ｃ，は上昇し、鉄負荷状態では Ｔ、１．Ｂ、Ｃ，は低下する。

現在、Ｔ、１．Ｂ、Ｃ，の測定に用いられている方法は、トランスフェリンを飽 和させ、過剰の鉄を血清から炭ＦＥ、？グネシウム［Ｒａｍ５ａｙ、Ｗ、Ｎ、Ｍ 、：Ｃ１１ｎ、Ｃｈｉｍ、＾ｃｔａ。

？、２２１　（１９５７）］またはイオン交換樹脂［Ｐｅｔｅｒｓ、Ｔ、、Ｇｉ ｏｖａｎｅｌ　ｔｏ、Ｔ、Ｊ、、Ａｐｔ、Ｌ、＆　Ｒｏｓｓ、Ｊ、　Ｉｌ、：Ｊ 。

Ｌａｂ、Ｃｌ１ｎ、Ｈｅｄ、、４８．２７４　（１９５６）　１のような吸着剤 で除去する方法によっている。ほかに、飽和後過剰の鉄を直接測定し、不飽和鉄 結合能を計算する方法がある［旧１１ｉａｍｓ、Ｈ，Ｌ、＆　Ｃｏｎａｒｄ、Ｈ ，Ｅ、：　Ｊ、Ｌａｂ、Ｃｌ１ｎ、Ｈｅｄ、、６７、　１７１　（１９６６）　 ：０’Ｈａｌｌｅｙ、Ｊ、Ａ、、Ｈａｓｓｅｎ、＾、。

Ｓｈｉ　ｌｅｙ、　Ｊ、＆　Ｔｒａｙｎｏｒ、Ｈ，：Ｃｌ　ｉｎ、ｃｈｅｍ、　 、　１６．９２　（１９７０）］。もつとも一般的に用いられている炭酸マグネ シウム法では、上澄液中の非トランスフェリン結合鉄が包含されるために誤差を 生じやすい［Ｒａｍ５ａｙ、Ｗ、Ｎ、Ｈ，：Ｊ。

Ｃｌ１ｎ、Ｐａｔｈｏｌ、、　２６．６９１　（１９７３）　］。

炭酸ママグネシウムよりも迅速、簡単で、精度も改善されたアルミナカラムを使 用する改良法を以前に、本発明者は発明した［Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅｍ、、　２６　 、１５６　（１９８０）］ 本発明の目的は、”ｒ、ｉ、ａ、ｃ、の測定の改良にある。

本発明は、一端を閉じ、取りはずし可能なキャップを有するチューブであって、 その底部の内表面に付着させた乾燥鉄飽和物質の既知ｍと乾燥アルミナ（Ｍ化ア ルミニウム、Ａ１２０３）の既知辺を含有するチューブを提供する。

チューブおよびキャップはプラスチックで作成することが好ましい。

プラスチック製チューブの頚部には、プラスチック族ねじキャップを受けるよう にねじ山を設ける。ねじキャップは、所要量のアルミナを含有させるのに十分な 大きさとするのがとくに好ましい。

チューブはポリスチレン製とするのが好ましく、透明なポリスチレンがとくに好 ましい。

キャップはポリスチレン製とするのが好ましい。

乾燥鉄飽和物質としては第二鉄の錯塩が好ましい。

アルミナはりＯマドグラフィー用の塩基性のアルミナが好ましく、とくにベック マン（Ｂｅｃｔｖａｎｎ　）　［級がとくに好ましい。

チューブは自動分析装置のサンプルキャリアーに適合するように、たとえば自動 分析装置のサンプルプローブがチューブ内を占めるアルミナのレベルより上部か らサンプル採取を行うように設計するのが好ましい。

本発明は他の態様として、アルミナをチューブからキャップ内に移し、チューブ には溶媒たとえば水を加えて鉄鎖和物質を溶解し、チューブに血清サンプルを加 え、ついで短時間インキュベートして鉄を血清サンプル中のトランスフェリンに 結合させ、アルミナをチューブ中に戻し、チューブを混合して非結合鉄をアルミ ナに結合させ、ついでアルミナを沈降させたのち上澄液の鉄含ｍを適当な方法た とえば自ａ連続フロー分析装置によりあるいは原子吸光スペクトルによって測定 することからなる。

