JPS6230719A - 活性ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、上皮細胞の成長促進作用及び胃酸分泌抑制作
用を示す活性ペプチドに関する。

（従来の技術） エイチ・グレゴリ−（Ｈ，Ｇｒｅｇｏｒｙ　）は、ヒト
尿に含まれる胃酸分泌抑制物質の抽出精製を行い。

二種の物質、す々わちβ−ウロガストロン（β−ＵＧ）
及びγ−ウロガストロン（γ−ＵＧ）ｔ−ｉた〔ネーチ
ャー（Ｎａｔｕｒｅ　）　２５７巻、３２５−３２７Ｎ
、１９７５年〕。β−ＵＧ及びｒ−ＵＧは、いずれも１
６′ｓのアミノ酸からなる１本鎖ポリペプチドであって
、それぞれ、アミノ酸総数５３及び５２、等電点４．５
及び４．３である。

一方、コーエン（Ｃｏｈｅｎ）らは、ヒト尿から上皮細
胞の成長促進作用を有する物質、すなわち。

ヒト上皮細胞成長因子（ｈ−ＥＧＦ）を発見した（　Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ
　Ａ　、　７２巻１３１７頁、１９７５年）。このｈ−
ＥＧＦ　　はアミノ酸総数が４９ケである。

（発明が解決しようとする問題点） 種々の生理活性の類似性及び免役学的交互性からウロガ
ストロン（ＵＧ）とｈ　−ＥＧＦ’とは同一の物質であ
ろうと言われている反面、アミノ酸総数が前記したとお
り一致しないことは、永らく疑問とされていた。そこで
１本発明者らは、コーエンらの方法に改良を加えて、ラ
ジオレセプターアッセイ（ＲＲ，Ａ）を利用してヒト尿
からのｈ−ＥＧＦの抽出を検討した。

この結果、β−ＵＧ、ｒ−ＵＧ及びコーエンらが発見し
たｈ−ＥＧＦとは異なる新規なｈ−ＥＧＦの単離に成功
し１本発明に至った。

（問題点を解決するための手段） 本発明は１式 本発明に係る活性ペプチドは９次の（１）〜（６）の理
化学的性質を有する。

（１）紫外線吸収スペクトル（第１図、活性ペプチド濃
度８０μｇ／ゴ。

１００　ｍＭリン酸２ナトリ ラム水溶液） （２）　　分子ｉ　　約６，０００（ＳＤＳ−尿素−ポ
リアクリルアミドゲル電気法 動法による） （３）等電点　４．４５（ポリアクリルアミドゲル等電
点電気泳動法によ る） （４）呈色反応　フェノール硫酸法　　−ツクシン法　
　　− フォリン・ローリ−法　　十 （５）溶屏性　水に可溶（但しｐＨ４，４５付近にて等
電点沈殿をする） 酸性メタノール、酸性アセトニト サル；塩基性メタノール及び塩基 性アセトニトリルに可溶 （６）性状　　白色の粉末で水に溶かすと無色透明とな
る ま喪１本発明に係る活性ペプチドは、下記の条件で高速
液体クロマトグラフィーに負荷すると第゛２図に示すよ
うに保持時間５３．５分の位置に溶出する（２８０ｎｍ
の波長に対し吸収ピークを有する）。

カラム　８ｆｆＩＩ！ｌφＸ２５０ｏｍ＋カラム剤　　
５μｍデベロジル０ＤＳ（野村化学■：オクタデシルシ
リル化シリカゲル の商品名〕 溶出液　５０ｍＭ酢酸アンモニウムを含むアセトニトリ
ル水溶液（アセトニトリ ル：水＝２８０：１０００．容量比） 流　　速　　１ｍ／／分 本発明に係る活性ペプチドは９次のよう圧して製造する
ことができる。

まず、ヒト尿をｐＨ３〜４にし、ポリアクリル酸型イオ
ン交換樹脂、ポリメタクリル酸型イオン交換樹脂等の弱
酸性イオン交換樹脂と接触させ。

出する。ついで、溶出液を好ましくは濃縮及び脱塩し九
後、ゲルろ過及びイオン交換を適宜の順序で行う。こζ
で、濃縮は２例えば、スチレン−ジビニルベンゼン系共
重合体、アクリル酸エステル系重合体、メタクリル酸エ
ステル系重合体等の巨大網状ポリマーから々る中性吸着
樹脂と上記溶出液を接触させ１次いで、該樹脂への吸着
物をメタノール、アセトニトリル、ｎ−プロパツール等
の水溶性有機溶剤と水との混合液で溶出する方法又は限
外ろ過法によって行うことができ、比活性を上げるよう
な他の濃縮方法を採用してもよい。上記脱塩は、架橋デ
キストランゲル、架橋ポリアクリルアミドゲル等の親水
性ゲルを用いたゲルろ過法等により行うことができる。

