JPS62294620A - 細胞増殖抑制因子及びその調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 産１よ公■尻公団 本発明は、動物細胞を培養することにより有用物質を生
産するに際して、該物質の生産効率を向上させるに利用
される細胞増殖抑制因子の調製方法に関する。

弦止血豆量 近年、生理活性を有する有用物質の生産手段として細胞
培養法が、−胞大量培養法のｉ展に伴つて重要視されて
きている。

一般に、動物細胞のうち、がん細胞株は適当な培養条件
下では無限に増殖を続け、やがて培地中の栄養成分を消
費し尽した後、増殖を停止するものであり、また、正常
細胞も適当な培養条件下では有限増殖が可能である。

而して、このような動物細胞の培養による有用物質の生
産は、通常細胞増殖の活発な対数増殖期よりもむしろ増
殖停止後に行われることが知られており、したがって、
上記物質の生産が行われる時期をコントロールすること
が可能であれば、有用物質の生産効率を飛躍的に向上で
きるようになる。

従来、動物細胞の培養においてその増殖を抑制する方法
として、培地中に含まれる増殖因子を減少もしくは除去
することが行われているが、この方法では細胞を安定に
保持するうえで問題がある。

したがって、培地中に増殖因子を存在させて細胞を安定
に保持しながら、その増殖を制御することにより、有用
物質の生産を効率的に行い得る方法の提供が重要な課題
となっている。

日が　“　しようとする課 本発明は、上述したごとき状況に鑑みなされたものであ
って、動物細胞を培養して有用物質を生産するに際し、
培養による細胞の増殖を該細胞の安定性を保持しながら
制御して有用物質の生産を向上するための細胞増殖抑制
因子の調製方法を提供することを課題とする。また、本
発明は、生体内における異常細胞の増殖をも抑制する因
子を調製するための方法の提供も課題とする。

本発明者らは、動物のがん細胞株を培養した培養動物細
胞の抽出物中に細胞増殖抑制因子が存在することを見出
し、本発明をなすに至った。

以下本発明の詳細な説明する。

衾肌■盪底 本発明の特徴は、動物のがん細胞株を培養した培養動物
細胞を抽出して得られる抽出物からタンパク性成分を分
離、採取することにある。

１　　　°するための 本発明では、細胞増殖抑制因子の供給源として種々のが
ん細胞株を用いることができる。

なお、正常２倍体細胞は有限増殖細胞であって、均一な
細胞集団を長期間にわたって増殖維持できないので、上
記抑制因子の供給源には適さない。

本発明は、がん細胞株、例えばヒト肺がん細胞株を、細
胞の培養に通常用いられる培地、例えば最少必須培地（
ＭＵＭ）、ダルベツコ変法ＭＵＭ、ハムのＦ−１２培地
、ＲＰＭｌ　１６４０培地もしくはこれらの混合培地、
さらに必要に応じてこれら培地に動物の血清（例えば、
ウシ胎児血清）または増殖因子を添加した培地を用いて
培養する。この際の培養条件は細胞の種類に応じ適宜選
定するとよ（、例えばヒト肺がん細胞株では３７℃の温
度で５％炭酸を含有する空気雰囲気中９５％以上の温度
で培養する。また、細胞の培養は、ディツシュ、フラス
コ、スピンナーボトル等を用いて行い得る。培養により
増殖した細胞は収穫して抽出処理に付する。

培養細胞の抽出処理には種々の方法を用いることができ
、例えば、３Ｍ塩化ナトリウムのごとき高濃度の塩溶液
による抽出：ノニデットＰ−４０、トライトンＸ−１０
０、デオキシコール酸のごとき界面活性剤による抽出；
ポリトロン、テフロンあるいはガラス製のホモゲナイザ
ーを用いた細胞の破壊による抽出；超音波処理による抽
出及び凍結融解による抽出を用いて行い得る。これらの
方法を用いて上記培養動物細胞を抽出するには、４℃前
後の低温下で行うのが好ましく、高温下での抽出では得
られる増殖抑制因子の活性を消失させるので留意する必
要がある。

上記抽出により得られた抽出物から、目的の増殖抑制因
子を分離するには、塩析、各種クロマトグラフィー、例
えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフイーベ等電点
クロマトグラフィー、アフイニテイクロマトグラフイー
、疎水性クロマトグラフィー等の１種又はそれらを組合
わせて用いて行うとよく、また、これらと電気泳動を組
合わせて用いて行うこともできる。

上述のごとくして培養動物細胞の抽出物から分離して得
られる精製された成分は、タンパク化学的に均一な集団
であって、加熱により失活すること、酸性ｗＩ域のｐＨ
で活性が失われること、吸光度が２８Ｏｎ霧の吸収を示
すこと及びタンパク染色が可能なことから、タンパク性
の物質であると言い得る。

