JPS62248485A

JPS62248485A - プロテア−ゼの製造法

Info

Publication number: JPS62248485A
Application number: JP29298885A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Motai; 茂田井　宏; Yaichi Fukushima; 弥一福島; Tetsuro Fukase; 哲朗深瀬; Harumichi Ito; 伊藤　晴通
Original assignee: Japanese Res & Dev Assoc Bio Reactor Syst Food Ind
Current assignee: Japanese Res & Dev Assoc Bio Reactor Syst Food Ind
Priority date: 1985-12-27
Filing date: 1985-12-27
Publication date: 1987-10-29

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、プロテアーゼ生産能を有する糸状菌を用いて
高力価のプロテアーゼを効率良（製造する方法に関する
。

〔従来の技術〕

プロテアーゼは蛋白質又はその部分加水分解物に作用し
てペプチド°結合を分解する卯水分解醪素であって、医
薬、醸造食品、洗剤等に広（利用されている。

従来、微生物によるグロテ了−ゼの生産に関する研究は
、プロテアーゼ生産能の高い微生物のスクリーニング法
もしくはその育種法に主眼がおかれていた。又培養条件
に関する研究も、その多（は培地の組成、特に培地に無
機塩を添加するもの（例えば特公昭１０−コａｉｉｉ号
公報等）や培地中の窒素源の種類（例えば特開昭ｊ／−
９６／♂Ｏ号公報等）、炭素源の種類（例えば特公昭！
−−ｌコ２り７号公報等）等に限られており、しかもこ
れらは何れも回分式製造法に限られていた。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従来のプロテアーゼ製造に関する提案方法では。

何れも回分式製造法であったことに主として起因して、
プロテアーゼ産生期は菌体が増殖した後の定常期に限ら
れており、しかも定常期において培地中の炭素源、窒素
源を制卸することが著しく困難であったため、プロテア
ーゼの工業的採取期が短く、シかも得られるプロテアー
ゼカ価も比較的低いものであると言う問題点があった。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は−これら従来方性の問題点を解決するために成
されたものであって、高力価のプロテアーゼを効率良（
得る方法を提供することを目的とするものである。

即ち１本発明はプロテアーゼ生産能を有する糸状菌を液
体培地に培養してプロテアーゼを製造するに際し、増殖
末期以降におけろ培養液中の糖濃度を０．１０％（Ｗ／
Ｖ）以下、窒素濃度を０．０６％（Ｗ／Ｖ）以上となる
ように、蛋白質原料を含む液体培地を連続的もしくは断
続的に加えて培養することを特徴とするプロテアーゼの
製造法であるＯ本発明に用いられるプロテアーゼ生産能を有する糸状菌
−−４は−例えばアスペルギルス属、ペニシリウム属、
ムコール属−リゾープス属等に属するプロテアーゼ生産
能を有する糸状菌であり。

その具体例としては−アスペルギルス・ソーヤＩＡＭｕ
り０３．アスペルギルス・ソーヤＩＡＭ２ｔ３／、了ス
ペルギルス畳オリゼ−ＩＡＭコｔ０９゜アスペルギルス
・オリゼ−［ｐＱｇ／７＋、アスペルギルス・タマリＩ
　ＡＭ　２−／　ｚ　ｔ　、ペニシリウム・クリンゲナ
ムＨＵＴ４ｔｏｔｑ、ペニシリウム・ルテウムＡＨＴＪ
１０２２．ムコール・ラセモサスＡＨＵに００２．ムコ
ール・ヒエマリスＨＵ　Ｔ／　／　３　／、　　＋Ｊ　
７”−７’ス・フオルモサエンシスＩＰＯ１４７３２、
リゾープス・ジャバニカスＩ　ＦＯｓ＜ｔ＜ｔ／等が挙
げられろ。

なお１本発明においては、耐塩性のプロテアーゼ生産能
を有する糸状菌を用いれば、雑菌汚染を防止する意味で
有利である（耐塩性の目安としては食塩！％以上、好ま
しくは食塩１０係以上である）。

