JPS62248485A - プロテア−ゼの製造法 - Google Patents
プロテア−ゼの製造法Info
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- JPS62248485A JPS62248485A JP29298885A JP29298885A JPS62248485A JP S62248485 A JPS62248485 A JP S62248485A JP 29298885 A JP29298885 A JP 29298885A JP 29298885 A JP29298885 A JP 29298885A JP S62248485 A JPS62248485 A JP S62248485A
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Landscapes
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、プロテアーゼ生産能を有する糸状菌を用いて
高力価のプロテアーゼを効率良(製造する方法に関する
。
高力価のプロテアーゼを効率良(製造する方法に関する
。
プロテアーゼは蛋白質又はその部分加水分解物に作用し
てペプチド°結合を分解する卯水分解醪素であって、医
薬、醸造食品、洗剤等に広(利用されている。
てペプチド°結合を分解する卯水分解醪素であって、医
薬、醸造食品、洗剤等に広(利用されている。
従来、微生物によるグロテ了−ゼの生産に関する研究は
、プロテアーゼ生産能の高い微生物のスクリーニング法
もしくはその育種法に主眼がおかれていた。又培養条件
に関する研究も、その多(は培地の組成、特に培地に無
機塩を添加するもの(例えば特公昭10−コaiii号
公報等)や培地中の窒素源の種類(例えば特開昭j/−
96/♂O号公報等)、炭素源の種類(例えば特公昭!
−−lコ2り7号公報等)等に限られており、しかもこ
れらは何れも回分式製造法に限られていた。
、プロテアーゼ生産能の高い微生物のスクリーニング法
もしくはその育種法に主眼がおかれていた。又培養条件
に関する研究も、その多(は培地の組成、特に培地に無
機塩を添加するもの(例えば特公昭10−コaiii号
公報等)や培地中の窒素源の種類(例えば特開昭j/−
96/♂O号公報等)、炭素源の種類(例えば特公昭!
−−lコ2り7号公報等)等に限られており、しかもこ
れらは何れも回分式製造法に限られていた。
従来のプロテアーゼ製造に関する提案方法では。
何れも回分式製造法であったことに主として起因して、
プロテアーゼ産生期は菌体が増殖した後の定常期に限ら
れており、しかも定常期において培地中の炭素源、窒素
源を制卸することが著しく困難であったため、プロテア
ーゼの工業的採取期が短く、シかも得られるプロテアー
ゼカ価も比較的低いものであると言う問題点があった。
プロテアーゼ産生期は菌体が増殖した後の定常期に限ら
れており、しかも定常期において培地中の炭素源、窒素
源を制卸することが著しく困難であったため、プロテア
ーゼの工業的採取期が短く、シかも得られるプロテアー
ゼカ価も比較的低いものであると言う問題点があった。
本発明は−これら従来方性の問題点を解決するために成
されたものであって、高力価のプロテアーゼを効率良(
得る方法を提供することを目的とするものである。
されたものであって、高力価のプロテアーゼを効率良(
得る方法を提供することを目的とするものである。
即ち1本発明はプロテアーゼ生産能を有する糸状菌を液
体培地に培養してプロテアーゼを製造するに際し、増殖
末期以降におけろ培養液中の糖濃度を0.10%(W/
V)以下、窒素濃度を0.06%(W/V)以上となる
ように、蛋白質原料を含む液体培地を連続的もしくは断
続的に加えて培養することを特徴とするプロテアーゼの
製造法であるO 本発明に用いられるプロテアーゼ生産能を有する糸状菌
−−4は−例えばアスペルギルス属、ペニシリウム属、
ムコール属−リゾープス属等に属するプロテアーゼ生産
能を有する糸状菌であり。
体培地に培養してプロテアーゼを製造するに際し、増殖
末期以降におけろ培養液中の糖濃度を0.10%(W/
V)以下、窒素濃度を0.06%(W/V)以上となる
ように、蛋白質原料を含む液体培地を連続的もしくは断
続的に加えて培養することを特徴とするプロテアーゼの
製造法であるO 本発明に用いられるプロテアーゼ生産能を有する糸状菌
−−4は−例えばアスペルギルス属、ペニシリウム属、
ムコール属−リゾープス属等に属するプロテアーゼ生産
能を有する糸状菌であり。
その具体例としては−アスペルギルス・ソーヤIAMu
り03.アスペルギルス・ソーヤIAM2t3/、了ス
ペルギルス畳オリゼ−IAMコt09゜アスペルギルス
・オリゼ−[pQg/7+、アスペルギルス・タマリI
AM 2−/ z t 、ペニシリウム・クリンゲナ
ムHUT4totq、ペニシリウム・ルテウムAHTJ
1022.ムコール・ラセモサスAHUに002.ムコ
ール・ヒエマリスHU T/ / 3 /、 +J
7”−7’ス・フオルモサエンシスIPO14732、
リゾープス・ジャバニカスI FOs<t<t/等が挙
げられろ。
り03.アスペルギルス・ソーヤIAM2t3/、了ス
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ール・ヒエマリスHU T/ / 3 /、 +J
7”−7’ス・フオルモサエンシスIPO14732、
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げられろ。
なお1本発明においては、耐塩性のプロテアーゼ生産能
を有する糸状菌を用いれば、雑菌汚染を防止する意味で
有利である(耐塩性の目安としては食塩!%以上、好ま
しくは食塩10係以上である)。
を有する糸状菌を用いれば、雑菌汚染を防止する意味で
有利である(耐塩性の目安としては食塩!%以上、好ま
しくは食塩10係以上である)。
本発明において、蛋白質原料を含む液体培地を添加する
までの培養、即ち単に菌体を増殖するための培養を、以
下単に前培養と言う。
までの培養、即ち単に菌体を増殖するための培養を、以
下単に前培養と言う。
そして前層養に使用する培地としては、従来プロテアー
ゼ生産能を有する糸状菌の液体培養法において用いられ
る液体培地であれば何れを用いてもよい。即ち、培地の
炭素源としては1例えばグルコース−可溶性殿粉、シュ
クロース、デキスト1J7.ヤ、l10−ス、グリセリ
ン、皺等が、窒素源としては1例えばペプトン、肉エキ
ス、酵母!*ス、大豆粉、ヌカ、カゼイン、ポリペプト
ン、グルテン等が、無機塩としては1例えば各種リン酸
塩、硫醗塩、塩酸塩等が用いられ、さらに必要によりビ
タミン類、核酸等を適宜加えた液体培地が用いられる。
ゼ生産能を有する糸状菌の液体培養法において用いられ
る液体培地であれば何れを用いてもよい。即ち、培地の
炭素源としては1例えばグルコース−可溶性殿粉、シュ
クロース、デキスト1J7.ヤ、l10−ス、グリセリ
ン、皺等が、窒素源としては1例えばペプトン、肉エキ
ス、酵母!*ス、大豆粉、ヌカ、カゼイン、ポリペプト
ン、グルテン等が、無機塩としては1例えば各種リン酸
塩、硫醗塩、塩酸塩等が用いられ、さらに必要によりビ
タミン類、核酸等を適宜加えた液体培地が用いられる。
前記した液体培地に、プロテアーゼ生産能を有する糸状
菌菌体を接種した後、液体培養する。このときの培蕃温
度、培地のpH%通気量などの培養条件は使用する菌株
、培地組成などによって変わるが2通常培養源度はコ!
