JPS62284260A

JPS62284260A - Ｄｎａ塩基配列決定方法

Info

Publication number: JPS62284260A
Application number: JP12574686A
Authority: JP
Inventors: Kenichi Watabe; 健一渡部; Keiichi Nagai; 啓一永井; Tamotsu Shimada; 保嶋田; Jiro Tokita; 鴇田　二郎; Takamori Nakano; 中野　隆盛; Tomoaki Sumiya; 住谷　知明; Hideki Kanbara; 秀記神原
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1986-06-02
Filing date: 1986-06-02
Publication date: 1987-12-10

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】３、発明の詳細な説明〔産業上の利用分野〕本発明は、ＤＮＡ　（デオキシリボ核酸）の塩基配列を
自動的に決定する方法に関する。

〔従来の技術〕

長いＤＮＡ断片の塩基配列の決定方法としては、例えば
Ｍ１３ファージを用いたショットガンクローニング法が
ある。まず、その工程について説明する。なお、以下の
説明において、「全ＤＮＡ断片」とは、塩基配列を決定
したい長いＤＮＡ断片を、ｒ部分ＤＮＡ断片」とは、全
ＤＮＡ断片を適当な長さに切断したＤＮＡ断片を、「相
補鎖ＤＮＡ断片」とは１部分ＤＮＡ断片をもとに相補鎖
伸長反応を行い、生成させた様々な長さの一本鎖ＤＮＡ
断片を、それぞれ意味するものとする。

また、「全塩基配列」とは、全ＤＮＡ断片の塩基配列を
、「部分塩基配列」とは、部分ＤＮＡ断片の塩基配列を
意味するものとする。

１、全ＤＮＡ断片を、３〜４種類程度の制限酵素を用い
て、適当な長さの種々の部分ＤＮＡ断片に切断する。こ
こで制限酵素はそれぞれ切り口が異なる為、異なる制限
酵素で切断した部分ＤＮＡ断片は互いに重複する部分を
持っている。

２、部分ＤＮＡ断片を精製なしに、ランダムにＭ１３７
アージにクローニングし、大腸菌内で増殖させる１次ド
、それぞれの部分ＤＮＡ断片をもとに相補１Ｉ４ＤＮＡ
断片生成反応を行う、この相補鎖ＤＮＡ断片をゲル電気
泳動法によって分子量分離し、部分塩基配列を決定する
。

３、以上のようにして決定した部分塩基配列は、全塩基
配列のどの領域に由来するのかは一般に不明である。そ
こで、多数の部分塩基配列を比較・照合し、重複してい
る部分を探索し、全塩基配列を再構成する。

一般に、全塩基配列は数千〜致方塩基程度で、一つのゲ
ル電圧泳動パターンから読み取れる部分塩基配列は２５
０〜３００塩基程度までであるから、３〜４種類の制限
酵素を用いて全塩基配列をぬけ落ちなく決定する為には
、数十〜数百の部分塩基配列について重複部の探索を行
わなければならない、この作業は、人′間が行うと膨大
な手間と時間が必要な為、一般には部分塩基配列をコン
ピュータに入力し、全塩基配列を決定する。

なお、以上の塩基配列決定法のバリエーションとして、
制限酵素の代りに超音波を用いるものや、Ｍ１３ファー
ジの代りにプラスミドを使うもの等があるが、部分塩基
配列をもとに、全塩基配列を決定するという点は共通で
ある。

ここで問題となるのは、電気泳動パターンの読み取りの
際に生じる誤りである。以下、どのような場合に誤りが
生じるかについて説明する。なお。

以下の説明において、ｒＤＮＡバンド」とは同一分子量
の相補鎖ＤＮＡ断片群がゲル上に形成する帯のことであ
り、ｒＤＮＡバンドが濃い」とはＤＮＡバンドに含まれ
る相補鎖ＤＮＡ断片の量が多い事を意味し、ｒＤＮＡバ
ンドが薄い」とはＤＮＡバンドに含まれる相補鎖ＤＮＡ
断片の量が少ない事を意味する。