上記したゲルろ過は。

脱塩に採用することができるゲルろ過法と同様の方法で
行うことができるが、展開液としては、酢酸緩衝液、リ
ン酸緩衝液等の緩衝液であって。

０．０２Ｍ以上かつｐＨ５〜９のものを使用するのが好
ましい。上記したイオン交換は、ジエチルアミノエチル
セルロース、ジエチルアミノエチルアガロース等の弱塩
基性イオン交換樹脂を酢酸緩衝液、リン酸緩衝液等の緩
衝液であって０．０５Ｍ以下でｐＩ−Ｉ５〜８．５のも
ので平衡化した後、前工程で得られた溶出液を添加又は
負荷し、ついで、該樹脂への吸着物を酢酸アンモニウム
水溶液で溶出することにより行うことができる。

このようにして得られた溶出液は、ついで、逆相分配型
液体クロマトグラフィーによって精製される。

逆相分配型液体クロマトグラフィーにおいて用いられる
逆相分配型カラムに充填するカラム剤としては、多孔性
シリカゲルに疎水性官能基を化学結合したものが使用さ
れる。特に、疎水性官能基を有する多孔性シリカゲルが
分離能及び回収率の点ですぐれている。シリカゲルに導
入される疎水性官能基としてはメチル基、エチル基、プ
ロピル基、オクチル基、オクタデシル基等のアルキル基
。

シアノプロピル基、フェニル基などが例示され。

これらはシリカゲルに対して炭素含量で８〜２０重量％
含まれているのが好ましい。細孔の孔径としては６０＾
〜３００Ｘに孔径を有するものが好ましい。又粒径とし
ては小さいものが望ましいが実用上５〜７０μｍ程度が
良い。

逆相分配型液体クロマトグラフィーは、先ず。

溶出させる。溶出用液としてはアセトニトリル。

メタノール、エタノール、ｎ−プロパツール等の水溶性
有機溶媒と、酢酸、ギ酸、塩酸、リン酸。

トリフルオロ酢酸、メチル硫酸等の酸またはこれらの酸
とアンモニア、苛性ソーダ等のアルカリの塩を混合して
得られるｐＩ−１１，５〜７の範囲の緩衝液が用いられ
る。

この溶出にあたって、上記溶出用液の水溶性有機溶媒濃
度は、溶出に適するように適当な濃度に調整される。例
えば、アセトニトリル水溶液では。

アセトニトリルの濃度が１８〜２８容量チ、好ましくは
２０〜２５容ｊＩｋ、チの濃度でｈ−ＥＧＦ’を溶出す
るのが好ましい。アセトニトリル濃度が１８容ｉ％未満
では、全く溶出されないか溶出時間が長くなり、２８容
ｆＬ％を越えると溶出先端付近に溶出されるためｍ製効
果が低下する傾向がある。

また、アセトニトリル濃度に勾配をつけて溶出する場合
、溶出後のアセトニトリルの初期濃度はθ〜１６容量チ
及び最終濃度は２０〜３０容量チとするのが好ましい。

なお、最終濃度は３０容量チを越えてもさしつかえない
。このようにアセトニトリル濃度に勾配をつけて溶出を
行う場合、アセトニトリル濃度が２０〜２５容量チの時
にペプチドを溶出させる。溶出に際し、用いる有機溶媒
は。

その極性が小さくなるに従い溶出力が増すため。

極性の大きなもの程、有機溶媒濃度を大きくする必要が
ある。例えばメタノール、エタノール、アセトニトリル
、ｎ−プロパツールの順に極性が小さくなり、この順に
より低濃度でｈ−ＥＧＦを溶出する仁とができる。以上
の溶出は、常圧下で行っても高圧下で行ってもよい。