〜4to’C,培地のpHは3〜♂1通気量は0./〜
J V、V、M程度である。
菌菌体を接種した後、液体培養する。このときの培蕃温
度、培地のpH%通気量などの培養条件は使用する菌株
、培地組成などによって変わるが2通常培養源度はコ!
〜4to’C,培地のpHは3〜♂1通気量は0./〜
J V、V、M程度である。
か(して、培養初期の誘導期を経て、増殖期に移行する
と、菌体は著しく増殖する。通常、f@養開始後/−’
1日程度で増殖は止まり一増殖末期以降はほぼ定常期に
移行する。
と、菌体は著しく増殖する。通常、f@養開始後/−’
1日程度で増殖は止まり一増殖末期以降はほぼ定常期に
移行する。
本発明においては、増殖末期以降、即ち増殖末期から主
として始まる酵素産生期に、液中の糖濃度が0.10係
(W/V)以下、好ましくはo、or%(W7V)以下
、窒素arカo 、 o t % (W/V’)以上、
好マ1.<ハo 、 o t 〜o 、 3o% (
W/V)となるように、蛋白質原料を含む液体培地を連
続的もしくは断続的に添加する。
として始まる酵素産生期に、液中の糖濃度が0.10係
(W/V)以下、好ましくはo、or%(W7V)以下
、窒素arカo 、 o t % (W/V’)以上、
好マ1.<ハo 、 o t 〜o 、 3o% (
W/V)となるように、蛋白質原料を含む液体培地を連
続的もしくは断続的に添加する。
この蛋白質原料を含む液体培地に用いられる蛋白質原料
としては1例えば大豆、脱脂大豆−分離大豆蛋白、ミル
クカゼイン、卵アルブミン、牛血清アルブミン−小麦グ
ルテン、ペプトン、ソイトーン等の1種もしくは2種以
上のものが挙げられる。この蛋白質原料を含む液体培地
には、必要にヨリグルコース、シュクロース、ラクトー
ス、カラクトース、可溶性殿粉、デキストリン、セルロ
ース、小麦等の糖質原料、更に各種リン酸塩、硫酸塩、
塩酸塩等の無機塩類、ビタミン類、核酸等を加えてもよ
い。
としては1例えば大豆、脱脂大豆−分離大豆蛋白、ミル
クカゼイン、卵アルブミン、牛血清アルブミン−小麦グ
ルテン、ペプトン、ソイトーン等の1種もしくは2種以
上のものが挙げられる。この蛋白質原料を含む液体培地
には、必要にヨリグルコース、シュクロース、ラクトー
ス、カラクトース、可溶性殿粉、デキストリン、セルロ
ース、小麦等の糖質原料、更に各種リン酸塩、硫酸塩、
塩酸塩等の無機塩類、ビタミン類、核酸等を加えてもよ
い。
本発明において、増殖期末期以降の培養液に。
液中の糖濃度が0.10%(W/V)以下、窒素濃度が
0.01%(W/V)以上になるように蛋白質原料を含
む液体培地を添亦するのは2次の理由による。
0.01%(W/V)以上になるように蛋白質原料を含
む液体培地を添亦するのは2次の理由による。
先ず一増殖末期における培養液の糖濃度カ高いとプロテ
アーゼ生産抑制因子である糖類によりプロテアーゼの生
産が著しく抑制される。又1回分法においては、菌体の
増殖とともに微量生産されるプロテアーゼ−ペプチダー
ゼ等により培養初期に含まれるプロテアーゼ生産の誘導
物質である蛋白質が分解されてアミノ酸となるため、蛋
白質が殆どもしくは全(存在せず、プロテアーゼ生産の
誘導作用を受は難いため、増殖末期以降においては高活
性のプロテアーゼの生産は到底達放されないO そこで、プロテアーゼの生産を高めるには増殖末期以降
において一培養液中の糖濃度を低(して蛋白質原料を含
む液体培地を培養液に加えればよいわけであり−この点
に関し本発明者等は研究した結果、増殖末期以降の培養
液に、液中の糖濃度力0 、 / 0 % (W/V
) 以下、 窒素1jkgカ0.Ot%(W/V)以上
となるように蛋白質原料を含む液体培地を添加すればよ
いことを見い出したのである。
アーゼ生産抑制因子である糖類によりプロテアーゼの生
産が著しく抑制される。又1回分法においては、菌体の
増殖とともに微量生産されるプロテアーゼ−ペプチダー
ゼ等により培養初期に含まれるプロテアーゼ生産の誘導
物質である蛋白質が分解されてアミノ酸となるため、蛋
白質が殆どもしくは全(存在せず、プロテアーゼ生産の
誘導作用を受は難いため、増殖末期以降においては高活
性のプロテアーゼの生産は到底達放されないO そこで、プロテアーゼの生産を高めるには増殖末期以降
において一培養液中の糖濃度を低(して蛋白質原料を含
む液体培地を培養液に加えればよいわけであり−この点
に関し本発明者等は研究した結果、増殖末期以降の培養
液に、液中の糖濃度力0 、 / 0 % (W/V
) 以下、 窒素1jkgカ0.Ot%(W/V)以上
となるように蛋白質原料を含む液体培地を添加すればよ
いことを見い出したのである。
次に、増殖末期以降に、培養液中の糖濃度および窒素濃
度が上記のようになるように■白雪原料を含む液体培地
を添加する手段としては一壇地の組成、添加速度、添加
割合などの調整その他適宜の手段を選ぶことができるが
、その好ましい手段の7例を述べると次のとおりである
。
度が上記のようになるように■白雪原料を含む液体培地
を添加する手段としては一壇地の組成、添加速度、添加
割合などの調整その他適宜の手段を選ぶことができるが
、その好ましい手段の7例を述べると次のとおりである
。
先ず、糖源は糸状菌によって分解されて単糖類となり、
これがプロテアーゼ生産の抑制因子となるため、菌体自
身の炭素、窒素、およびリンの組成を考慮して培地中の
糖源の含有割合を蛋白質やリンに比べて低ぐする必要が