上）ホの装置を用いた王、１．Ｂ、Ｃ，の測定方法を提供するものである。

本発明の好ましい態様を、例示の目的で、図面を参照しながら説明する。

第１図は、ねじキャップを有し、既定量のアルミを含有し、既定ｍの鉄鎖和物質 をチューブの内表面に結合させた、支えないでも立つサンプルチューブの分解図 である。

第２図は、第１図と同じ支えないでも立つサンプルチューブであるが、差し込み 式で装着できるキャップを付したチューブの分解図である。

第３図は、第１図と同じ支えないでも立つサンプルチューブであるが、ねじキャ ップには、中空に間口しキャップと連続した中央突出部を有し、その内表面に既 定量の鉄鎖和物質を結合させたキャップの分解図である。

本発明の一実施態様によれば、第１図に示したような支えないでも立つサンプル チューブであって、−ｏｌを閉じたポリスチレンチューブ３のねじ山を切った頚 部２にねじ込み式に適合するポリエチレンキャップ１からなり、支えないでもチ ューブが立つような底部を形成する枠４を有するチューブを提供する。このチュ ーブには、洗浄し乾燥したクロマトグラフィー用アルミナ粉末５の既定ｎと、チ ューブ３の内表面の底部に結合させた鉄鎖和物質６の既定ｍを含有する。

好ましい態様によれば、一端を閉じたポリスチレンチューブ３の頚部２の内部に 滑合して適合するポリエチレンキャップ１からなり、支えないでもチューブが立 つような底部を形成する枠４を有する、支えないでも立つサンプルチューブを提 供する。チューブ内には、洗浄し乾燥したクロマトグラフィー用アルミナ粉末５ の既定量と、チューブ３の内表面の基部に結合させた鉄鎖和物質６の既定ｍを含 有する。

ポリエチレンキャップは、アルミナを含有させるのに十分な大きさの半球状のス ペースを形成し、キャップの内径は基部の内径と同一になるように椙築する。

チューブの高さは４４　ｔｒｖｎ　（キャップを含めない）とし、その上部の外 径は１５眉、底部の外径は１２．５ｍ、実効容ｆ１２ｍとすることが好ましい。

チューブの高さは４０ｍとするのがさらに好ましい。

好ましくは、アルミナ０．４ｇを使用する。

好ましい態様においては、チューブに０．２％ナトリウムアジド含有の０．１モ ル／ｉクエン酸溶液１λ中３÷ Ｆｅ　５００１＋＃の濃度のＦｅＣｌ３溶液１０μｍを加え、チューブを７０° の乾燥器中で乾燥するまで（約３時間）加熱することにより、チューブ３の底部 に鉄鎖和物質を付着させる。

特定の例を示せば、試験は以下のように実施される：１、チューブを逆さにして キャップをはずし、アルミナをキャップ内に保持させる ２、チューブに水１ａｉ！を加え、２分またはそれ以上持って、チューブの底部 に付着した乾燥鉄飽和物質を溶解させる ３、サンプル（血清）０．５ｄを加え、３分またはそれ以上放置して、鉄を担体 蛋白質トランスフェリンに結合さける。

４、アルミナをチューブに戻し、ついでキャップをしめる ５、キャップをしたチューブを実験重用ローティター上にＵぎ、１０分またはそ れ以上、一定速度で反転させて混合する ６、ローティターからチューブを取り、０．５分またはそれ以上静置し、上澄液 の一部を他のサンプル容器に移すかまたはチューブ自体をサンプル容器に使用す る（このチューブはある種の自動装置たとえば病院でよく使用されているｒｅｃ ｈｎｔｃｏｎ自動分析装置にはサンプル容器として使用することができる） ７、上澄液の鉄含■を測定する 本発明の他の好ましい態様によれば、一端を閉じたポリスチレンチュー７３のね じ山を切った頚部２にねじ込み式に適合するポリエチレンキャップ１をもち、支 えないでもチューブが立つような底部を形成する枠４を有する、第３図に示した ような支えないでも立つサンプルチューブを提供する。チューブには、洗浄、乾 燥したクロマトグラフィー用アルミナ粉末５の既定量を含有する。

