JPS6225996A - Production of riboflavin - Google Patents

Production of riboflavin

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JPS6225996A
JPS6225996A JP16726085A JP16726085A JPS6225996A JP S6225996 A JPS6225996 A JP S6225996A JP 16726085 A JP16726085 A JP 16726085A JP 16726085 A JP16726085 A JP 16726085A JP S6225996 A JPS6225996 A JP S6225996A
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riboflavin
purine
strain
demanding
medium
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JP16726085A
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Akikazu Matsuyama
彰収 松山
Kimitoshi Kawai
河合 公利
Sadao Kageyama
蔭山 貞夫
Shoichi Takao
彰一 高尾
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Daicel Corp
Original Assignee
Daicel Chemical Industries Ltd
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  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

PURPOSE:To obtain in high productivity riboflavin without adding an expensive demanding substance to a medium, by cultivating a purine demanding reverse variant belonging to the genus Saccharomyces, derived from a purine demanding mold capable of producing riboflavin. CONSTITUTION:A purine demanding reverse variant (variant having lost purine demanding properties) belonging to the genus Saccharomyces, derived from a purine demanding mold capable of producing riboflavin, is cultivated in a medium, riboflavin is formed, accumulated and collected. Saccharomyces cerevisiae TR-29 (FERM P-782) may be cited as the preferable strain. This strain is derived by a conventional proceduere by NTG treatment of purine demanding 3-amino-1,2-4-triazole resistant strain TP-1010 (FERM BP-565) as a parent strain.

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は醗酵法によるリボフラビンの製造法に関するも
のである。更に詳しくはサツカロミセス属に属し、プリ
ン要求性を有するリボフラビン生産菌から誘導したプリ
ン要求性を失った変異株(プリン要求性復帰変異株と表
記する)を培地中で培養して生成・蓄積したリボフラビ
ンを採取するリボフラビンの製造法に関するものである
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [Industrial Field of Application] The present invention relates to a method for producing riboflavin by fermentation. More specifically, riboflavin is produced and accumulated by culturing in a medium a mutant strain that has lost purine auxotrophy (referred to as a purine auxotrophic revertant strain) derived from a riboflavin-producing bacterium that belongs to the genus Satucharomyces and has purine auxotrophy. The present invention relates to a method for producing riboflavin that involves the collection of riboflavin.

この方法により酢酸を炭素源とした醗酵法でリボフラビ
ンを効率よく製造することができる。
With this method, riboflavin can be efficiently produced by fermentation using acetic acid as a carbon source.

リボフラビンは医薬、飼料添加剤、食品用の着色剤など
として有用な物質である。
Riboflavin is a substance useful as a medicine, feed additive, food coloring agent, etc.

〔従来の技術〕[Conventional technology]

醗酵法によるリボフラビンの製造法として、エレモテシ
ウム・アシビイ(Eremothecium ashb
yii)、アシビア・ゴソシピイ(Ashbya go
ssypii) 、キャンディダ・フラレリイ(Can
dida flareri)、又はクロストリジウム・
アセトブチリカム(Clostridium acet
obutylicum)等を糖質培地中で培養して培養
液中にリボフラビンを生成・蓄積せしめる方法が知られ
ている(プログレス・インダストリアル・ミクロバイオ
ロジー1巻139頁、1959)。
As a method for producing riboflavin by fermentation, Eremothecium ashb
yii), Ashbya go
ssypii), Candida Fralerii (Can
dida flareri), or Clostridium
Clostridium acet
A method is known in which riboflavin is produced and accumulated in the culture solution by culturing A. obtylicum) in a carbohydrate medium (Progress Industrial Microbiology Vol. 1, p. 139, 1959).

本発明者の一部は酢酸を炭素源とする醗酵法によるリボ
フラビンの製造法を報告している〔アグリ力ルチャル・
アンド・バイオロジカル・ケミストリー(Agr、 B
iol、 Chem、) vol、 28+  p。
Some of the present inventors have reported a method for producing riboflavin by a fermentation method using acetic acid as a carbon source [Agricultural
and Biological Chemistry (Agr, B
iol, Chem,) vol, 28+ p.