ある。そこで、増殖末期以降に培養液に添加する蛋白質
原料を含む液体培地の組成を決めるにあたっては、予め
この液体培地に使用するプロテアーゼ生産能を有する糸
状菌を実験的に培養し、糖源が完全に消費された時に残
存する窒素濃度が0.01%(W/V)以上、 好tL
<ハo 、 o t 〜o 、 J%(W/V)、!
:なるように糖源と蛋白質の配合比を決め、このように
配合比を決めた蛋白質原料を含む液体培地を上記した増
殖末期以降の培養液に糖濃度が0.10%(W/V)以
下、好ましくはo、ot係(W/V)以下となるように
添加すると、培養液中の窒素濃度は0.01%(W/V
)以上、好ましζはo、ot 〜o、3o%cW/V’
)の範囲に保持される。
これがプロテアーゼ生産の抑制因子となるため、菌体自
身の炭素、窒素、およびリンの組成を考慮して培地中の
糖源の含有割合を蛋白質やリンに比べて低ぐする必要が
ある。そこで、増殖末期以降に培養液に添加する蛋白質
原料を含む液体培地の組成を決めるにあたっては、予め
この液体培地に使用するプロテアーゼ生産能を有する糸
状菌を実験的に培養し、糖源が完全に消費された時に残
存する窒素濃度が0.01%(W/V)以上、 好tL
<ハo 、 o t 〜o 、 J%(W/V)、!
:なるように糖源と蛋白質の配合比を決め、このように
配合比を決めた蛋白質原料を含む液体培地を上記した増
殖末期以降の培養液に糖濃度が0.10%(W/V)以
下、好ましくはo、ot係(W/V)以下となるように
添加すると、培養液中の窒素濃度は0.01%(W/V
)以上、好ましζはo、ot 〜o、3o%cW/V’
)の範囲に保持される。
また、上記蛋白質原料を含む液体培地に糖を含ませてい
ない場合には、培養液中の窒素濃度がo、oに%(W/
V)以上、好ましくはθ、θぶ〜o 、 3o% (W
/V)の範囲となるように蛋白質原料を含む液体培地を
添加すればよい。
ない場合には、培養液中の窒素濃度がo、oに%(W/
V)以上、好ましくはθ、θぶ〜o 、 3o% (W
/V)の範囲となるように蛋白質原料を含む液体培地を
添加すればよい。
増殖末期以降の培養液への蛋白質原料を含む液体培地の
添加は連続的もしくは断続的に添加することができる。
添加は連続的もしくは断続的に添加することができる。
そして増殖末期以降に蛋白質原料を含む液体培地を添加
して行なう培養は、該液体培地を連続的に添加し培養液
を連続的に取り出して連続培養するか、または該液体培
地を断続的に添加し培養液を断続的に取り出すというよ
うに培養するか、または該液体培地を連続的もしくは断
続的に添加して流mf@sすることにより実施される。
して行なう培養は、該液体培地を連続的に添加し培養液
を連続的に取り出して連続培養するか、または該液体培
地を断続的に添加し培養液を断続的に取り出すというよ
うに培養するか、または該液体培地を連続的もしくは断
続的に添加して流mf@sすることにより実施される。
上記のいずれの培養を行なう場合でも、蛋白質原料を含
む液体培地の添加は培養中の糖濃度をo 、t o%c
W/V>以下、窒素濃度なo、ot4(W/V)以上と
なるようにして行なえばよい。
む液体培地の添加は培養中の糖濃度をo 、t o%c
W/V>以下、窒素濃度なo、ot4(W/V)以上と
なるようにして行なえばよい。
上記のようにする以外は、連続培養法、流部培養法は常
法に準じて行なうことができる。なお。
法に準じて行なうことができる。なお。
蛋白質原料を含む液体培地を断続的に添加し培養液を断
続的に取り出す培養では、添加量と取り出し量は同じで
あっても異なっていてもよ(、また添加時期と取り出し
時期は同時であっても異なっていてもよい。
続的に取り出す培養では、添加量と取り出し量は同じで
あっても異なっていてもよ(、また添加時期と取り出し
時期は同時であっても異なっていてもよい。
また、蛋白質原料を含む液体培地を連続的もしくは断続
的に添加して培養する場合、上記したいずれの培養にお
いても1通常温度はコj〜3!0C。
的に添加して培養する場合、上記したいずれの培養にお
いても1通常温度はコj〜3!0C。
培tttu7) pH&! 3〜J’、 通気f=ハ0
、 /−2V、V、M程度である。
、 /−2V、V、M程度である。
上記したように一本発明において増殖末期以降に培養液
中の糖濃度を0 、 i 0% (W/V )以下とい
う低濃度に保持することは、プロテアーゼ生産を抑制す
る単糖類が培養中に著しく少量となるため、プロテアー
ゼ生産を著しく促進させることになる。又、一方1本発
明では、プロテアーゼ生産を誘導する蛋白質が培養中に
連続的もしくは断続的に添加されて培養液中の窒素濃度
が0.06つ1回分培養法では得られない高活性のプロ
テアーゼを生産させることが出来る。
中の糖濃度を0 、 i 0% (W/V )以下とい
う低濃度に保持することは、プロテアーゼ生産を抑制す
る単糖類が培養中に著しく少量となるため、プロテアー
ゼ生産を著しく促進させることになる。又、一方1本発
明では、プロテアーゼ生産を誘導する蛋白質が培養中に
連続的もしくは断続的に添加されて培養液中の窒素濃度
が0.06つ1回分培養法では得られない高活性のプロ
テアーゼを生産させることが出来る。
上記のようにして得られた培養終了液よりグロテ了−ゼ
を回収する手段としては1例えば常法により培養液を濾
過して菌体を分離し、更に必要により透析、塩析、イオ
ン交換樹脂、ゲル濾過等により精製する方法等が挙げら
れる。