本発明において、蛋白質原料を含む液体培地を添加する
までの培養、即ち単に菌体を増殖するための培養を、以
下単に前培養と言う。

そして前層養に使用する培地としては、従来プロテアー
ゼ生産能を有する糸状菌の液体培養法において用いられ
る液体培地であれば何れを用いてもよい。即ち、培地の
炭素源としては１例えばグルコース−可溶性殿粉、シュ
クロース、デキスト１Ｊ７．ヤ、ｌ１０−ス、グリセリ
ン、皺等が、窒素源としては１例えばペプトン、肉エキ
ス、酵母！＊ス、大豆粉、ヌカ、カゼイン、ポリペプト
ン、グルテン等が、無機塩としては１例えば各種リン酸
塩、硫醗塩、塩酸塩等が用いられ、さらに必要によりビ
タミン類、核酸等を適宜加えた液体培地が用いられる。

前記した液体培地に、プロテアーゼ生産能を有する糸状
菌菌体を接種した後、液体培養する。このときの培蕃温
度、培地のｐＨ％通気量などの培養条件は使用する菌株
、培地組成などによって変わるが２通常培養源度はコ！
〜４ｔｏ’Ｃ，培地のｐＨは３〜♂１通気量は０．／〜
Ｊ　Ｖ、Ｖ、Ｍ程度である。

か（して、培養初期の誘導期を経て、増殖期に移行する
と、菌体は著しく増殖する。通常、ｆ＠養開始後／−’
１日程度で増殖は止まり一増殖末期以降はほぼ定常期に
移行する。

本発明においては、増殖末期以降、即ち増殖末期から主
として始まる酵素産生期に、液中の糖濃度が０．１０係
（Ｗ／Ｖ）以下、好ましくはｏ、ｏｒ％（Ｗ７Ｖ）以下
、窒素ａｒカｏ　、　ｏ　ｔ　％　（Ｗ／Ｖ’）以上、
　好マ１．＜ハｏ　、　ｏ　ｔ　〜ｏ　、　３ｏ％　（
Ｗ／Ｖ）となるように、蛋白質原料を含む液体培地を連
続的もしくは断続的に添加する。

この蛋白質原料を含む液体培地に用いられる蛋白質原料
としては１例えば大豆、脱脂大豆−分離大豆蛋白、ミル
クカゼイン、卵アルブミン、牛血清アルブミン−小麦グ
ルテン、ペプトン、ソイトーン等の１種もしくは２種以
上のものが挙げられる。この蛋白質原料を含む液体培地
には、必要にヨリグルコース、シュクロース、ラクトー
ス、カラクトース、可溶性殿粉、デキストリン、セルロ
ース、小麦等の糖質原料、更に各種リン酸塩、硫酸塩、
塩酸塩等の無機塩類、ビタミン類、核酸等を加えてもよ
い。

本発明において、増殖期末期以降の培養液に。

液中の糖濃度が０．１０％（Ｗ／Ｖ）以下、窒素濃度が
０．０１％（Ｗ／Ｖ）以上になるように蛋白質原料を含
む液体培地を添亦するのは２次の理由による。

先ず一増殖末期における培養液の糖濃度カ高いとプロテ
アーゼ生産抑制因子である糖類によりプロテアーゼの生
産が著しく抑制される。又１回分法においては、菌体の
増殖とともに微量生産されるプロテアーゼ−ペプチダー
ゼ等により培養初期に含まれるプロテアーゼ生産の誘導
物質である蛋白質が分解されてアミノ酸となるため、蛋
白質が殆どもしくは全（存在せず、プロテアーゼ生産の
誘導作用を受は難いため、増殖末期以降においては高活
性のプロテアーゼの生産は到底達放されないＯそこで、プロテアーゼの生産を高めるには増殖末期以降
において一培養液中の糖濃度を低（して蛋白質原料を含
む液体培地を培養液に加えればよいわけであり−この点
に関し本発明者等は研究した結果、増殖末期以降の培養
液に、液中の糖濃度力０　、　／　０　％　（Ｗ／Ｖ　
）　以下、　窒素１ｊｋｇカ０．Ｏｔ％（Ｗ／Ｖ）以上
となるように蛋白質原料を含む液体培地を添加すればよ
いことを見い出したのである。

次に、増殖末期以降に、培養液中の糖濃度および窒素濃
度が上記のようになるように■白雪原料を含む液体培地
を添加する手段としては一壇地の組成、添加速度、添加
割合などの調整その他適宜の手段を選ぶことができるが
、その好ましい手段の７例を述べると次のとおりである
。

