JPS6227661A - 高速液体クロマトグラフ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）産業上の利用分野 この発明は高速液体クロマトグラフに関し、特に試料導
入部が、試料を注入し試料中の被検体を吸着した試料管
を着脱可能に挿着しうるよう構成された高速液体クロマ
トグラフに関する。

（ロ）従来の技術 最近、高速液体クロマトグラフは、化学工業、医化学な
どの分野での微量成分の分離分析にますます重要度が増
大している。

一般に高速液体クロマトグラフによる微量成分の分析は
、まず試料から被検体を抽出し、得られた抽出液を加熱
などして濃縮した後、液体クロマトグラフに注入して行
われる。しかしこの場合、濃縮工程を要するので時間と
手数がかがり、また濃縮工程で被検体が分解する場合が
ある。そして試料を液体クロマトグラフに注入する場合
、ループインジェクターが広く用いられているが、この
場合そのインジェクター内に試料が残るという問題点が
ある。

試料導入時の上記問題点を改善するものとして、少量の
高速液体クロマトグラフ充填剤を充填した前処理管が知
られている（例えばウォーターズ社製造５ＥＰ−ＰＡＫ
　　ＯＤ８など）。これは、試料を直接前処理管に注入
し次いで被検体以外の成分を溶出させた後に被検体を溶
出させ、この被検体溶出液の一部を高速液体クロマトグ
ラフに注入して分析するのに用いられる。この場合、前
処理管によって一旦濃縮分離された被検体が溶出によっ
て稀釈されてしまうので、良好な感度で分析するには前
記溶出液を再び濃縮する必要があり、手数がかかるだけ
でなく、濃縮工程で被検体が分解するという不利な点が
ある。

（ハ）発明が解決しようとする問題点 この発明は上記問題点を改善するためになされたもので
あって、試料の濃縮を行うことなくしかも簡便に、高濃
度で被検体を分離分析しうる高速液体クロマトグラフを
提供するものである。

（ニ）問題点を解決するための手段及び作用かくして、
この発明によれば、移動相供給部、試料導入部、分離カ
ラム及び検出部を順に導管で連結してなる高速液体クロ
マトグラフにおいて、試料導入部が、吸着材が充填もし
くは固定され、これに試料中の被検体を吸着させた試料
管を着脱可能に挿着した試料管保持器と、四方以上の切
換えバルブとからなり、前記バルブは移動相供給部と分
離カラムとを直接連結するとともに切換えによって移動
相供給部、試料管保持器及び分離カラムを連結し、試料
管を実質的に移動相供給部と分離カラムとの間に直列接
続するよう構成されてなる高速液体クロマトグラフが提
供される。

この発明のクロマトグラフは、次のようにして操作され
る。すなわち、試料を注入した後に被検体以外の成分を
除去するために適当な溶剤を通過させて被検体以外の成
分を除去しておいてから、試料管が試料管保持器に挿着
されるか、又は試料を注入したままの試料管が挿着され
る。次に四方以上のバルブによって移動相供給部と分離
カラムとを直結しておいて移動相を分離カラムと検出器
を通過させて定常状態としておく。次いでバルブの切換
えによって移動相供給部と分離カラムとの間に前記試料
保持器を接続して移動相を試料管を通過させて被検体を
試料管から溶出させ、分離カラムで分離し、検出器で検
出分析する。

上記のようにこの発明のクロマトグラフは高濃度で被検
体を分析することができ、微量の被検体を高感度で分析
するのに好適である。

〈ホ）実施例 この発明を第１図に示すこの発明の実施例によって説明
するがこの発明を限定するものではない。

第１図の高速液体クロマトグラフは、移動相供給部（１
）、試料管保持器（２）、分離カラム（３）及び検出器
（４）で構成されている。また試料管保持器（２）は、
試料管容器（５）、四方バルブ（６）、移動相導入管（
力及び移動相放出管（８）とで構成されている。また＋
９）と（［））は導管である。そして試料管容器（５）
において、（１１１は空気だめＱ付きキャップ、（１３
＋は柱状容器、（１４＋は吸着材（１５）を充填し、テ
フロンやステンレスなどのフリット（１６，１６′）を
はめた試料管、（＋７１はほぼ中央部に通孔を設けたテ
フロン板、［１８）はスプリングである。キャップ（１
υは気密状態で柱状容器ｆ１３）に取付けられる。また
試料管区）はスプリング０８）によってテフロン板側に
対して気密状態で圧着され、移動相放出管（８１と試料
管（１４）が連結されている。