559、 p、566+ p、765(1964) )
559, p, 566+ p, 765 (1964))
.

又、変異株を用いる方法としては、本発明者らによるサ
ツカロミセス属に属するプリン要求性変異株を用いる方
法(特願昭59−99096号)、サツカロミセス属に
属する3−アミノ−1,2,4−)リアゾールに耐性を
有する変異株を用いる方法(特願昭5 !199097
号)が知られている。
Further, as a method using a mutant strain, a method using a purine auxotrophic mutant strain belonging to the genus Satucharomyces by the present inventors (Japanese Patent Application No. 59-99096), 3-amino-1,2,4 -) Method using a mutant strain resistant to lyazole (Patent application 1990!199097)
No.) is known.

尚、上記文献においては微生物の名称としてキャンディ
ダ・ロブスタ(Candida robusta)が用
いられているが、その後キャンディダ・ロブスタの標準
株(タイプストレイン)において胞子が見出されている
ため、ロダー著「ザ・イーストJ 1970年版におい
ては、キャンディダ・ロブスタはサツカロミセス・セレ
ビシェ(Saccha−romyces cerevi
siae)に再分類されている。
In addition, in the above literature, Candida robusta is used as the name of the microorganism, but since spores have since been found in the type strain of Candida robusta, In the 1970 edition of The East J, Candida robusta is referred to as Saccha-romyces cerevisiae.
siae).

しかし上記文献で用いられた菌株については胞子形成は
認められていないため、サツカロミセス・セレビシェの
無胞子型であると考えられ、本明細書においては、これ
をサツカロミセス・セレビシェ(キャンディダ・ロブス
タ)と記載する。
However, since spore formation has not been observed in the strain used in the above literature, it is considered to be a non-spore type of Satucharomyces cerevisiae, and in this specification, it is referred to as Satucharomyces cerevisiae (Candida robusta). Describe it.

〔発明が解決しようとする問題点〕[Problem that the invention seeks to solve]

上記のような菌が知られているものの、醗酵法によるリ
ボフラビンの製造を工業的に実施するために解決すべき
課題はまだ多く、リボフラビンの蓄積濃度及び生産速度
の高い菌を得ることは勿論のこと、従来知られている栄
養要求性菌を用いる場合は、培地に高価な要求物質を加
える必要があり、その要求物質の量を減らすか、或いは
なくすことも工業的に非常に重要である。
Although the above-mentioned bacteria are known, there are still many problems to be solved in order to industrially produce riboflavin by fermentation, and it is of course difficult to obtain bacteria that can accumulate and produce riboflavin at a high concentration. In particular, when conventionally known auxotrophic bacteria are used, it is necessary to add expensive required substances to the culture medium, and reducing or eliminating the amount of the required substances is of great industrial importance.

本発明はこのような視点のもとに、リボフラビン生産性
が高い菌株を得て、これを用いたリボフラビンの新製造
法を提供することを目的とする。
Based on this viewpoint, the present invention aims to obtain a bacterial strain with high riboflavin productivity and to provide a new method for producing riboflavin using this strain.

〔問題点を解決するための手段〕[Means for solving problems]

本発明者らは醗酵法によるリボフラビンの製造法を改良
すべく鋭意検討した結果、サツカロミセス属に属しプリ
ン要求性を有するリボフラビン生産菌のプリン要求性復
帰変異株を誘導したところ、高価な要求物質を培地に加
える必要がなくなった上にリボフラビン生産能が向上す
ることを認め、本発明を完成するに至った。
As a result of intensive studies aimed at improving the method for producing riboflavin by fermentation, the present inventors derived a purine-auxotrophic revertant strain of a riboflavin-producing bacterium belonging to the genus Satucharomyces and having purine-auxotrophic properties. The present invention was completed based on the recognition that riboflavin production ability was improved in addition to eliminating the need to add riboflavin to the culture medium.