先ず、糖源は糸状菌によって分解されて単糖類となり、
これがプロテアーゼ生産の抑制因子となるため、菌体自
身の炭素、窒素、およびリンの組成を考慮して培地中の
糖源の含有割合を蛋白質やリンに比べて低ぐする必要が
ある。そこで、増殖末期以降に培養液に添加する蛋白質
原料を含む液体培地の組成を決めるにあたっては、予め
この液体培地に使用するプロテアーゼ生産能を有する糸
状菌を実験的に培養し、糖源が完全に消費された時に残
存する窒素濃度が０．０１％（Ｗ／Ｖ）以上、　好ｔＬ
　＜ハｏ　、　ｏ　ｔ　〜ｏ　、　Ｊ％（Ｗ／Ｖ）、！
：なるように糖源と蛋白質の配合比を決め、このように
配合比を決めた蛋白質原料を含む液体培地を上記した増
殖末期以降の培養液に糖濃度が０．１０％（Ｗ／Ｖ）以
下、好ましくはｏ、ｏｔ係（Ｗ／Ｖ）以下となるように
添加すると、培養液中の窒素濃度は０．０１％（Ｗ／Ｖ
）以上、好ましζはｏ、ｏｔ　〜ｏ、３ｏ％ｃＷ／Ｖ’
）の範囲に保持される。

また、上記蛋白質原料を含む液体培地に糖を含ませてい
ない場合には、培養液中の窒素濃度がｏ、ｏに％（Ｗ／
Ｖ）以上、好ましくはθ、θぶ〜ｏ　、　３ｏ％　（Ｗ
／Ｖ）の範囲となるように蛋白質原料を含む液体培地を
添加すればよい。

増殖末期以降の培養液への蛋白質原料を含む液体培地の
添加は連続的もしくは断続的に添加することができる。

そして増殖末期以降に蛋白質原料を含む液体培地を添加
して行なう培養は、該液体培地を連続的に添加し培養液
を連続的に取り出して連続培養するか、または該液体培
地を断続的に添加し培養液を断続的に取り出すというよ
うに培養するか、または該液体培地を連続的もしくは断
続的に添加して流ｍｆ＠ｓすることにより実施される。

上記のいずれの培養を行なう場合でも、蛋白質原料を含
む液体培地の添加は培養中の糖濃度をｏ　、ｔ　ｏ％ｃ
Ｗ／Ｖ＞以下、窒素濃度なｏ、ｏｔ４（Ｗ／Ｖ）以上と
なるようにして行なえばよい。

上記のようにする以外は、連続培養法、流部培養法は常
法に準じて行なうことができる。なお。

蛋白質原料を含む液体培地を断続的に添加し培養液を断
続的に取り出す培養では、添加量と取り出し量は同じで
あっても異なっていてもよ（、また添加時期と取り出し
時期は同時であっても異なっていてもよい。

また、蛋白質原料を含む液体培地を連続的もしくは断続
的に添加して培養する場合、上記したいずれの培養にお
いても１通常温度はコｊ〜３！０Ｃ。

培ｔｔｔｕ７）　ｐＨ＆！　３〜Ｊ’、　通気ｆ＝ハ０
　、　／−２Ｖ、Ｖ、Ｍ程度である。

上記したように一本発明において増殖末期以降に培養液
中の糖濃度を０　、　ｉ　０％　（Ｗ／Ｖ　）以下とい
う低濃度に保持することは、プロテアーゼ生産を抑制す
る単糖類が培養中に著しく少量となるため、プロテアー
ゼ生産を著しく促進させることになる。又、一方１本発
明では、プロテアーゼ生産を誘導する蛋白質が培養中に
連続的もしくは断続的に添加されて培養液中の窒素濃度
が０．０６つ１回分培養法では得られない高活性のプロ
テアーゼを生産させることが出来る。

上記のようにして得られた培養終了液よりグロテ了−ゼ
を回収する手段としては１例えば常法により培養液を濾
過して菌体を分離し、更に必要により透析、塩析、イオ
ン交換樹脂、ゲル濾過等により精製する方法等が挙げら
れる。

〔発明の効果〕

本発明によれば、著しく冨力価のプロテアーゼを効率良
く得ることが出来るので一本発明は産業上極めて有意義
である。

以下、実験例により本発明の詳細な説明する〇実験ｆｌ
１１回分法と連続培養法の比較０、ｔ％（Ｗ／Ｖ）殿粉、／　、　０％（Ｗ／Ｖ）分離
大豆蛋白、　ｏ　、　ｚ　％　（Ｗ／Ｖ　）　ＫＨ２Ｐ
Ｏ，ｏ、ｏｓ’Ｇ　（Ｗ／Ｖ　）　ＭｇＳＯ４，／　ｏ
　ｏ　ｐ、ｐ、ｍ、　ＣａＣｌ２．　ｏ、ｏ３％（Ｗ／
Ｖ）Ｂ母エキスを含有する液体培地（ｐＨ６、ｊ）をオ
ートクレーブで常圧で加熱殺菌し。