１、非常に濃いＤＮＡバンドに隣接して、薄いＤＮＡバ
ンドがある場合、２、どの泳動路にも非常に薄くＤＮＡバンドしか存在し
ない場合、３、複数の泳動路に同時にＤＮＡバンドが現われる場合
、４、電気泳動パターン全体にわたって、ＤＮＡバンドが
薄い場合。

５、ＤＮＡバンドの間のバックグランドレベルが高い場
合。

以上のような現象の為、従来はコンピュータに入力され
る部分塩基配列は、ある程度の確率で誤りを含んでいた
。そこで、部分塩基配列の重複部の探索の際には、ある
程度以下のくい違い（例えば５０塩基に１塩基）は認め
るような検索を行い、くい違い部については次のような
方法で全塩基配列を決定していた。

１、全ＤＮＡ断片上の同じ領域に由来する部分ＤＮＡ断
片を３つ以上用意し、多数決によって全塩基配列を決定
する、２、元となるゲル電気泳動パターンまで逆のぼり、どの
ゲル電気泳動パターンの信頼性が高いかを判定し、全塩
基配列を決定する。

しかし、この方法には多大な手間と時間が必要である。

そこで、この問題を解決する為に、コンピュータへのデ
ータの入力の際に、Ａ、Ｃ，Ｇ、Ｔの４つの塩基基以外
のあいまいな塩基表現をみとめる試みがなされている０
例えば、「蛋白質　核酸酵素Ｖｏ１．２８　Ｎａ　７　
（１９８３年）」における注口・陶山・上田・和田によ
る「コンピュータによる核酸塩基配列の情報解析（上）
ｊと題する文献の中では、次のような１１種類の塩基表
現が示されている。

この方法は、電気泳動パターンを人間が読み取り、キー
ボードからコンピュータに入力するシステムに対して考
案されたものであり、データの入力の容易さやディスプ
レイの見易さの面で優れている。しかし、全塩基配列決
定の精度については最善とはいえなかった。

〔発明が解決しようとする問題点〕

以上の如く電気泳動パターンの読み取りの際に。

生ずる誤りのため、全塩基配列決定に多大の手間と時間
が必要であり、これを精度よく解決することが望まれて
いた。

本発明の目的は、高精度のＤＮＡ塩基配列決定方法を提
供することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

前述の如く、従来、部分塩基配列のコンピュータへの登
録は、ゲル電気泳動パターンをオートラジオグラムによ
って転写したフィルムを人間が読み取り、部分塩基配列
を決定し、キーボード等からコンピュータに入力してい
た。この為１部分塩基配列の登録方式は、主にデータの
入力と入力結果の確認といった人間の行う操作の容易さ
という面に重点がおかれており、全塩基配列決定の精度
にやや問題があった。

これに対し、ゲル電気泳動パターンを自動的に読み取る
装置の場合は、コンピュータへの部分塩基配列の登録の
途中段階に１人間が介在しない。

この為前記のコンピュータへのデータの入力の容易さと
いった制約が無く１部分塩基配列の登録方式の自由度が
高い。

本発明は、この点に注目し、部分塩基配列の登録方式を
改良することにより、全塩基配列の決定精度を向上させ
ようとするものである。

この方法は、切断済ＤＮＡ断片の塩基配列の４種類の塩
基毎の確からしさを数値化し、重みづけを行い、複数の
切断済ＤＮＡ断片の重みの合計値によって１重複部の塩
基配列を決定し、全Ｄ　Ｎ　Ａ切断の塩基配列を決定す
るものである。

〔作用〕

本発明が適用可能な装置の一例として、ゲル電気泳動中
の相補鎖ＤＮＡ断片から放出されるβ線を実時間に検出
し、ゲル電気泳動パターンを自動的に読み取る装置の斜
視図を第１図に示し、その作用を説明する。