逆相分配型クロマトグラフィーにおいて、カラム剤とし
てオクタデシル化シリカゲルを用い溶出１としては中性
（たとえば、酢酸アンモニウム。

ｐＨ７）でアセトニトリル濃度２０〜２５容量−のもの
を使用するとｈ−ＥＧＰは、ｔず３種類に分離される。

これらをそれぞれ溶出層にｈ−ＥＧＦ−１、ｈ−ＥＧＦ
−２，ｈ−ＥＧＦ−３とする。このう０．５容ｉｔ％加
える）で行うと溶出層Ｋｈ−ＥＧＦ−１−１とｈ−ＥＧ
Ｆ−１−２の２種類に分離する。

このうち、ｈ−ＥＧＦ−１−２を含む分画を減圧濃縮又
は凍結乾燥すると白色粉末状で本発明に係る活性ペプチ
ドが得られる。

これを５ＤＳ−尿素−ポリアクリルアミドゲルディスク
電気泳動（モノマー濃度１３．８％）で分析するとき、
それぞれ単一バンドとして認められ。

その推定分子量はミオグロゼン部分加水分解物（分子［
１６９４９，１４４０４，８１５９，６２１４゜２５１
２．１３６０）の混合物を標準とした分子量マーカーを
用いたとき約６０００に位置する。又。

ｐｔ＋勾配（ｐＨ４からｐＨ６，５）を有するポリアク
リルアミドゲルプレートを用いた等電点電気泳動を行う
ときそれぞれ異なる位置に単一バンドとして認められた
。表面電極を用いて測定した等電点け、４．４５である
。

その他、前記した理化学的性質を示すみ上記電気泳動法
による結果及び前記した理化学的性質のうち、高速クロ
マトグラフィーが第２図に示すとおりであることから２
本発明に係る活性ペプチドが単一化合物であることがわ
かる。

本発明に係る活性ペプチドが前記した式で示されること
は、酵素分解法、エドマン（Ｅｄｒｎａｎ　）法ｔダン
シル（Ｄａｎｓｙｌ　）法、アミノ酸配列解析法及びマ
ススペクトロメトリーにょシ確認した。

また２本発明に係る活性ペプチドは、上皮細胞の成長を
促進する作用を示し、ｈ−ＥＧＦであることがわかシ、
胃酸分泌抑制作用を併せて示す。

以上において、ｈ−ＥＧＦ分画の確認は、マウスの顎下
線から得たマウスＥＧＦがマウス肝細胞膜上のＥＧＦレ
セプターに対してｈ−ＥＧＦと競争的に結合する性質を
利用して行うことができる。

すなわち、ｈ−ＥＧＦ又はｈ　−Ｅ　Ｇ　Ｆを含む試料
。

ＥＧＦレセプター及び放射性ヨウ素で標識したマクスＥ
ＧＦを水溶液中で混合して反応させ、ＥＧＦレセプター
とマウスＥＧＦ又はｈ−ＥＧＦとの結合物を生成させ、
これを分離して、その放射活性を測定し、検量線に照ら
し、ｈ−ＥＧＦ濃度を決定する〔以下、この方法を、ラ
ンオレセプターアツセイ（ＲＲＡ）という〕。

（実施例） 以下において、ｈ−ＢＧＦ量は、上記几几Ａ法によシ求
めたものであり、比活性は、２８０ｎｍの吸光度と試料
の液量（ｍｌりの積あたりのｈ−ＢＧＦ量である。

実施例 （１）男子尿３に／（ｈ−ＢＧＦ量１６０ｍｇ、比活性
１．６Ｘ１０−３）に４Ｎ塩酸を加えてｐＨ３，０に調
整した。これを予め４Ｎ塩酸でカルボン酸型にしたアク
リル酸型カチオン交換樹脂（ＷＫ−２０゜三菱化成工業
株商品名）を充てんしたカラム（４０ｔりに流速２００
１７時間で流した。次いで、カラムを水１００１！で洗
浄し、１００／の酢酸アンモニウム緩衝液（塩化ナトリ
ウム５０に９．酢酸アンモニウム７．７ｋｇ３よびアン
モニア水１５．５１！に水を加えて１００１としたもの
）１次いで４８１！の４Ｎ苛性ソーダ溶液、更に９０１
！の水で溶出した。溶出後のｐＨは溶出時間と共に増大
する。このうち、溶出後のｐＨが１１以下の分画を集め
た。