キャップ１には、たとえば半球状をなす中空の間口部を形成し、キャップと一体 の中央突出部を設ける。既定ｎの鉄鎖和物！！ｉ６はこの開口部の内表面に付着 させる。

このキャップは、アルミナを傾瀉しないで試験が実施できるように設計されてい る。鉄鎖和物質が付着している中央突出部が、アルミナと鉄鎖和物質の）塾触を 妨げるので、鉄はアルミナと結合する前に溶解し、トランスフェリンと結合する ことができる。

チューブの高さは４４　ｍ　（キャップを含めないで）、頂部の外径ｔま１５＃ 、底部の外径は１２．５Ｍ、実効容量は２ｄとするのが好ましい。中央突出部の 外径は７馴で、キャップをねじ込んだとき、この突出部はチューブ中に１１ｍ突 出する。突出部の中空間口部は溶液１０μｌを含有することができる。

１％グリセＯ−ル含有０．４５ｍｏｕｅ／Ｊクエン酸１３＋ ！中にＦｅ　５００Ｒｇを含むように調装したＦｅＣｌ３溶液１０μｌを逆さに したキャップに加え、乾燥器中７０℃で乾燥するまで〈約３時間）加熱して、鉄 鎖和物質をキャップの中空間口部に付着させる。クエン醍の濃度（０，４５■ｏ ｉｅ／Ｊ）は、アルミナの存在下における鉄のトランスフェリンへの至適結合を 促進するように選ばれている。グリセロールは、鉄鎖和物質のポリエチレンへの 付着を良好にするために加える。

アルミナは０．４ｇ使用するのが好ましい。

特定の例を示せば、試験は次のように行われる。

１、鉄！ａ和物質を含むキャップをはずす。

２　アルミナを含むチューブに水１ｄ、ついで血清０．５ｍを加える。

３、キャップを戻して、以下前述の工程５〜７と同様に進める。

本発明は、材料の価格、試薬の安定性、操作の迅速性および簡便性、結果の信頼 性等に関し、先行技術に比べて著しい改良を可能にするものである。本発明にお ける材料の価格は、カラム法の場合の価格の１７３以下である。

試薬をセットしたチューブは室温で少なくとも６力月安定であり、本発明者の以 前の報告［Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅｍ、、　２６゜１５６　＜１９８０）］における保 存ＦｅＣで３溶液の安定性、４℃で３力月に比べて苔しく改良されている。本発 明の操作は、インキュベーションの時間を除いて１分で完了するが、従来の操作 では１．５分を要した。

さらに、試薬は事前に充填した形で与えられるので、カラム法の場合の洗浄や乾 燥、アルミナの秤♀や分配、鉄溶液の１４製や分配等の必要がなくなり、作業伍 は著しく低下した。

チューブに添加するために各パッチのアルミナを予め試験できるので、操作の品 質管理も向上させることができる。これによりアルミナの鉄結合ｎが一定しない ために、実験誤差を生じたり、実験のやり直しが必要になるといった問題は解消 する。

本発明の一本のチューブですべての操作を実施できる方法の採用により、材料お よび骨動の両者で、費用のｉｌｌ減ができる。

本発明の操作によれば、高脂肪血症、高ビリルビン血症の血清サンプルや溶血サ ンプルの場合に誤差を生じやすいということもない。予備的研究によれば、本発 明の操作は、１ｆＩＮ清サンプルと同様、血漿サンプルにも適用可能なことが示 されている。

以上、本発明を特定の例について詳則に説明したが、これは本発明を例示するた めのものであって、本発明の一般的態様をいかなる意味においても限定するもの ではないことに留意すべきである。