試料管としては被検体を吸着する吸着材（例えばシリカ
ゲルもしくは化学的に修飾したシリカゲル）を充填する
か、試料管内壁面をエツチングして被検体を吸着する液
相を塗布するか又は内壁面に化学結合させた吸着材固定
相を設けたものが用いられる。吸着材は被検体によって
適切なものが選択される。

この試料管には次のようにして原料を注入する。

試料管の両端に前記のフリットをはめて一端から注射器
などで注入するとか、一端から吸引しながら他端から注
入するとかして行われる。一方試料管の一端にフリット
をはめておいて他端から注射器などで注入するとか、フ
リットをはめた一端から吸収しながら他端から試料を注
入した後にフリットのはめてない一端にフリットをはめ
てもよい。

上記のようにして試料を注入した試料管は、吸着材に吸
着された被検体以外の成分を溶出する溶媒を注入通過さ
せて被検体以外の成分を大部分除去してから試料管保持
器に挿着される。なお、このような前処理を行わずに試
料を注入したままの試料管を試料管保持器に挿着しても
よい。

試料管の大きさは、内径が０．０５〜４ｍｍで長さが５
〜４０ｍｍ程度のものが用いられる。試料管の大きさは
分離カラムの大きさによって適切なものが選択され、試
料管の内容積は分離カラム内容積の０．１〜２０％程度
のものが用いられ、例えば一般に用いられる分離カラム
（８ｍｍ内径Ｘ５０ｍｍ長）の場合、試料管としては内
容積が分離カラム容積の１％の４ｍｍ内径Ｘ２０ｍｍ長
のものを用いることができる。　また粘稠な液体もしく
は固体を直接分離分析する場合には、吸着材の入ってい
ないステンレスなどのバイブの試料管にマイクロスパチ
ュラなどで上記試料を注入して分析することができる。

このクロマトグラフは次のように操作される。

まず、被検体を吸着させた試料管（１４）を柱状容器（
１３ｊ内に入れ、スプリング０８）でおさえてテフロン
板０７）に圧着しながらキャップｆｌｌｌをとりつける
。

四方バルブ（６）を実線流路のように固定しておいて移
動相供給部（１）から移動相を送り、導管（９）、四方
バルブ（６）、ＩＪ管（１０１、分離カラム（３）及び
検出器（４）を通過させて定常状態にしておく。次いで
四方バルブ（６）を切換えて点線流路にし、移動相を移
動相導入管（力を経由して試料管容器（５）内に注入さ
れる。

移動相は柱状容器０３）と試料管例）との間隙にたまり
、次いで試料管区）の開放端■から試料管内に流入し、
吸着材に吸着された被検体を脱着して移動相放出管（８
）、四方バルブ（６）及び導管□□□を経由して分離カ
ラム（３）と検出器（４）に送られ分離分析される。

上記クロマトグラフは、従来の技術と異なり被検体を高
濃度で分離分析するので特に微量被検体を高感度で分析
することができ、しかも濃縮という手数がかかり被検体
の分解をまねく操作を要しない。

なお、上記クロマトグラフにおいて、移動相導入管（７
）を柱状容器（１３］の底壁に、一方移動相放出管（８
）を柱状容器（１３１の側壁に、第１図と逆に取付けて
もよい。この場合移動相は試料管（１４）の下端から入
って被検体を吸着材から脱着しながら開放端■からオー
バーフローして容器（１３）と試料管（１４１との間隙
にたまり、次いで柱状容器０３）の側壁を経由して四方
バルブ（６）、分離カラム（３）へと送られ、試料管保
持器（２）内の移動相の流れは第１図に矢印で示したの
とは逆方向になる。したがって分離カラム（３）へ送る
移動相中の被検体濃度をできるだけ高く保持するために
容器０３）と試料管（１４）との間隙はできるだけ小さ
くするのが好ましい。

ざらに上記の試料管容器（５）の代りに、次のようなも
のを用いたクロマトグラフが考えられる。

すなわち柱状形態で、複数の試料管を挿着するための通
孔をその柱軸に平行で柱軸がら等距離に具備し、かつ柱
軸まわりに回転可能な試料管容器である。そして移動相
導入管と移動相放出管それぞれの固定された一端を上記
試料管容器中のひとつの試料管の両端に圧着させて移動
相を通過させて被検体を分離分析する。次いでこの試料
管容器を柱軸まわりに回転させて、順次各試料管の被検
体を分離分析するものである。

次に微量のアクチノマイシン（約０．２μｇ／１１）含
有の血清を、前記第１図のクロマトグラフで分離分析し
く実験例）、一方、同じ試料をウォーターズ社’ＡＳＥ
Ｐ−ＰＡＫ　　０ＤＳｒ前処理Ｌ　タＩ、ループインジ
ェクタ一式試料導入部を有する通常の高速液体クロマト
グラフで分析した（比較実験例）を説明する。