ゲル８は泳動板６と泳動板７にはさまれ、垂直に立って
いる。ゲル８の上端部にはサンプル供給用の溝９（以下
「ウェル」と呼ぶ）がある、ゲル８の上下には緩衝液槽
１と緩衝液槽３が取り付けられている。緩衝液槽１と緩
衝液槽３の中にはそれぞれ、緩衝液２と緩衝液４が入っ
ており、それぞれゲル８の上端と下端に接触している。

緩衝液槽１と緩衝液槽３には、電Ｍ５がつながっており
、ゲル８の上端が負極になるように、直流高電圧を印加
している。

＄２ｐ、８１１Ｓ等の放射性同位体で標識した相補鎖Ｄ
ＮＡ断片試料を、４種類の相補鎖合成反応系（Ａ反応系
、Ｃ反応系、Ｃ反応系、Ｔ反応系）毎に、異なるウェル
９に供給すると、相補鎖ＤＮＡ断片は負極より正極に向
かって泳動する。このとき１分子量の小さい相補鎖ＤＮ
Ａ断片はど泳動速度が速く、同一分子量をもつ相補鎖Ｄ
ＮＡ断片はＤＮＡバンド１ｏを形成する。

以上の部分は、一般的なりＮＡ塩基配列決定用ゲル電気
泳動装置と同一である。

本装置では、前記泳動板６や前記泳動板７の側面にβ線
検出用のスリット１３を設け、β線検出器１４を取り付
ける。スリット１３の前をＤＮＡバンド１０が通過する
と、ＤＮＡバンド１０から放出されるβ線がβ線検出器
１４に入る。β線検出器１４の出力は信号処理回路１５
を通った後、計算機１６に入る。計算機１６はデータ処
理を行い、塩基配列を決定する。なお、本実施例ではβ
線検出器１４は１組であるが、感度向上環の目的で、２
組以上用いることも可能である。

第２図は、β線検出器１４部の断面図である。

光電子増倍管２１の先端にはシリコングリース２２を介
してシンチレータ２３が取り付けられており、遮光の為
、検出器全体が遮光体２４によって包まれている。ＤＮ
Ａバンド１ｏから出たβ線２５はスリット１３を通って
シンチレータ２３に入り、光２６に変換される。光２６
はシンチレータ２３からシリコングリース２２を通って
光電子増倍管２１に入り、電流となって検出される。な
お、スリット１３とゲル８の間にあるフィルム２７は、
スリット１３とゲル８が電気的に絶縁するためと、スリ
ット１３がＤＮＡバンド１０中の放射性同位体によって
汚染されるのを防ぐためのものである。フィルム２７は
、β線を透過させる材料（たとえばポリエステルフィル
ム）からなり、検出感度や精度を悪化させない程度の厚
さである。

第３図は、１１識体として放射性同位体の代りに銀染色
体を用いた場合の検出部の断面図の一例である。銀染色
されたＤＮＡバンド１０が光源３３の上を通過すると、
光３４がさえぎられ、光検出器３２によって検知される
。

次に、本発明を適用可能な装置の別構成として、電気泳
動終了後のゲルを検出器にかけ、ゲル電気泳動パターン
を読取る装置の斜視図を第４図に示す。まず、第１図の
ような電気泳動装置で、ＤＮＡバンド１０をゲル８上に
展開した後、ガラス板６，７とゲル８をバッファ槽１．
３より取りはずす０次に、片方のガラス板６をはがした
後、もう片方のガラス板７とゲル８を移動装置１１に乗
せ、スリット板１２の下を平行に移動させる。

移動装［１１によって、ゲル８上に展開されたＤＮＡバ
ンド１０がスリット板１２の下を通過すると、ＤＮＡバ
ンド１０から放出されたβ線がスリット１３を通ってβ
線検出ａ１４に入る。β線検出器１４よりの出力は信号
処理回路１５を通った後、計算機１６に入る。計算機１
６はデータ処理を行い、ＤＮＡバンド１０の分布すなわ
ち１部分塩基配列を決定する。ここで、計算機１６は計
測データをもとに、移動装置１１にフィードバックをか
け、最適の計測時間で計測を行っている。