この溶出液中のｈ−ＥＧＦは６０．４＠（回収率３８チ
、比活性Ｏ，ＯＳ）であった。

（２）溶出液２０１！（ｐＨ４，５に調整）にメタクリ
レート系中性吸着樹脂（ＨＰ２ＭＧ：三菱化成工業■商
品名）　８００　ｍｌを加えて２時間攪拌してｈ−ＢＧ
Ｆを吸着１次いで塩酸−メタノール混合液（６Ｎ塩酸：
メタノール＝１：ＩＺ５．容量比）８Ｉ！で溶出した。

これを中和後、減圧濃縮してｓ　ＯＯｍｌ　ｈ　Ｌ架橋
テキストランゲル（セファデックスＧ−２５，ファルマ
シア・ファインケミカル・ＡＢ商品名）Ｋ負荷し、０．
０１Ｍ酢酸アンモニウムで展開して塩を含まない部分を
採取した。次いでｐＨ５，３の０．０１Ｍ酢酸アンモニ
ウム液で平衡化したジエチルアミンエチル（ＤＥＡＥ）
セルロース（ＤＥ−３２，ワットマン・ケミカルセパレ
ーション社商品名）カラムに吸着させた。０．０１Ｍ酢
酸アンモニウム液で洗浄後、０．３Ｍ酢酸アンモニウム
液で溶出した。この溶出液中のｈ　−ＢＧＦ量は１４．
４■（回収率３８俤、比活性１．２）であった。

（３）この得た溶出液を限外ろ過（分画分子量１０００
）によシ脱塩し、６０ゴまで濃縮した後。

架橋デキストラングル（セファデックスＧ−５０゜ファ
ルマシア・ファイン・ケミカル・ＡＢ商品名）でゲルろ
過した。展開液は０．０１Ｍ酢酸アンモニウム液で展開
し、Ｒ，ＲＡ活性分画を採取した。この溶出液中のｈ−
ＥＣ）Ｆ−ｉは１０ｍｇ（回収率７０係、比活性５．６
）であった。

（４）この溶出液をオクタデシルシリル化シリカゲル（
デベロジルＯＤＳ、野村化学■商品名）を充填したカラ
ム［：　３６．７薗φＸ５００ｍｍ、　　このカラ酸ア
ンモニウム０．０５Ｍを含むアセトニトリル水溶液（水
ニア七トニトリル＝５：１．容蕾比）。

第２液には、酢酸アンモニウム０．０５Ｍを含むアセト
ニトリル水溶液（水ニアセトニトリル＝５：１．６．容
量比）を用いた。第２液は第１液６００ｒｎｌに２５ｍ
１／分で流入すると共に、第１液と第２液の混合液はカ
ラムに２５ゴ／分で流入するようにした。この結果、得
られたクロマトグラムを第３図に示す。

ＢＲＡ法で各溶出分画を測定すると三つの活性分画が現
われ、各分画のｈ−ＥＧＦには、それぞれ胃酸分泌抑制
作用が認められた。該活性分画はそれぞれ、保持時間が
４８〜５２分、５４〜６２分及び６２〜６８分に溶出し
、これらの総ｈ−ＥＧＦ量は８．５ｍｇ、それぞれの分
画のｈ−ＥＧＦｉｉは、溶出順にＺＯｍｇ、　　１．５
ｒｆ！Ｑ及び５．０　ｍｇであり、各ｈ−ＥＧＦの比活
性は溶出順に１３０，２４０及び２９０であった。各分
画を減圧濃縮し、凍結乾燥して乾燥品を得、上記溶出順
にｈ−ＥＧＦ−１，ｈ−ＥＧＦ−２及びｈ−ＥＧＦ−３
とした。５ＤＳ−尿素−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動（モノマー濃度１３．８チ、標準物質：ミオグロビン
部分加水分解物で分子量が１６９４９，１４４０４，８
１５９，６２１４゜２５１２及び１３６０の混合物）に
よるとｈ−ＥＧＦ−１については１分子量約６０００と
約７４００のニバンド、ｈ−ＥＧＦ−２については。

分子量約６０００と約７０００のニバンド及びｈ−ＥＧ
Ｆ−３については２分子量約６０００の一バンドが検出
された。

第３図に、上記の溶出ておける各分画毎のｒｌ、ＲＡ活
性値を斜線棒グラフで示す。ＲＲＡ活性は４６〜４８分
、４８〜５０分、５０〜５２分、５４〜５６分、５６〜
５８分、５８〜６０分、６２〜６４分、６４〜６６分及
び６６〜６８分の分画に現われ、他の分画には現われな
かった。