国際調査報告 ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　ＴＨＥ　ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣＨＲＥＰ ＯＲ工０ＮＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ　Ｎｏ、　Ｐ ＣＴ／ＡＵ　８５１００２６４ｕｓ　３９２５０２０　Ｊρ５０００５０９７Ｌ ＩＳ　３８８７３３２　ＪＰ４８１０４５９７ＵＳ　３７７３４６７ ＵＳ　３５３７８２２　ＣＡ　９４９８６６εＮＯＯＦ　ＡＮＮＥＸ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）取りはずし可能な栓を有し、容器または栓の内表面に付着させた乾燥鉄飽 和物質の既定量および乾燥アルミナの既定量を含有する容器からなる、血清また は血漿の総鉄結合能の測定に用いられる装置（２）一端を閉じたチユーブであつ て、その密閉端から遠位に取りはずし可能な栓を有し、チユーブまたは栓の内表 面に付着させた乾燥鉄飽和物質の既定量および乾燥アルミナの既定量を含有する チユーブからなる、請求の範囲第１項に記載の装置 （３）一端を閉じたチユーブであつて取りはずし可能な栓を有し、チユーブの底 部内表面に付着させた乾燥鉄飽和物質の既定量および乾燥アルミナの既定量を含 有するチユーブからなる、請求の範囲第１項に記載の装置（４）チユーブおよび 栓はプラスチツク製である、請求の範囲第１項または第２項のいずれかに記載の 装置（５）プラスチツクチユーブの頚部にねじ山を設け、ねじ込み式プラスチツ クスキヤツプを受けれるようにした、請求の範囲第４項記載の装置 （６）ねじ込み式キヤツプは既定量のアルミナを含有できる大きさとする、請求 の範囲第５項記載の装置（７）チユーブはポリスチレン製である、請求の範囲第 ２項から第６項までのいずれかに記載の装置（８）キヤツプはポリエチレン製で ある、請求の範囲第５項から第７項までのいずれかに記載の装置（９）乾燥鉄飽 和物質は、第二鉄イオンの錯塩である、請求の範囲第１項から第８項までのいず れかに記載の装置 （１０）アルミナは塩基性クロマトグラフイー用アルミナである請求の範囲第１ 項から第９項までのいずれかに記載の装置 （１１）アルミナはべツクマングレードＩＩを使用する請求の範囲第１項から第 １０項までのいずれかに記載の装置 （１２）一端を閉じたポリスチレンチユーブのねじ山を切つた頚部にねじ込み式 に適合するポリエチレンキヤツブを有し、チユーブが支えないでも立つような底 部を形成する枠をもつチユーブであつて、洗浄、乾燥した塩基性クロマトグラフ イー用アルミナ粉末の既定量およびチユーブ内表面の底部に付着させた鉄飽和物 質の既定量を含有するチユーブからなる、血清または血漿の総鉄結合能の測定に 使用する装置 （１３）一端を閉じたポリスチレンチユーブの頚部の内側に滑合式に適合するポ リエチレンキヤツプを有し、チユーブが支えないでも立つような底部を形成する 枠をもつチユーブであつて、洗浄、乾燥した塩基性クロマトグラフイー用アルミ ナ粉末の既定量およびチユーブ内表面の底部に付着させた鉄飽和物質の既定量を 含有するチユーブからなり、さらにポリエチレンキヤツプはアルミナを含有させ るのに十分な大きさの半球状のスペースを形成し、キヤツプの内径が基部の内径 と等しくなるように構築され、キヤツプは基部と連続的な、隙間のない内表面を 形成するように設計されている、血清または血漿の総鉄結合能の測定に使用する 装置 （１４）一端を閉じたポリスチレンチユーブのねじ山を切つた頚部にねじ込み式 に適合するポリエチレンキヤツプを有し、チユーブが支えないでも立つような底 