ジャーファーメンタ−に投入し、該培地にアスペルギル
ス・オリゼーＩＡＭコロ０９の胞子懸濁液を接種しく胞
子数：／　０６／　ｍｅ　）　、　Ｄｏ　２　ｐ、ｐ＊
ｍ＊　−攪拌数４１０　Ｏｒ、ｐ、ｍ、で培養し、培養
中のｐＨは６．３となるようにＪ−ＮのＨ，ＳＯ２およ
びｊＮのＮａＯＨで制御しつつ培養を行なった。この液
体培養開始後９／時間経過時（増殖末期）以降１次のよ
うにして連続培養法および回分法をそれぞれ実施した。

連続培養法上記の液体箸養の開始後４ｔ／時間経過時より蛋白質原
料を含む液体培地〔０，！％（Ｗ／Ｖ）殿粉、ｔ　、　
０ｑｂ（Ｗ／Ｖ）分離大豆蛋白、０．６％（Ｗ／　Ｖ　
）　Ｋ２ＨＰＯ，、ｏ　、　ＯＪ−％（Ｗ／Ｖ　’）　
ＭｇＳＯ４゜／　００　ｐ、ｐ、ｍ、　ＣａＣ１４，０
、０６％（Ｗ／Ｖ）酵母エキスを含有する液体培地（ｐ
Ｈ４−ｔ　）をオートクレーブで常圧で加熱殺菌したも
の〕を希釈率Ｏ０Ｏλｖ／ｖ１１ｈｒの割合でジャーフ
了メンタ−の供給口より連続的に供給し、該ジャーフ了
メンタ−の取出口より供給量と同量の培養液を連続的に
採取するというようにして、最初の液体培養開始時より
２８目まで連続培養した。この採取した培養液を試験試
料とした。なお、上記連続培養における温度は３０°Ｃ
１培地ｐＨは乙、ｒ、ＤＯは−２ｐ−ｐ−ｍ−、攪拌数
はａ　ｏ　ｏ’−ｔ　ｏ　ｏ　ｒ、ｐ、ｍ、であった。

そして最初の液体培養開始後３日目以降の培養液の糖濃
度は０．００ｊ−０，０２３−％（Ｗ／Ｖ）、窒素濃に
ハｏ　、　ｏ　ｔ　〜ｏ　、　／　Ｊ　％　（Ｗ／Ｖ）
であった。

回分培養法上記の液体培養の開始後４ｔ／時間経過時以降に上記蛋
白質原料を含む液体培地を添加することなく、温度３０
°ｃ、　ｆ＠地のｐＨｊ、ｊ、Ｄｏコｐ、ｐ、ｍ。

攪拌数４ｔ００−　／ｓ　００　ｒ、ｐ、ｍ−で、最初
の液体培養開始時より７８目まで回分培養し、７回７日
の割合で培養液を採取し、これを対照試料とした。そし
て最初の液体層養開始後３日目以降の培養液の糖濃度は
０．００／　〜０．０３０％（Ｗ／Ｖ　）　。

窒素濃度はｏ　、　ｏ　ｙ〜ｏ　、　／　／　％　（Ｗ
／Ｖ　）　テｆ。

つだ。

上記実験における試験試料および対照試料のグロテアー
ゼ力価ＣＰ、Ｕ、　／αｔ）を測定した結果を示すと１
次の第１表のとおりである。なお、グロテアーゼカ価（
Ｐ、Ｕ、　／　ｔｎｌ　）の測定は、アンンンー荻原変
法（Ａｇｒ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、第３７巻−第２
２０３頁（／９２３）〕により行なったものである。そ
して以下の実験例および実施例におけるプロテ了−ゼカ
価（Ｐ、ｔＪ、　／ｍｔ　）も同様である。

第　　　　　　１　　　　　　表第１表の結果から１本発明方法は１回分法に比し著しく
高力価のプロテアーゼを効率よ（長期にわたって得るこ
とができることがわかる。

実験例　２蛋白質原料を含む液体培地を添加して連続培養する方法
（本発明方法）と蛋白質原料を含まない液体培地を添加
して連続培養する方法（対照）との比較蛋白質原料を含む液体培地を添加して連続培養する方法
（本発明方法）は、実験例１に記載しｈと同様にして連
続培養を実施し、連続的に採取した培養液を試験試料と
した。