次に、上述のようにして得られるタンパク性成分を細胞
増殖抑制因子として利用するには、ｉｎ　ｖｉｔｒ。

で増殖している細胞の培地中に添加するとよく、増殖抑
制し得る標的細胞としては、がん細胞株をはじめ、有限
増殖が可能な正常２倍体細胞、並びにフイトヘマグ！レ
チニン（ＰＩ３八）、ポークライードマイトゲン（ＰＷ
Ｍ）　、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）、スタフィロ
コッカス・アウレウス・ワーコン！（ＳＡＣ）等の幼若
化物質（Ｍｉｔｏｇｅｎ）で刺激されて増殖している正
常細胞等が挙げられる。

上記抑制因子をこれら細胞が増殖している培地に添加す
ると、後記実施例に示したごとく、その添加濃度に応じ
て細胞の増殖を抑制することが可能となる。

更に、本発明により得られるタンパク性成分から成る細
胞増殖抑制因子は、ｉｎ　ｖｉｖｏで増殖している細胞
、例えばがん細胞の増殖を抑制するのにも利用し得る可
能性がある。

一以下に実施例を示して本発明及びその効果を具体的に
説明する。

実施例 ■細胞増殖抑制因子の活性測定 Ｉ　Ｘ　１０’個のヒト正常リンパ球（非形質転換リン
パ球）を、１０％（Ｖ／Ｖ）の増殖抑制因子溶液、０．
１％ＰＨＡ−Ｐ（ディフコ社）及び１０％ＦＣ５を含む
ＲＰＭＩ　１６４０培地１００μｌに懸濁し、９６六マ
イクロタイタープレート（ファルコン３０７２）中で３
日間培養を行った。細胞の増殖は、ＭＴＴ　（３−（４
，５−ジメチルチアプール−２イル）−２，５−ジフェ
ニルテトラゾリウムブロマイド〕を用いた呈色反応によ
り５７７ｎｍの吸光度を測定した（菅原ら、［免疫実験
操作法Ｊ　ｐ４４７７（１９８４）、増殖抑制活性は、
上記５７７ｎｍの吸光度を直接示すが、抑制因子を加え
ていないリンパ球の増殖を１００とし、最大抑制時の増
殖を０とした百分率、あるいは最大抑制のＡの抑制を示
す濃度を１単位（Ｕ）とする絶対濃度により示した。

■細胞増殖抑制因子の調製 イ）細胞の培養： ヒト肺がん細胞株ＰＣ−８を、１０％ウシ胎児血清（Ｐ
Ｃ５）を含むＲＰＭＩ　１６４Ｇ培地中で、プラスチッ
ク製培養ディツシュ（Ｆａｌｃｏｎ　３００３）を用い
、３７℃、５％炭酸ガスを含む空気雰囲気中、湿度９５
％以上で培養を行った。

培養により増殖したＰＣ−８細胞をラバースクレッパー
を用いて上記ディツシュから収穫した。

口）培養細胞の抽出： １．３　Ｘ　１０＠個のＰＣ−８細胞を３Ｍ塩化カリウ
ムを含む０．０２Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０
）の３ｍｌに懸濁し、マグネチツクスターラーを用い、
４℃で２４時間攪拌下に抽出を行った。得られた抽出液
は１５．０ＯＯＸ　ｇで２０分間遠心した後、上滑をリ
ン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に透析し、生じた沈澱を
遠心により除去した。

ハ）抽出液から増殖抑制因子の分離、精製：上記により
沈澱を除去した液に５０％飽和となるように固形硫酸ア
ンモニウムを加え、生じた沈澱を遠心除去した後、上清
にさらに７５％飽和になるように固形硫酸アンモニウム
を加え、生じた沈澱を遠心により、回収した。

次に、上記回収した沈澱を５１１１７！の０．１Ｍリン
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，６）に溶解し、これと同
じ緩衝液で平衡化したセファクリルＳ−２００カラム（
ファルマシア社製、１．９Ｘ９４ｃｍ）を用いてゲル濾
過を行った。

ついで、ゲル濾過画分を、０．０２Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液で平衡化したモノーＱカラム（ファルマシア社製
、０．５Ｘ５ｃｍ）に負荷し、食塩濃度をＯから０．２
Ｍに上昇させる直線勾配で溶出した。

各分画におけるタンパク濃度は２８Ｏｎ＋ｍの吸光度あ
るいはバイオラッドプロティンアッセイ　（バイオラッ
ド社）により測定した。

第１図は、セファクリルＳ−２００による増殖抑制因子
のゲル濾過パターンと各溶出画分の抑制活性を示したも
のであって、同図にみられるとおり、増殖抑制活性は大
きな一つのピークとして得られる。また、第２図は、ゲ
ル濾過による活性画分をモノ−Ｑによる陰イオン交換ク
ロマトグラフィーに付した結果を示したものであって、
食塩濃度０．０３Ｍ付近における小さな２８０ｎｍ吸収
のピークと一致して抑制活性が溶出されたことがわかる
。