を回収する手段としては1例えば常法により培養液を濾
過して菌体を分離し、更に必要により透析、塩析、イオ
ン交換樹脂、ゲル濾過等により精製する方法等が挙げら
れる。
本発明によれば、著しく冨力価のプロテアーゼを効率良
く得ることが出来るので一本発明は産業上極めて有意義
である。
く得ることが出来るので一本発明は産業上極めて有意義
である。
以下、実験例により本発明の詳細な説明する〇実験fl
11 回分法と連続培養法の比較 0、t%(W/V)殿粉、/ 、 0%(W/V)分離
大豆蛋白、 o 、 z % (W/V ) KH2P
O,o、os’G (W/V ) MgSO4,/ o
o p、p、m、 CaCl2. o、o3%(W/
V)B母エキスを含有する液体培地(pH6、j)をオ
ートクレーブで常圧で加熱殺菌し。
11 回分法と連続培養法の比較 0、t%(W/V)殿粉、/ 、 0%(W/V)分離
大豆蛋白、 o 、 z % (W/V ) KH2P
O,o、os’G (W/V ) MgSO4,/ o
o p、p、m、 CaCl2. o、o3%(W/
V)B母エキスを含有する液体培地(pH6、j)をオ
ートクレーブで常圧で加熱殺菌し。
ジャーファーメンタ−に投入し、該培地にアスペルギル
ス・オリゼーIAMコロ09の胞子懸濁液を接種しく胞
子数:/ 06/ me ) 、 Do 2 p、p*
m* −攪拌数410 Or、p、m、で培養し、培養
中のpHは6.3となるようにJ−NのH,SO2およ
びjNのNaOHで制御しつつ培養を行なった。この液
体培養開始後9/時間経過時(増殖末期)以降1次のよ
うにして連続培養法および回分法をそれぞれ実施した。
ス・オリゼーIAMコロ09の胞子懸濁液を接種しく胞
子数:/ 06/ me ) 、 Do 2 p、p*
m* −攪拌数410 Or、p、m、で培養し、培養
中のpHは6.3となるようにJ−NのH,SO2およ
びjNのNaOHで制御しつつ培養を行なった。この液
体培養開始後9/時間経過時(増殖末期)以降1次のよ
うにして連続培養法および回分法をそれぞれ実施した。
連続培養法
上記の液体箸養の開始後4t/時間経過時より蛋白質原
料を含む液体培地〔0,!%(W/V)殿粉、t 、
0qb(W/V)分離大豆蛋白、0.6%(W/ V
) K2HPO,、o 、 OJ−%(W/V ’)
MgSO4゜/ 00 p、p、m、 CaC14,0
、06%(W/V)酵母エキスを含有する液体培地(p
H4−t )をオートクレーブで常圧で加熱殺菌したも
の〕を希釈率O0Oλv/v11hrの割合でジャーフ
了メンタ−の供給口より連続的に供給し、該ジャーフ了
メンタ−の取出口より供給量と同量の培養液を連続的に
採取するというようにして、最初の液体培養開始時より
28目まで連続培養した。この採取した培養液を試験試
料とした。なお、上記連続培養における温度は30°C
1培地pHは乙、r、DOは−2p−p−m−、攪拌数
はa o o’−t o o r、p、m、であった。
料を含む液体培地〔0,!%(W/V)殿粉、t 、
0qb(W/V)分離大豆蛋白、0.6%(W/ V
) K2HPO,、o 、 OJ−%(W/V ’)
MgSO4゜/ 00 p、p、m、 CaC14,0
、06%(W/V)酵母エキスを含有する液体培地(p
H4−t )をオートクレーブで常圧で加熱殺菌したも
の〕を希釈率O0Oλv/v11hrの割合でジャーフ
了メンタ−の供給口より連続的に供給し、該ジャーフ了
メンタ−の取出口より供給量と同量の培養液を連続的に
採取するというようにして、最初の液体培養開始時より
28目まで連続培養した。この採取した培養液を試験試
料とした。なお、上記連続培養における温度は30°C
1培地pHは乙、r、DOは−2p−p−m−、攪拌数
はa o o’−t o o r、p、m、であった。
そして最初の液体培養開始後3日目以降の培養液の糖濃
度は0.00j−0,023−%(W/V)、窒素濃に
ハo 、 o t 〜o 、 / J % (W/V)
であった。
度は0.00j−0,023−%(W/V)、窒素濃に
ハo 、 o t 〜o 、 / J % (W/V)
であった。
回分培養法
上記の液体培養の開始後4t/時間経過時以降に上記蛋
白質原料を含む液体培地を添加することなく、温度30
°c、 f@地のpHj、j、Doコp、p、m。
白質原料を含む液体培地を添加することなく、温度30
°c、 f@地のpHj、j、Doコp、p、m。
攪拌数4t00− /s 00 r、p、m−で、最初
の液体培養開始時より78目まで回分培養し、7回7日
の割合で培養液を採取し、これを対照試料とした。そし
て最初の液体層養開始後3日目以降の培養液の糖濃度は
0.00/ 〜0.030%(W/V ) 。
の液体培養開始時より78目まで回分培養し、7回7日
の割合で培養液を採取し、これを対照試料とした。そし
て最初の液体層養開始後3日目以降の培養液の糖濃度は
0.00/ 〜0.030%(W/V ) 。
窒素濃度はo 、 o y〜o 、 / / % (W
/V ) テf。
/V ) テf。
つだ。
上記実験における試験試料および対照試料のグロテアー
ゼ力価CP、U、 /αt)を測定した結果を示すと1
次の第1表のとおりである。なお、グロテアーゼカ価(
P、U、 / tnl )の測定は、アンンンー荻原変
法(Agr、 Biol、 Chem、第37巻−第2
203頁(/923)〕により行なったものである。そ
して以下の実験例および実施例におけるプロテ了−ゼカ