即ち本発明は、サツカロミセス属に属し、プリン要求性
を有するリボフラビン生産菌から誘導したプリン要求性
復帰変異株を培地中で培養してリボフラビンを生成・蓄
積せしめこれを採取することを特徴とするりポフラビン
の製造法である。
That is, the present invention is characterized in that a purine auxotrophic revertant strain derived from a riboflavin-producing bacterium belonging to the genus Satucharomyces and having purine auxotrophy is cultured in a medium to produce and accumulate riboflavin, and then collected. This is a method for producing poflavin.

(使用する微生物〕 本発明で使用する微生物はサツカロミセス属に属し、プ
リン要求性を有するリボフラビン生産菌から誘導したプ
リン要求性復帰変異株であれば何れも用いることができ
る。
(Microorganism used) The microorganism used in the present invention belongs to the genus Satucharomyces, and any purine auxotrophic revertant strain derived from a riboflavin-producing bacterium having purine auxotrophy can be used.

好適な具体例としてサツカロミセス・セレビシェ(Sa
ccharomyces cerevisiae)TR
−29(微工研条寄第782号)が挙げられる。この変
異株はプリン要求性、3−アミノ−1,2゜4−トリア
ゾール耐性株TP−1010(FERM BP−565
)を親株としてNTG処理によって常法により誘導され
たプリン要求性復帰、3−アミノ−1゜2.4−)リア
ゾール耐性変異株であり、プリン要求性が復帰している
点で親株であるTP−1010とは明らかに区別するこ
とができる。
A preferred specific example is Satucharomyces cerevisiae (Sa
ccharomyces cerevisiae) TR
-29 (Feikoken Jokyo No. 782). This mutant strain is purine auxotrophic, 3-amino-1,2゜4-triazole resistant strain TP-1010 (FERM BP-565
) is a 3-amino-1゜2.4-) lyazole-resistant mutant strain induced by NTG treatment in a conventional manner using the parent strain TP. -1010 can be clearly distinguished.

(菌株の取得法) 本発明で使用する菌株はサツカロミセス属に属し、プリ
ン要求性を有するリボフラビン生産菌を親株として通常
の変異誘導処理法を適用することによって比較的容易に
取得できる。
(Method for Obtaining a Bacterial Strain) The bacterial strain used in the present invention belongs to the genus Satucharomyces, and can be obtained relatively easily by using a riboflavin-producing bacterium with purine auxotrophy as a parent strain and applying a conventional mutation induction treatment method.

例えば親株として3−アミノ−1,2,4−トリアゾー
ル耐性、プリン要求性株であるサツカロミセス・セレビ
シェTP−1010を用い、紫外線照射或いはNTG等
の薬剤で処理後、第1表に示すプリン類を含まない最小
寒天培地に塗抹し、生育してきたコロニーをプリン要求
性復帰、3−アミノ−L2,4− )リアゾール耐性株
として選択する。
For example, using Satucharomyces cerevisiae TP-1010, a 3-amino-1,2,4-triazole-resistant, purine-requiring strain, as a parent strain, after treatment with ultraviolet irradiation or a drug such as NTG, the purines listed in Table 1 were produced. The colonies that grow are selected as purine auxotrophic, 3-amino-L2,4-) lyazole-resistant strains.

第1表  最小培地組成 得られた変異株のプリン要求性復帰を確認するため、生
育度実験を以下の如く行った。
Table 1 Minimal medium composition In order to confirm the reversion of purine auxotrophy of the obtained mutant strain, a growth experiment was conducted as follows.

親株のサツカロミセス・セレビシェTP−1010とこ
れから誘導したプリン要求性復帰変異株、サツカロミセ
ス・セレビシェTR−29を第1表に示す培地とそれに
アデニンを0.1%添加した培地にそれぞれ塗抹し、3
0℃にて一週間培養し、生育を観察した。結果を第2表
に示す。
The parent strain Satucharomyces cerevisiae TP-1010 and the purine auxotrophic revertant strain Satucharomyces cerevisiae TR-29 derived from it were plated on the medium shown in Table 1 and the medium to which 0.1% adenine was added.
The cells were cultured at 0°C for one week, and growth was observed. The results are shown in Table 2.