また計測終了後も、特にデータ処理が困難な部分が存在
する場合には、その部分だけを複数回計測する。また、
最初にゲル８全体を高速で移動させた後、ＤＮＡバンド
１０の存在が予想される部分のみを低速で移動すること
も可能である。

この例では、β線検出器１４を固定し、ゲル８を移動さ
せているが、逆にゲル８を固定しβ線検出器を移動させ
る方法も考えられる。

第４図において、検出部の断面図は第２図とほぼ同様で
ある。また、標識体として放射性同位体の代りに銀染色
体を用いた場合の検出部の断面図は第３図とほぼ同様で
ある。

以上、ゲル電気泳動中の相補鎖ＤＮＡ断片を実時間に検
出し、ゲル電気泳動パターンを読み取る装置と、電気泳
動終了後のゲルを検出器にかけて、ゲル電気泳動パター
ンを読み取る装置の一例を説明したが、本発明を適用可
能な装置としてはミの他に、電気泳動終了後のゲル電気
泳動パターンをオートラジオグラム等によってフィルム
に転写し、デンシトメータやカメラ等によってゲル電気
泳動パターンを読み取る装置も考えられる。

第５図はゲル電気泳動パターンの正面図である。

ウェル９に供給された相補鎖ＤＮＡ断片はＤＮＡバンド
１９を形成しながらゲル８中を泳動し、β線検出器１４
の前を通過する。

第６図は第５図の塩基番号１〜９のＤＮＡバンド１９が
β線検出器１４の前を通過する際のβ線検出器の出力図
である。縦軸はβ線検出器の出力、横軸はＤＮＡバンド
がβ線検出器に到達する時間である。

第７図は第６図のβ線検出器出力に、平滑化処理とバッ
クグランド成分除去処理を行った結果である。この波形
の二次微分を求めれば、一点鎖線に示すように、ピーク
の位置を求めることができる。

第８図は、第７図の処理結果をもとに、ピーク分離を行
った結果である。この結果をもとに部分塩基配列を決定
する。塩基番号１，２，３，５゜６．７．９の位置には
、一つの泳動路にのみ、強度の高いピークがあられれて
おり、塩基名はそれぞれＡ、Ａ、Ａ、Ｇ、Ｇ、Ｃ，Ｇと
決定することができる。これに対し、塩基番号４の位置
には、Ａ泳動路とＧ泳動路に同程度の強度のピークがあ
る。

また、塩基番号８の位置には、非常に強度の低いピーク
しか存在しない。この為、塩基番号４の位置と８の位置
の塩基名の決定が困難である。

〔発明の実施例〕

以下、本発明の一実施例を図面により説明する。

第８図の結果をもとに、従来法と本発明によって１部分
塩基配列をコンピュータに登録した例をそれぞれ、第９
図と第１０図に示す。

従来法では、塩基番号４の位置には「Ａ又はＧ」を意味
する「Ｒ」を登録し、塩基番号８の位置には「Ａ又はＣ
又はＧ又はＴ」を意味する「−」を登録する。

これに対し本発明では、塩基番号４と８の位置には、各
泳動路毎に第８図の縦軸に示すピーク強度によって確か
らしさを数値化し登録する０例えば、塩基番号４の位置
のピーク強度は、Ａ泳動路が８．Ｃ泳動路が６、Ｃ泳動
路とＴ泳動路はＯであるから、確からしさはｒＡ：　ｓ
、ｃ：　Ｏ，Ｇ：６、Ｔ：ＯＪと登録する。塩基番号８
の位置も同様である。第１０図では参考の為、その他の
塩基番号の位置にも確らしさの数字を示した。第１０図
の「部分塩基配列Ｊは他の部分塩基配列との重複部の探
索を行う為のものであり、塩基番号４と８の位置には「
不明」を意味する「−」を登録する。なお、第１０図で
は、確からしさとしてピーク強度を登録したが、確から
しさの要素としてはこの他に、二次微分値、ピーク面積
、基準波形との合致度等又はこれらの組合わせが考えら
れる。