価(P、tJ、 /mt )も同様である。
ゼ力価CP、U、 /αt)を測定した結果を示すと1
次の第1表のとおりである。なお、グロテアーゼカ価(
P、U、 / tnl )の測定は、アンンンー荻原変
法(Agr、 Biol、 Chem、第37巻−第2
203頁(/923)〕により行なったものである。そ
して以下の実験例および実施例におけるプロテ了−ゼカ
価(P、tJ、 /mt )も同様である。
第 1 表
第1表の結果から1本発明方法は1回分法に比し著しく
高力価のプロテアーゼを効率よ(長期にわたって得るこ
とができることがわかる。
高力価のプロテアーゼを効率よ(長期にわたって得るこ
とができることがわかる。
実験例 2
蛋白質原料を含む液体培地を添加して連続培養する方法
(本発明方法)と蛋白質原料を含まない液体培地を添加
して連続培養する方法(対照)との比較 蛋白質原料を含む液体培地を添加して連続培養する方法
(本発明方法)は、実験例1に記載しhと同様にして連
続培養を実施し、連続的に採取した培養液を試験試料と
した。
(本発明方法)と蛋白質原料を含まない液体培地を添加
して連続培養する方法(対照)との比較 蛋白質原料を含む液体培地を添加して連続培養する方法
(本発明方法)は、実験例1に記載しhと同様にして連
続培養を実施し、連続的に採取した培養液を試験試料と
した。
蛋白質原料を含まない液体培地を添加して連続培養する
方法(対照)は、実験例1で用いた蛋白質原料を含む液
体培地においてi、o%(W/V)分離大豆蛋白の代り
に/、0%(W/V)カザミノ酸を加えた液体培地を用
いる以外は、実験例1に記載したと同様に連続培養を実
施し、連続的に採取した培養液を対照試料とした。なお
、最初の液体培養の開始後3日以降の培養液中の糖濃度
はo 、oor 〜o、o3o%CW/V)−窒X a
K110.0 r 〜0 、7 ! % (W/V
) −Qアッタ。
方法(対照)は、実験例1で用いた蛋白質原料を含む液
体培地においてi、o%(W/V)分離大豆蛋白の代り
に/、0%(W/V)カザミノ酸を加えた液体培地を用
いる以外は、実験例1に記載したと同様に連続培養を実
施し、連続的に採取した培養液を対照試料とした。なお
、最初の液体培養の開始後3日以降の培養液中の糖濃度
はo 、oor 〜o、o3o%CW/V)−窒X a
K110.0 r 〜0 、7 ! % (W/V
) −Qアッタ。
これらの試験試料と対照試料のプロテアーゼカ価を測定
した結果を示すと1次の第2表のとおりである。
した結果を示すと1次の第2表のとおりである。
第 2 表
第2表の結果から、蛋白質原料を含む液体培地を添加し
て連続培養する方法(本発明方法)は。
て連続培養する方法(本発明方法)は。
蛋白質原料を含まない液体培地を添加して連続培養する
方f:(対照)に比し、著しく高力価のプロテアーゼを
効率良(長期にわたって得ることのできることが認めら
れる。
方f:(対照)に比し、著しく高力価のプロテアーゼを
効率良(長期にわたって得ることのできることが認めら
れる。
実験例 3
増殖末期以降における培養液中の炭素濃度についての試
験 実験例1に記載の連続培養法において、希釈率を0・O
gV/V−hrとする以外は、実験例1に記載の連続培
養法と同様に実施し、連続的に採取した培養液を試験試
料とした(本発明方法)。
験 実験例1に記載の連続培養法において、希釈率を0・O
gV/V−hrとする以外は、実験例1に記載の連続培
養法と同様に実施し、連続的に採取した培養液を試験試
料とした(本発明方法)。
この場合の、最初の液体培養開始後3日目以降の培養液
中の糖濃度は0.00j 〜0.04tOqb(W/V
) 、 ’IIN濃にハo 、 o 、r 〜o 、
i j%(W/V)であった。
中の糖濃度は0.00j 〜0.04tOqb(W/V
) 、 ’IIN濃にハo 、 o 、r 〜o 、
i j%(W/V)であった。
一方、上記方法で用いた蛋白質原料を含む液体培地にお
いて0.j%(W/V)殿粉の代りに1.0%(W/V
)殿粉を加えた液体培地を用いる以外は、上記方法と同
様にして連続培養を実施し、連続的に採取した試料を対
照試料とした(対照の方法)。この場合の、最初の液体
培養開始後3日目以降の培養液中の糖濃度は0.lj鴬
〜o 、 J o4 (W/V ) 、窒素濃度はo、
ot〜o、or%(W/V)であった。
いて0.j%(W/V)殿粉の代りに1.0%(W/V
)殿粉を加えた液体培地を用いる以外は、上記方法と同
様にして連続培養を実施し、連続的に採取した試料を対
照試料とした(対照の方法)。この場合の、最初の液体
培養開始後3日目以降の培養液中の糖濃度は0.lj鴬
〜o 、 J o4 (W/V ) 、窒素濃度はo、
ot〜o、or%(W/V)であった。
これらの試験試料と対照試料のグロテアーゼカ価を測定
した結果を示すと、第3表のとおりであるO 第 3 表 第3表の結果から1本発明方法は、対照の方法に比し著
しく高力価のプロテアーゼを効率良(長期にわたって得
ることができることが認められる。
した結果を示すと、第3表のとおりであるO 第 3 表 第3表の結果から1本発明方法は、対照の方法に比し著
しく高力価のプロテアーゼを効率良(長期にわたって得
ることができることが認められる。
以下に1本発明の実施例を示す。
実施例 1
3ノ容ジヤーフアメンターに、1.0(focW/V)
ポリペプトン、0.j%(W/V)殿粉、0.!’%