（５）上記（４）で得られたｈ−ＥＧＦ−１を含む分画
をｈ−ＥＧＦ量で５００μｇを、デベロジルＯＤＳを充
填したカラム（８ｗφＸ２５０ｍｍ、　日立６３５型に
装着）Ｋ負荷し、酢酸アンモニウム０．０５Ｍを含むア
セトニトリル水溶液（アセトニトリル：ｍｌ／分で溶出
した。得られたクロマトグラム（横軸に保持時間、縦軸
に、２８０　ｎｍの吸光度）及びＲＲＡ活性値を示す斜
線棒グラフを第４図に示す。

Ｒ，ＲＡ活性は、保持時間２６〜３０分及び４６〜５８
分に現われる。

４６〜５８分の分画を減圧濃縮し、凍結乾燥して本発明
に係る活性ペプチド（ｈ　−ＥＧＦ　）を得た。

（６）一方、上記（４）で得られたｈ−ＥＧＦ−３を含
含むアセトニトリル水溶液（アセトニトリル：水＝１７
０：５００）２００ｍＪに酢酸１　ｍｌを添加したもの
を使用した。この結果、ＲＲＡ活性は。

保持時間２２〜２６分、２７〜３０分及び４９〜５５分
の分画に現われた。これらの分画については、　Ｒ，Ｒ
，Ａ活性分画と２８０　ｎｍの波長における吸光度ピー
クとが対応した。これらの分画のうち。

第１の分画に含まれるｈ−ＥＧＦが前記したβ−ＵＧに
及び第３の分画に含まれるｈ−ＥＧＦが前記したｒ−Ｕ
ＧＫ等しいことを確認した。

（力　繊維芽細胞の増殖試験 ウシ胎児血清１０チを含むダルベツコＭＥＭ培地１３．
９ゴを加えた３５■φＸ１０ｍｍシャーレに前記（５）
で得た活性ペプチド及びヒト皮膚繊維芽細胞を含む細胞
液１．１ゴ（１，８Ｘ１０８セル）を入れ。

よく混合する。これを３７℃炭酸ガス５チ、空気９５チ
のインキュベータで単層培養する。培地交換は培養３日
目と６日目に行い、０．３，５．７及び１００日目血球
計算盤を用いて細胞数を測定した。活性ペプチドは１０
μｇ／ｍ／になるように使用した。また、活性ペプチド
を使用しない場合についても同様に試験した。この結果
を第５図に示す。第５図中グラフ１は活性ペプチドを使
用した場合及びグラフ２は活性ペプチドを使用しない場
合を示す。

（８）胃酸分泌抑制試験 体重１３に９のピーグル犬（ｊｓ性）の幽門部から約５
ｃｍ離れた背体部に両肩管を取シつけてインタクトフイ
スチューラ犬とし、とれて、ヒスタミン４〜６μｇ　／
　ｋｇ体重を１５分間隔で皮下注射し。

１５分間隔で胃液を両肩管から採取した。胃液量がほぼ
一定になった時点で、前記（５）で得た活性ペプチドを
生理食塩水に溶解してｈ−ＥＧＦｉで０．２５μｇ／に
９体重だけ静脈内注射した。胃液量はいずれの場合も１
５〜３０分後から減少し、３０〜６０分後に胃液量が最
も少なくなった。

ヒスタミンの投与と胃酸分泌量の関係を示す棒グラフを
第６図に示す。

（発明の効果） 本発明の活性ペプチドは、上皮細胞の成長促進作用及び
胃酸分泌抑制作用を示す新規化学物質である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に係る活性ペプチドの紫外線吸収スペク
トル、第２図は本発明に係る活性ペプチドの高速液体ク
ロマトグラム、第３図は実施例の（４）項における逆相
分配型液体クロマトグラム、第４図は実施例の（５）項
だおける逆相分配型液体クロマトグラム、第５図は実施
例の（７）項における繊維芽細胞の増殖試験結果を示す
グラフ及び第６図は実施例の（８）項における胃酸分泌
抑制試験を示す棒グラフである。 符号の説明 １・・・活性ペプチドを使用したときの結果を示すグラ
フ ２・・・活性ペプチドを使用しないときの結果を示すグ
ラフ 代理人　弁理士　若　林　邦　彦 ＋を 答ｌ口 筈出詩１’５　（分） 寥２因

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される活性ペプチド。