第９図と第１０図を比較してみると、第９図では例えば
、「塩基番号４の位置はＡがＧよりやや優位である」と
か「塩基番号８の位置はＣが最も優位で、Ａの可能性は
ほとんどない」といった情報が欠落している。

第５図の部分ＤＮＡ断片と由来が共通な別の部分ＤＮＡ
断片について同様にして部分塩基配列を決定し、従来法
と本発明によってコンピュータに登録した例を、それぞ
れ第１１図と第１２図に示す。

従来法によって、第９図と第１１図の部分塩基配列から
全塩基配列を決定した例を第１３図に示す。塩基番号４
の部分については、２つの部分塩基配列とも、塩基名が
ｒＲ（Ａ又はＧ）Ｊとなっているので、全塩基配列もｒ
ＲＪのままである。

また、塩基番号８の部分については、ｒ−（Ａ又はＣ又
はＧ又はＴ）ＪとｒＪ　（Ａ又はＣ）」の共通部分をと
って、全塩基配列はｒＪＪとなる。このように従来法で
は、全塩基配列を決定できない場合がある。

本発明によって、第１０図と第１２図の部分塩基配列か
ら全塩基配列を決定した例を第１４図に示す。第１４図
の確からしさは、第１０図と第１２図の確からしさの合
計になっている。

塩基番号４の部分については、２つの部分塩基配列の確
からしさの合計が、Ａは１４．Ｇは８であるから、Ａの
方が優位であり、全塩基配列はｒＡＪと決定することが
できる。また、塩基番号８の部分については、確からし
さの合計が、Ａは２、Ｃは７．Ｇは１．Ｔは２であるか
ら、全塩基配列はＣと決定することができる。このよう
に不明によれば、全塩基配列を全て決定することができ
る。

〔発明の効果〕

本発明によれば、従来法よりも情報量の多い部分塩基配
列の登録ができるので、高精度に全塩基配列を決定する
ことができる効果がある。

【図面の簡単な説明】

第１図はゲル電気泳動中のＤＮＡ断片を実時間に読み取
る装置の斜視図、第２図と第３図は検出部の縦断面図、
第４図は電気泳動終了後のゲル電気泳動パターンを読み
取る装置の斜視図、第５図はゲル電気泳動パターンの正
面図、第６図はβ線検出器の出力図、第７図と第８図は
β線検出器の出力の処理結果図、第９図、第１０図、第
１１図。第１２図、第１３図及び第１４図は塩基配列の登録図で
ある。１．２・・・緩衝液槽、５・・・直流高圧電源、６，７
・・・泳動板、８・・・ゲル、９・・・ウェル、１０・
・・ＤＮＡバンド、１３・・・スリット、１４・・・β
線検出器、１５・・・信号処理回路、１６・・計算機。　　　　　　′−ゝ、　　　１

Claims

【特許請求の範囲】

１、塩基配列を決定したいＤＮＡ断片を複数のＤＮＡ断
片に切断し、該切断済ＤＮＡ断片についてそれぞれ塩基
配列を決定し、該決定済塩基配列の重複部を探索し、該
切断前ＤＮＡ断片の塩基配列を決定するＤＮＡ塩基配列
決定方法において、該切断済ＤＮＡ断片の塩基配列の４
種類の塩基毎の確からしさを数値化し重みづけを行い、
複数の該切断済ＤＮＡ断片の塩基配列の該重みの合計値
によつて、重複部の塩基配列を決定し、該塩基配列を決
定したいＤＮＡ断片の塩基配列を決定することを特徴と
するＤＮＡ塩基配列決定方法。