(W / V ) KHtI’04.0 、 o r
’b (W / V ) 狗SOq −o 、 o 3
4 (W/V )B!!$ス及びt o%cW/V)食
塩を含有する液体培地(pH2,θ)を120℃で70
分間加熱殺菌したも9コ!を入れ。
ポリペプトン、0.j%(W/V)殿粉、0.!’%
(W / V ) KHtI’04.0 、 o r
’b (W / V ) 狗SOq −o 、 o 3
4 (W/V )B!!$ス及びt o%cW/V)食
塩を含有する液体培地(pH2,θ)を120℃で70
分間加熱殺菌したも9コ!を入れ。
該培地に2マルト工キス斜面培養培地より採取したアス
ペルギルス・ソーヤIAMニア03の胞子懸濁液を接種
(胞子数:/、0x106/蛯)シ。
ペルギルス・ソーヤIAMニア03の胞子懸濁液を接種
(胞子数:/、0x106/蛯)シ。
30°C−通気量lV、V、M、 、攪拌数30 Or
、p*m++で培養を開始した。なお−培養途中のpH
は、 J−NのH2SO,及び!NのNaOHを用いて
常時7 、OK保持される様に調整を行なった。
、p*m++で培養を開始した。なお−培養途中のpH
は、 J−NのH2SO,及び!NのNaOHを用いて
常時7 、OK保持される様に調整を行なった。
培養開始後、4t、r時間経過した時点(増殖末期)よ
り、該培養液に、蛋白質原料を含む液体培地〔7、o%
(W/V )分離大豆蛋白、0.3%(W/V )
KH2PO4,0、j % (W/V ) 可溶性殿粉
。
り、該培養液に、蛋白質原料を含む液体培地〔7、o%
(W/V )分離大豆蛋白、0.3%(W/V )
KH2PO4,0、j % (W/V ) 可溶性殿粉
。
o 、Ot%(W/V)MgSO4,o 、 03%(
W/V)酵母エキス、10%(W/V)食塩を含有する
液体培地(pH2,0)を、/2θ0Cで10分間加熱
殺菌したもの〕を希釈率O0θ2(V/V・hr )で
連続的に添加しつつ、温度30°C1培養液のpH7、
0−通気量/ V−V−M、 攪拌数<t Oo 〜乙
00 r、p、m、で培養し〔培養開始後3日目以降の
培養液中の糖濃度はo、oos〜0.030%(W/V
)、 窒素e4にハo 、 09〜o 、 / 2%
(W/V)L該ジャーフ了メンタ−の取出口より一連
続的に添加した蛋白質原料を含む液体培地量と同容量の
プロテアーゼ含有培養液を連続的に得た。
W/V)酵母エキス、10%(W/V)食塩を含有する
液体培地(pH2,0)を、/2θ0Cで10分間加熱
殺菌したもの〕を希釈率O0θ2(V/V・hr )で
連続的に添加しつつ、温度30°C1培養液のpH7、
0−通気量/ V−V−M、 攪拌数<t Oo 〜乙
00 r、p、m、で培養し〔培養開始後3日目以降の
培養液中の糖濃度はo、oos〜0.030%(W/V
)、 窒素e4にハo 、 09〜o 、 / 2%
(W/V)L該ジャーフ了メンタ−の取出口より一連
続的に添加した蛋白質原料を含む液体培地量と同容量の
プロテアーゼ含有培養液を連続的に得た。
このようにして得られた培養液のプロテアーゼ力価を第
4表に示す0 第 4 表 実施例 2 3!容@醪槽に、0.7j係(W/’l可溶性殿粉、/
、33%(W/V)ポリペプトン、O0!% (W /
V ) KI−(t’PC)<、 0−3% (W/
” ) ”gS04゜0.03%(W/V)酵母エキ
スを含む液体培地(pHg、t)を720℃でio分間
加熱殺菌したもの/、OJを入れ、該培地に、マルトエ
ギス斜面堵養培地より採取したアスペルギルス・オリゼ
ーIAMコロ09の胞子懸濁液を接種(胞子数:/ 、
2 X / 06/ ml ) L、 30 ’C,
通’J i / V−V、M、。
4表に示す0 第 4 表 実施例 2 3!容@醪槽に、0.7j係(W/’l可溶性殿粉、/
、33%(W/V)ポリペプトン、O0!% (W /
V ) KI−(t’PC)<、 0−3% (W/
” ) ”gS04゜0.03%(W/V)酵母エキ
スを含む液体培地(pHg、t)を720℃でio分間
加熱殺菌したもの/、OJを入れ、該培地に、マルトエ
ギス斜面堵養培地より採取したアスペルギルス・オリゼ
ーIAMコロ09の胞子懸濁液を接種(胞子数:/ 、
2 X / 06/ ml ) L、 30 ’C,
通’J i / V−V、M、。
攪拌数j 00 ’r、p、m、で培養を開始した。な
お−培養中のpHは、J−NのH,So、を用いて常時
乙、!程度に保持される様に調整を行なった。
お−培養中のpHは、J−NのH,So、を用いて常時
乙、!程度に保持される様に調整を行なった。
培養開始後、22時間経過した時点(増殖末期)より、
該培養液に、蛋白質原料を含む液体培地〔i、r%(W
/V)脱脂大豆粉末、θ、りj係(W/V) 可g性殿
粉、 o 、 r % (W/ V ) KHtPO。
該培養液に、蛋白質原料を含む液体培地〔i、r%(W
/V)脱脂大豆粉末、θ、りj係(W/V) 可g性殿
粉、 o 、 r % (W/ V ) KHtPO。
O,t%(W/V)MgSO4,0,03%(W/V)
酵母エキスを含有する液体培地(pH+、t)を720
℃で10分間加熱殺菌したもの〕を、シリコンチューブ
を通じ/ o tut / hrの供給速度で供給しつ
つ、温度30℃、培養液のPH7、o、通気量/ V、
V、M、、攪拌数4to o−t o o r、p、m
、で該心算槽内で3日間培養し〔層養培地中の糖濃度は
o、ooJ−〜0.θ4tO%(W/V)、 窒素濃F