実験例 アクヂノマイシン含有血清２５０貸を、粒径３ｏ〜５０
虐のＯＤＳを充填の試料管（２ｍｍ内径Ｘ２ａｍｍ長、
ステンレス製）にマイクロシリンジで注入し、次いで２
０％Ｖ／Ｖメタノール＋８０％ｖ　／ｖｏ、１Ｍリン酸
緩衝液を（０，５ｖ／＞通過させ、ざらに４０％Ｖ／Ｖ
メタノール＋６０％ｖ　／ｖＯ，１Ｍリン酸緩衝液（０
，５ｚｆ）を同様にして通過させて血清中のアクチノマ
イシン以外の成分を大部分溶出させた。次いで試料管内
にメタノールを充満させた。この試料管を第１図に示す
試料管容器内に挿着し、下記条件で分析した。

移動相　８５％メタノール １５％０．１Ｍリン酸緩衝液 （０，１５ＭＮａ　ＣＱ金含有 （流量０．４ｉｆ／１ｎ　） 分離カラム　Ａｓａｈｉ−ｐａｋ　　ＧＳ　−３２０（
室温） 検出器　島津紫外検出器（ＳＰＤ−２ＡＳ）その結果高
感度でアクチノマイシンを分析することができた。

比較実験例 上記実験例と同じ試料のアクチノマイシン含有血清１１
！を、ウォーターズ社製Ｓ［ＥＰ−ＰＡＫＯＤＳに注入
し、次いで２０％Ｖ／Ｖメタノール＋８０％ｖ　／ｖｏ
、１Ｍリン酸緩衝溶液を通過させさらに４０％ｖ／ｖメ
タノール＋６０％Ｖ／Ｖリン酸緩衝液を通過させた。次
いでメタノール２１！を通過させてアクチノマイシンを
溶出させた。溶出液の１００Ａを試料導入部が通常のル
ープインジェクタ一方式であること以外、前記実験例と
同じ条件で分析した。その結果、前記実験例と比べてブ
ロードで小さなピークしか得られなかった。また別個に
２１！のメタノールで溶出した仝吊を凍結乾燥し、０　
、２　ｉ１メタノールに溶解し、これを上記と同様にし
て分析したがアクチノマイシンの明確なピークが得られ
なかった。アクチノマイシンが分解したものと考えられ
る。

（へ）発明の効果 この発明の高速液体クロマトグラフによれば、特に濃縮
工程によって分解しやすい微量成分を濃縮することなし
にしかも高濃度で（換言すれば高感度で）、簡便に分難
分析することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明の一実施例の高速液体クロマトグラフ
の一部断面図構成説明図である。 （１）・・・・・・移動相供給部、（２・・・・・・試
料管保持器、（３）・・・・・・分離カラム、　　（４
）・・・・・・検出器、（５）・・・・・・試料管容器
、　　（６）・・・・・・四方バルブ、（刀・・・・・
・移動相導入管、　（８）・・・・・・移動相放出管、
ｆ９）　００１・・・・・・導管、　　　　（１１）・
・・・・・キャップ、０３・・・・・・柱状容器、　　
　（１４）・・・・・・試料管。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、移動相供給部、試料導入部、分離カラム及び検出部
   を順に導管で連結してなる高速液体クロマトグラフにお
   いて、 試料導入部が、吸着材が充填もしくは固定され、これに
   試料中の被検体を吸着させた試料管を着脱可能に挿着し
   た試料管保持器と、四方以上の切換えバルブとからなり
   、前記バルブは移動相供給部と分離カラムとを直接連結
   するとともに切換えによって移動相供給部、試料管保持
   器及び分離カラムを連結し、試料管を実質的に移動相供
   給部と分離カラムとの間に直列接続するよう構成されて
   なる高速液体クロマトグラフ。 ２、試料管保持器が、キャップが気密状態で着脱可能に
   取付けられた柱状容器で、そのなかに試料管が挿入され
   、試料管のキャップ側に位置する一端を開放状態でおさ
   えて他端を柱状容器のキャップ側と反対方向の底壁に気
   密状態で圧着させて保持する試料管容器と、柱状容器の
   側壁を貫通して連結される移動相導入管と、柱状容器の
   底壁を貫通して実質的に試料管内にのみ通じるよう連結
   される移動相放出管とからなり、これらの導入管及び放
   出管の他端が四方以上のバルブの２つのポートにそれぞ
   れ連結されてなる特許請求の範囲第１項に記載の高速液
   体クロマトグラフ。