蛋白質原料を含まない液体培地を添加して連続培養する
方法（対照）は、実験例１で用いた蛋白質原料を含む液
体培地においてｉ、ｏ％（Ｗ／Ｖ）分離大豆蛋白の代り
に／、０％（Ｗ／Ｖ）カザミノ酸を加えた液体培地を用
いる以外は、実験例１に記載したと同様に連続培養を実
施し、連続的に採取した培養液を対照試料とした。なお
、最初の液体培養の開始後３日以降の培養液中の糖濃度
はｏ　、ｏｏｒ　〜ｏ、ｏ３ｏ％ＣＷ／Ｖ）−窒Ｘ　ａ
　Ｋ１１０．０　ｒ　〜０　、７　！　％　（Ｗ／Ｖ　
）　−Ｑアッタ。

これらの試験試料と対照試料のプロテアーゼカ価を測定
した結果を示すと１次の第２表のとおりである。

第　　　　　　２　　　　　　表第２表の結果から、蛋白質原料を含む液体培地を添加し
て連続培養する方法（本発明方法）は。

蛋白質原料を含まない液体培地を添加して連続培養する
方ｆ：（対照）に比し、著しく高力価のプロテアーゼを
効率良（長期にわたって得ることのできることが認めら
れる。

実験例　３増殖末期以降における培養液中の炭素濃度についての試
験実験例１に記載の連続培養法において、希釈率を０・Ｏ
ｇＶ／Ｖ−ｈｒとする以外は、実験例１に記載の連続培
養法と同様に実施し、連続的に採取した培養液を試験試
料とした（本発明方法）。

この場合の、最初の液体培養開始後３日目以降の培養液
中の糖濃度は０．００ｊ　〜０．０４ｔＯｑｂ（Ｗ／Ｖ
　）　、　’ＩＩＮ濃にハｏ　、　ｏ　、ｒ　〜ｏ　、
　ｉ　ｊ％（Ｗ／Ｖ）であった。

一方、上記方法で用いた蛋白質原料を含む液体培地にお
いて０．ｊ％（Ｗ／Ｖ）殿粉の代りに１．０％（Ｗ／Ｖ
）殿粉を加えた液体培地を用いる以外は、上記方法と同
様にして連続培養を実施し、連続的に採取した試料を対
照試料とした（対照の方法）。この場合の、最初の液体
培養開始後３日目以降の培養液中の糖濃度は０．ｌｊ鴬
〜ｏ　、　Ｊ　ｏ４　（Ｗ／Ｖ　）　、窒素濃度はｏ、
ｏｔ〜ｏ、ｏｒ％（Ｗ／Ｖ）であった。

これらの試験試料と対照試料のグロテアーゼカ価を測定
した結果を示すと、第３表のとおりであるＯ第　　　　　　３　　　　　　表第３表の結果から１本発明方法は、対照の方法に比し著
しく高力価のプロテアーゼを効率良（長期にわたって得
ることができることが認められる。

〔実施例〕

以下に１本発明の実施例を示す。

実施例　１３ノ容ジヤーフアメンターに、１．０（ｆｏｃＷ／Ｖ）
ポリペプトン、０．ｊ％（Ｗ／Ｖ）殿粉、０．！’％　
（Ｗ　／　Ｖ　）　ＫＨｔＩ’０４．０　、　ｏ　ｒ　
’ｂ　（Ｗ　／　Ｖ　）　狗ＳＯｑ　−ｏ　、　ｏ　３
４　（Ｗ／Ｖ　）Ｂ！！＄ス及びｔ　ｏ％ｃＷ／Ｖ）食
塩を含有する液体培地（ｐＨ２，θ）を１２０℃で７０
分間加熱殺菌したも９コ！を入れ。

該培地に２マルト工キス斜面培養培地より採取したアス
ペルギルス・ソーヤＩＡＭニア０３の胞子懸濁液を接種
（胞子数：／、０ｘ１０６／蛯）シ。

３０°Ｃ−通気量ｌＶ、Ｖ、Ｍ、　、攪拌数３０　Ｏｒ
、ｐ＊ｍ＋＋で培養を開始した。なお−培養途中のｐＨ
は、　Ｊ−ＮのＨ２ＳＯ，及び！ＮのＮａＯＨを用いて
常時７　、ＯＫ保持される様に調整を行なった。