部を形成する枠をもつチユーブであつて、洗浄、乾燥した塩基性クロマトグラフ イー用アルミナ粉末の既定量を含有し、さらにキヤツプには、たとえば半球状を なす中空の開口部を形成し、キヤツプと一体の中央突出部を設け、その開口部の 内表面に付着させて鉄飽和物質の既定量を含有させた、血清または血漿の総鉄結 合能の測定に使用する装置 （１５）チユーブの高さ（キヤツプを含まない）は４０〜４５ｍｍ、頂部の外径 は１５ｍｍ、底部の外径は１２，５ｍｍ、実効容量は２ｍｌである、請求の範囲 第１２項から第１４項までのいずれかに記載の装置 （１６）チユーブの高さは４０ｍｍである、請求の範囲第１５項に記載の装置 （１７）アルミナの量は０．４ｇとする、請求の範囲第１２項から第１６項まで のいずれかに記載の装置（１８）０．２％ナトリウムアジド含有の０．１ｍｏｌ ｅ／ｌクエン酸中にＦｅ３＋５００ｍｇ／ｌの濃度になるように調製したＦｅＣ ｌ３溶液１０μｌをチユーブに加え、チユーブをオーブン中で乾燥するまで７０ ℃に加熱することにより、鉄飽和物質をチユーブの底部に付着させた、請求の範 囲１２項および第１３項のいずれかに記載の装置 （１９）中央突出部の外径は７ｍｍで、キヤツプをねじ込んだときチユーブ内１ １ｍｍ突出するようにし、中空開口部は溶液１０μｌを含有することができるよ うにした、請求の範囲第１４項に記載の装置 （２０）１％グリセロール含有０．４５ｍｏｌｅ／ｌクエン酸中にＦｅ３＋５０ ０ｍｇ／ｌの濃度になるように調製したＦｅＣｌ３溶液１０μｌを、逆さにした キヤツプに加え、キヤツプをオーブン中で乾燥するまで７０℃に加熱することに より、中空開口部の内部に鉄飽和物質を付着させた、請求の範囲第１４項に記載 の装置（２１）容器またはチユーブが自動分析装置のサンブルキヤリアーと適合 し、分析装置のプローブがチユーブ内のアルミナのレベルより上部からサンブル 採取を行うように設計した、請求の範囲第１項から第２０項までのいずれかに記 載の装置 （２２）（ａ）アルミナをチユーブからキヤツプ内に移し、（ｂ）チユーブに溶 媒たとえば水を加えて鉄砲和物を溶解させ、（ｃ）チユーブに血清または血漿サ ンブルを加え、（ｄ）短時間インキユベートしてサンブル中のトランスフエリン に鉄を結合させ、（ｅ）アルミナをチユーブ中に戻し、（ｆ）チユーブを混合し て結合していない鉄をアルミナに結合させ、（ｇ）アルミナを沈着させ、（ｈ） 上澄液中の鉄含量を測定する、名工程からなる上述の装置を用いた総鉄結合能の 測定方法 （２３）（ａ）チユーブを逆さにしてキヤツプをはずし、アルミナがキヤツプ内 に保持されるようにし、（ｂ）チユーブに水１ｍｌを加え、２分またはそれ以上 待つて、チユーブの底に付着した乾燥鉄飽和物質を溶解させ、（ｃ）血清または 血漿０．５ｍｌを加えて、３分またはそれ以上放置して鉄を担体蛋白質トランス フエリンに結合させ、（ｄ）アルミナをチユーブ中に戻してキヤツプをしめ、（ ｅ）キヤツプをしたチユーブを実験室用ローデーター上に置いて、１０分または それ以上一定速度で回転させ、（ｆ）ローデーターからチユーブを取り出して１ ．５分またはそれ以上放置したのち（ｉ）他のサンブル容器に上澄液の一部を移 すかまたは（ｉｉ）チユーブ自体をサンブル容器として使用し、（ｇ）上澄液中 の鉄含量を測定する、請求の範囲第２２項に記載の測定方法 （２４）（ａ）鉄飽和物質を含有するキヤツプをはずし、（ｂ）溶媒たとえば水 を、アルミナを含有するチユーブに加え、ついで血清または血漿サンブルを加え 、（ｃ）キヤツプをはめ、（ｄ）チユーブの内容を混合し、（ｅ）アルミナを沈 着させ、（ｆ）上澄液中の鉄含量を測定する、請求の範囲第１４項、第１５項、 第１９項または第２０項のいずれかに記載の装置を使用した、総鉄結合能の測定 方法（２５）以上記述したと実質的に同一の方法および装置発明の詳細な説明