上記により分離、精製した因子は下記の性質を有する。

１）５６℃、３０分間の加熱並びに９０℃、１０分間加
熱によりいずれも完全に失活する。

ｉｉ　）　ｐｌ！　２．０の緩衝液に対して透析するこ
とにより完全に失活する。

１ｉｉ）３０分間の殺菌用紫外線照射（１５Ｗ、２０ｃ
ｍ）では全く活性を失わない。

次に、上記溶出画分を０．１％のソデイウムドデシルス
ルホン酸（５０Ｓ）を含む１０％ポリアクリルアミドゲ
ルを用いたＬａｅｍｓ＋１　＋の方法〔ネイチャーｒＮ
ａｔｕｒｅＪ　、２７７、６８０（１９７０）　）に従
って電気泳動を行った。モノ−Ｑで分画した因子に上記
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った結果
を添付の第３図に示す。タンパクは銀染色により検出し
た。標準タンパク、ミオミン（２０，５万）、ベータ・
ガラクトシダーゼ（１１，６万）ホスホリラーゼ（９，
７万）、ウシ血清アルブミン（６，６万）、卵白アルブ
ミン（４，３万）、カーボニックアンヒドラーゼ（２，
９万）を用いた検量線から算出した因子の分子量は５万
前後であって、１．３　Ｘ　１０＠個のＰＣ−８細胞か
ら３μｇの増殖抑制因子を得た。なお、回収率は１３％
である。

■細胞増殖抑制試験 試験方法： １０％ＦＣ３を含む！？ＰＭＩ　１６４．０を培地とし
て用い下記各細胞を標的細胞として、上記■により得ら
れた精製した細胞増殖抑制因子の存在下で下記手順によ
り培養をそれぞれ行い、各細胞の増殖を測定した。

０がん細胞株としてＴ細胞株Ｍｏ１ｔ〜４及びＢ細胞株
−！Ｌ−２を用い、各細胞株をＩ　Ｘ　１０’／穴にな
るように９６穴プレートにまき込み、抑制因子を５〜２
０Ｕ加え、２日間培養を行い、細胞の増殖をＭＴＴ法で
測定した。

０がん細胞株としての肺がん細胞株ＰＣ−８を８　Ｘ　
１０’／デイツシユ（ファルコン３００１）でまき込み
、抑制因子を１００Ｕ加えて３日間培養を行い、細胞を
トリプシン処理によりディツシュから剥離し、細胞の増
殖をセルカウンター（東亜電子社製）で測定した。

０細胞株として正常ヒトリンパ球を用い、０．１％ＰＨ
Ａ並びに０．５％ＰＷ？ｌ　（ギブコ社）で刺激して増
殖させた。　ＰＨＡによる刺激ではリンパ球をＩ　Ｘ　
１０’個、ＰＷＭ刺激では２Ｘ１０’個をそれぞれ９６
穴プレートにまき込み、抑制因子１〜５Ｕの存在下で３
〜６日間培養を行い、細胞の増殖をＭＴＴ法により測定
した。

結果は、Ｍｏ１ｔ−４並びにＷＩＬ−２の増殖について
は第１表に示すとおりであって、抑制因子の添加濃度に
依存して増殖が抑制された。また、ＰＣ−８の増殖につ
いては、抑制因子無添加の対照では、２３ＸｌＯ’　／
ディツシュに増殖したのに対し、抑制因子を１００Ｕ添
加した場合には増殖は９Ｘ１０’　／ディツシュに抑制
された。

次に、ＰＨＡ並びにＰＷＭで刺激されたリンパ球の増殖
は第２票に示すとおりであって、抑制因子の存在濃度に
依存して抑制された。

第１表 第２表 （ＰＩＩＡ並びに２曲で刺激した 正常ヒトリンパ球の増殖抑制）

【図面の簡単な説明】

添付の第１図は、セファクリルＳ−２００による細胞増
殖抑制因子のゲル濾過パターンと各溶出画分の抑制活性
を示し、第２図は、ゲル濾過による活性画分をモノ−Ｑ
による陰イオン交換クロマトグラフィーに付してものの
抑制活性を示したものである。また、第３図はモノ−〇
で分画した本発明による細胞増殖抑制因子を５ＯＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を行った結果を示したも
のである。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）動物のがん細胞株を培養した培養動物細胞を抽出
   処理してタンパク性成分を分離、採取することを特徴と
   する細胞増殖抑制因子の調製方法。
2. （２）抽出処理を４℃前後の低温下で行う特許請求の範
   囲第（１）項記載の細胞増殖抑制因子の調製方法。