第2表 +:充分な生育 m:生育せず 第2表に示すようにサツカロミセス・セレビシェTR−
29は明らかにプリン要求性がなくなって(復帰して)
いることが確認された。
Table 2+: Sufficient growth m: No growth As shown in Table 2, Satucharomyces cerevisiae TR-
29 has obviously lost his pudding-requiring nature (and has returned).
It was confirmed that there is.

(培養方法) 本発明で使用する微生物を培養する方法を説明する。炭
素源としては酢酸、グルコン酸等の有機酸、グルコース
、シュークロース、キシロース等の糖質、エタノール、
グリセリン等のアルコール類その他が使用できる。
(Culture method) A method for culturing the microorganism used in the present invention will be explained. Carbon sources include organic acids such as acetic acid and gluconic acid, carbohydrates such as glucose, sucrose, and xylose, ethanol,
Alcohols such as glycerin and others can be used.

窒素源としては種々の形態の窒素化合物が使用でき、例
えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、炭酸アンモ
ニウム、尿素、アミノ酸、ポリペプトン等を用いること
ができる。
Various forms of nitrogen compounds can be used as the nitrogen source, such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium carbonate, urea, amino acids, polypeptone, and the like.

また炭素源、窒素源の他にリン酸第1カリウム、硫酸マ
グネシウム等の無機塩類を使用することが好ましい。ま
た必要に応じビオチン等のビタミン類、アミノ酸、核酸
塩基などの微量栄養素を添加すればリボフラビンの蓄積
量を増す場合が多い。本発明者が先に発明した亜鉛イオ
ンを添加してリボフラビン生産性を向上させ鉄イオンに
よる阻害を防ぐ改良製法(特願昭58−165245号
)を適用することも出来る。
In addition to the carbon source and nitrogen source, it is preferable to use inorganic salts such as potassium phosphate and magnesium sulfate. Furthermore, if necessary, the amount of accumulated riboflavin can be increased in many cases by adding micronutrients such as vitamins such as biotin, amino acids, and nucleobases. It is also possible to apply an improved manufacturing method (Japanese Patent Application No. 165245/1983) which was previously invented by the present inventor and which improves riboflavin productivity by adding zinc ions to prevent inhibition by iron ions.

培養には好気的条件が好ましい。培地のpHは2乃至1
0とするが、6乃至9に調節すれば最も好ましい結果が
得られる。温度は20℃乃至37℃の範囲のうち使用菌
株の生育及びリボフラビン生産性に適した温度を用いる
ことができる。
Aerobic conditions are preferred for culturing. The pH of the medium is between 2 and 1.
The value is set to 0, but the most preferable results can be obtained by adjusting it to 6 to 9. A temperature suitable for the growth of the strain used and riboflavin productivity can be used within the range of 20°C to 37°C.

このようにして得られる培養液からのリボフラビンの採
取には公知の手法が適用できる。
Known techniques can be applied to collect riboflavin from the culture fluid thus obtained.

即ち培養液を60℃〜120℃に加熱しリボフラビンを
溶解させたのち、遠心分離により酵母菌体と濾液に分離
し、濾液を必要に応じ濃縮したのちハイドロサルファイ
ド或いは三塩化チタンにより還元しリボフラビンを沈降
させる。このようにして得られたリボフラビンを空気中
で酸化させたのち、水、酢酸水溶液等の溶媒を用いて再
結晶を行い、精製することが可能である。
That is, the culture solution is heated to 60°C to 120°C to dissolve riboflavin, and then centrifuged to separate yeast cells and filtrate. The filtrate is concentrated as necessary, and then reduced with hydrosulfide or titanium trichloride to dissolve riboflavin. Let it settle. After the riboflavin thus obtained is oxidized in the air, it can be purified by recrystallization using a solvent such as water or an acetic acid aqueous solution.