lハo 、 07〜o 、 12% (W/V ) )
プロテアーゼ含有培養液を得た。このようにして得られ
た培養液のプロテアーゼ力価は600 p、tJ、/
mlであったO 実施例 3 JJ容+’!I酵槽に、o 、りt%(W/V)可g性
殿粉、/、33%(W/V)ポリペプトン、O0!4
(W/V ) KH,PO2,0、j % (W/V
) MgSO4゜o 、 o 3% (W/V )酵母
エキスを含む液体培地(pHt 、 j )を120℃
で10分間加熱殺菌したもの/、OLを入れ、該培地に
、マルトエキス斜面培養培地より採取したアスペルギル
ス・オリゼーIAMコロ09の胞子懸濁液を接種(胞子
数:t 、、、2X/ o6/lug)t、、 So°
C,a気量i V、V、M、。
酵母エキスを含有する液体培地(pH+、t)を720
℃で10分間加熱殺菌したもの〕を、シリコンチューブ
を通じ/ o tut / hrの供給速度で供給しつ
つ、温度30℃、培養液のPH7、o、通気量/ V、
V、M、、攪拌数4to o−t o o r、p、m
、で該心算槽内で3日間培養し〔層養培地中の糖濃度は
o、ooJ−〜0.θ4tO%(W/V)、 窒素濃F
lハo 、 07〜o 、 12% (W/V ) )
プロテアーゼ含有培養液を得た。このようにして得られ
た培養液のプロテアーゼ力価は600 p、tJ、/
mlであったO 実施例 3 JJ容+’!I酵槽に、o 、りt%(W/V)可g性
殿粉、/、33%(W/V)ポリペプトン、O0!4
(W/V ) KH,PO2,0、j % (W/V
) MgSO4゜o 、 o 3% (W/V )酵母
エキスを含む液体培地(pHt 、 j )を120℃
で10分間加熱殺菌したもの/、OLを入れ、該培地に
、マルトエキス斜面培養培地より採取したアスペルギル
ス・オリゼーIAMコロ09の胞子懸濁液を接種(胞子
数:t 、、、2X/ o6/lug)t、、 So°
C,a気量i V、V、M、。
攪拌数j 00 r、pam++で培養を開始した。な
お、培養中のpHは、!NのH,So4を用いて常時乙
、!程度に保持される様に調整を行なった0 培養開始後、クコ時間経過した時点(増殖末期)で、該
培養液に、蛋白質原料を含む液体培地〔ハ!% (W/
V ) 脱脂大豆粉末、 o 、 73% (W/V
)可溶性殿粉、O8!係(W/V ’) K1(2PO
1,0、3% (W/V ’) MgSO4,0、OJ
% (W/V )It母エキスを含有する液体培地(p
Ht 、 s )を120℃でio分間加熱殺菌したも
の〕をlコθmB添加し、その後72時間毎に/コOr
nlづつ加え、温度30°C,N 養W ノpH7、0
,通気量/V、V、M、、攪拌数グθO−≦00 r、
p、m、で該醗醪槽内で3日間珊養し〔培養培地中の糖
濃度は0.00/〜0.0!θ%(W/V L、 窒素
81度&to 、 o q 〜o 、 t s%(W/
V))プロテアーゼ含有層養液を得た。このようにして
得られた培養液のプロテアーゼ力価はJ−t o P、
U、/屁であった。
お、培養中のpHは、!NのH,So4を用いて常時乙
、!程度に保持される様に調整を行なった0 培養開始後、クコ時間経過した時点(増殖末期)で、該
培養液に、蛋白質原料を含む液体培地〔ハ!% (W/
V ) 脱脂大豆粉末、 o 、 73% (W/V
)可溶性殿粉、O8!係(W/V ’) K1(2PO
1,0、3% (W/V ’) MgSO4,0、OJ
% (W/V )It母エキスを含有する液体培地(p
Ht 、 s )を120℃でio分間加熱殺菌したも
の〕をlコθmB添加し、その後72時間毎に/コOr
nlづつ加え、温度30°C,N 養W ノpH7、0
,通気量/V、V、M、、攪拌数グθO−≦00 r、
p、m、で該醗醪槽内で3日間珊養し〔培養培地中の糖
濃度は0.00/〜0.0!θ%(W/V L、 窒素
81度&to 、 o q 〜o 、 t s%(W/
V))プロテアーゼ含有層養液を得た。このようにして
得られた培養液のプロテアーゼ力価はJ−t o P、
U、/屁であった。
実施例 4
3ノ容ジヤーフアメンターに、7.0%CW/■)ポリ
ペプトン、0.6幅(W/V)殿粉、015%(W/V
’) KI(、PO4−0、0j % (W/V )
MgSO4゜0 、0 、? ’G (W/ V )
Ml 母エキス及ヒ/ 0 % (W/V)食塩を含有
する液体培地(pH7,0)を720℃で70分間加熱
殺菌したものコ!を入れ、該培地に、マルトエキス斜面
培養培地より採取したアスペルギルス・ソーヤIkM2
2o3の胞子懸濁液を接種(胞子数:/ 、0X10’
/rrlt)シ、jθ0C1通気量t V、V、M、、
攪拌数−5′00 r、p、m、テjg aを開始した
。なお、珊養途中のpHは、tNのH2so4及びtN
のNap(を用いて常時7.0に保持される様に調整を
行なった。
ペプトン、0.6幅(W/V)殿粉、015%(W/V
’) KI(、PO4−0、0j % (W/V )
MgSO4゜0 、0 、? ’G (W/ V )
Ml 母エキス及ヒ/ 0 % (W/V)食塩を含有
する液体培地(pH7,0)を720℃で70分間加熱
殺菌したものコ!を入れ、該培地に、マルトエキス斜面
培養培地より採取したアスペルギルス・ソーヤIkM2
2o3の胞子懸濁液を接種(胞子数:/ 、0X10’
/rrlt)シ、jθ0C1通気量t V、V、M、、
攪拌数−5′00 r、p、m、テjg aを開始した
。なお、珊養途中のpHは、tNのH2so4及びtN
のNap(を用いて常時7.0に保持される様に調整を
行なった。
培養開始後、グ♂時間経過した時点(増殖末期)で、該
培養液4t 00 rrLlを取り出し口より取り出し
た後、速やかに培−養液に、蛋白質原料を含む液体培地
〔1,0%(W/V)分離大豆蛋白、O11% (W/
V ) KH2PO,o 、 r% (W/V ) 可
溶性膜m−0、or% (W/V) MgSO4,o
、 03%(W/V ) 酵母:r−*ス、 / o%
(W/V)食塩を含有する液体培地(pH7,0)を、
120℃で70分間加熱殺菌したもの〕を4too酩加
えた0その後72時間毎に前記操作を繰り返し行ないつ
つ一温FI 30 ’C,培養R(1”) pH7、0
,通気量/ V、V、M、。
培養液4t 00 rrLlを取り出し口より取り出し
た後、速やかに培−養液に、蛋白質原料を含む液体培地
〔1,0%(W/V)分離大豆蛋白、O11% (W/
V ) KH2PO,o 、 r% (W/V ) 可
溶性膜m−0、or% (W/V) MgSO4,o
、 03%(W/V ) 酵母:r−*ス、 / o%
(W/V)食塩を含有する液体培地(pH7,0)を、
120℃で70分間加熱殺菌したもの〕を4too酩加
えた0その後72時間毎に前記操作を繰り返し行ないつ
つ一温FI 30 ’C,培養R(1”) pH7、0
,通気量/ V、V、M、。
攪拌数4t00−600 r、p、m、で培養し〔培養
開始後3日目以降の培養液中の糖濃度は0.θoi〜o
、/ 00%(W/V)、 窒素濃に&’L o 、
o 、r 〜0、lj係(W/V)]−]プロテアー
ゼ含有養液を断続的に得た。
開始後3日目以降の培養液中の糖濃度は0.θoi〜o
、/ 00%(W/V)、 窒素濃に&’L o 、
o 、r 〜0、lj係(W/V)]−]プロテアー
ゼ含有養液を断続的に得た。
このようにして得られた培養液のプロテアーゼ力価を第
5表に示す0
5表に示す0
Claims (1)
- プロテアーゼ生産能を有する糸状菌を液体培地に培養し
てプロテアーゼを製造するに際し、増殖末期以降におけ
る培養液中の糖濃度を0.10%(W/V)以下、窒素
濃度を0.06%(W/V)以上となるように、蛋白質
原料を含む液体培地を連続的もしくは断続的に加えて培
養することを特徴とするプロテアーゼの製造法。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP29298885A JPS62248485A (ja) | 1985-12-27 | 1985-12-27 | プロテア−ゼの製造法 |
US06/933,177 US4879235A (en) | 1985-11-29 | 1986-11-21 | Process for producing protease by cultivating a protease-producing mold in a liquid medium |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP29298885A JPS62248485A (ja) | 1985-12-27 | 1985-12-27 | プロテア−ゼの製造法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS62248485A true JPS62248485A (ja) | 1987-10-29 |
Family
ID=17789015
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP29298885A Pending JPS62248485A (ja) | 1985-11-29 | 1985-12-27 | プロテア−ゼの製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS62248485A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS63148985A (ja) * | 1986-12-15 | 1988-06-21 | Japanese Res & Dev Assoc Bio Reactor Syst Food Ind | 魚類蛋白質分解用酵素の製造法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS4887082A (ja) * | 1972-02-23 | 1973-11-16 |
-
1985
- 1985-12-27 JP JP29298885A patent/JPS62248485A/ja active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS4887082A (ja) * | 1972-02-23 | 1973-11-16 |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS63148985A (ja) * | 1986-12-15 | 1988-06-21 | Japanese Res & Dev Assoc Bio Reactor Syst Food Ind | 魚類蛋白質分解用酵素の製造法 |
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