さらには本発明者らによるリボフラビンの取得法(特願
昭59−143953号)を用いて高純度のリボフラビ
ン結晶を採取することが可能である。
Furthermore, it is possible to collect highly pure riboflavin crystals using the method for obtaining riboflavin proposed by the present inventors (Japanese Patent Application No. 143953/1982).

〔実 施 例〕〔Example〕

実施例1 サツカロミセス・セレビシェTl?−29及びその親株
であるサツカロミセス・セレビシェTP−1010をグ
ルコース2%、ポリペプトン0.5%、酵母エキス0.
3%、麦芽エキス0.3%を含む前培養培地100m1
に接種し、30℃で37時間振盪培養する。この前培養
液を第3表の醗酵培地に10%の植菌量で接種し、30
℃で10日間振盪培養した。
Example 1 Satucharomyces cerevisiae Tl? -29 and its parent strain Satucharomyces cerevisiae TP-1010 were mixed with 2% glucose, 0.5% polypeptone, and 0.0% yeast extract.
100 ml of preculture medium containing 3% malt extract and 0.3% malt extract.
and cultured with shaking at 30°C for 37 hours. This pre-culture solution was inoculated into the fermentation medium shown in Table 3 at a 10% inoculation amount, and 30
The cells were cultured with shaking at ℃ for 10 days.

培養液中に蓄積したリボフラビンの量は、親株であるサ
ツカロミセス・セレビシェTP−1010を用いた場合
には2.56g/ 12であったのに対し、サツカロミ
セス・セレビシェTR−29を用いた場合は培地組成に
要求物質であるプリン類が必要でなくなった上に、2.
79g/ j!に向上した。
The amount of riboflavin accumulated in the culture medium was 2.56 g/12 when using the parent strain Satucharomyces cerevisiae TP-1010, whereas when using Satucharomyces cerevisiae TR-29, the amount of riboflavin accumulated in the medium In addition to eliminating the need for purines, which are required substances in the composition, 2.
79g/j! improved.

実施例2 サツカロミセス・セレビシェTR−29を用い、第3表
に示す醗酵培地組成のうち、酢酸カルシウムを132g
/βに、硫酸アンモニウムを6 g/ j!にした他は
第3表と同じ組成の培地で実施例1と同様の方法で8日
間培養を行った。
Example 2 Using Satucharomyces cerevisiae TR-29, 132g of calcium acetate was added to the fermentation medium composition shown in Table 3.
/β, add 6 g/j of ammonium sulfate! Culture was carried out for 8 days in the same manner as in Example 1 using a medium having the same composition as shown in Table 3, except for the following.

その結果、培養液中に3.02g/ IIのリボフラビ
ンが蓄積した。
As a result, 3.02 g/II of riboflavin was accumulated in the culture solution.

第3表  醗酵培地組成 〔発明の効果〕 本発明により高価な要求物質を添加することなく、リボ
フラビンを生産速度も高く高濃度に製造することが出来
た。
Table 3 Fermentation medium composition [Effects of the invention] According to the present invention, riboflavin could be produced at a high production rate and at a high concentration without adding expensive required substances.

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] サッカロミセス(Saccharomyces)属に属
し、プリン要求性を有するリボフラビン生産菌から誘導
したプリン要求性復帰変異株を培地中で培養して、リボ
フラビンを生成・蓄積せしめこれを採取することを特徴
とするリボフラビンの製造方法。
A purine-auxotrophic revertant strain derived from a riboflavin-producing bacterium belonging to the genus Saccharomyces and having purine auxotrophy is cultured in a medium to produce and accumulate riboflavin, which is then collected. Production method.
JP16726085A 1985-07-29 1985-07-29 Production of riboflavin Granted JPS6225996A (en)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP16726085A JPS6225996A (en) 1985-07-29 1985-07-29 Production of riboflavin
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DE8686109783T DE3679465D1 (en) 1985-07-29 1986-07-16 METHOD FOR PRODUCING RIBOFLAVIN.
EP89111687A EP0341755B1 (en) 1985-07-29 1986-07-16 Process for preparation of riboflavin
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