培養開始後、４ｔ、ｒ時間経過した時点（増殖末期）よ
り、該培養液に、蛋白質原料を含む液体培地〔７、ｏ％
　（Ｗ／Ｖ　）分離大豆蛋白、０．３％（Ｗ／Ｖ　）　
ＫＨ２ＰＯ４，０、ｊ　％　（Ｗ／Ｖ　）　可溶性殿粉
。

ｏ　、Ｏｔ％（Ｗ／Ｖ）ＭｇＳＯ４，ｏ　、　０３％（
Ｗ／Ｖ）酵母エキス、１０％（Ｗ／Ｖ）食塩を含有する
液体培地（ｐＨ２，０）を、／２θ０Ｃで１０分間加熱
殺菌したもの〕を希釈率Ｏ０θ２（Ｖ／Ｖ・ｈｒ　）で
連続的に添加しつつ、温度３０°Ｃ１培養液のｐＨ７、
０−通気量／　Ｖ−Ｖ−Ｍ、　攪拌数＜ｔ　Ｏｏ　〜乙
００　ｒ、ｐ、ｍ、で培養し〔培養開始後３日目以降の
培養液中の糖濃度はｏ、ｏｏｓ〜０．０３０％（Ｗ／Ｖ
　）、　窒素ｅ４にハｏ　、　０９〜ｏ　、　／　２％
　（Ｗ／Ｖ）Ｌ該ジャーフ了メンタ−の取出口より一連
続的に添加した蛋白質原料を含む液体培地量と同容量の
プロテアーゼ含有培養液を連続的に得た。

このようにして得られた培養液のプロテアーゼ力価を第
４表に示す０第　　　　　４　　　　　表実施例　２３！容＠醪槽に、０．７ｊ係（Ｗ／’ｌ可溶性殿粉、／
、３３％（Ｗ／Ｖ）ポリペプトン、Ｏ０！％　（Ｗ　／
　Ｖ　）　ＫＩ−（ｔ’ＰＣ）＜、　０−３％　（Ｗ／
　”　）　”ｇＳ０４゜０．０３％（Ｗ／Ｖ）酵母エキ
スを含む液体培地（ｐＨｇ、ｔ）を７２０℃でｉｏ分間
加熱殺菌したもの／、ＯＪを入れ、該培地に、マルトエ
ギス斜面堵養培地より採取したアスペルギルス・オリゼ
ーＩＡＭコロ０９の胞子懸濁液を接種（胞子数：／　、
　２　Ｘ　／　０６／　ｍｌ　）　Ｌ、　３０　’Ｃ，
通’Ｊ　ｉ　／　Ｖ−Ｖ、Ｍ、。

攪拌数ｊ　００　’ｒ、ｐ、ｍ、で培養を開始した。な
お−培養中のｐＨは、Ｊ−ＮのＨ，Ｓｏ、を用いて常時
乙、！程度に保持される様に調整を行なった。

培養開始後、２２時間経過した時点（増殖末期）より、
該培養液に、蛋白質原料を含む液体培地〔ｉ、ｒ％（Ｗ
／Ｖ）脱脂大豆粉末、θ、りｊ係（Ｗ／Ｖ）　可ｇ性殿
粉、　ｏ　、　ｒ　％　（Ｗ／　Ｖ　）　ＫＨｔＰＯ。

Ｏ，ｔ％（Ｗ／Ｖ）ＭｇＳＯ４，０，０３％（Ｗ／Ｖ）
酵母エキスを含有する液体培地（ｐＨ＋、ｔ）を７２０
℃で１０分間加熱殺菌したもの〕を、シリコンチューブ
を通じ／　ｏ　ｔｕｔ　／　ｈｒの供給速度で供給しつ
つ、温度３０℃、培養液のＰＨ７、ｏ、通気量／　Ｖ、
Ｖ、Ｍ、、攪拌数４ｔｏ　ｏ−ｔ　ｏ　ｏ　ｒ、ｐ、ｍ
、で該心算槽内で３日間培養し〔層養培地中の糖濃度は
ｏ、ｏｏＪ−〜０．θ４ｔＯ％（Ｗ／Ｖ）、　窒素濃Ｆ
ｌハｏ　、　０７〜ｏ　、　１２％　（Ｗ／Ｖ　）　）
プロテアーゼ含有培養液を得た。このようにして得られ
た培養液のプロテアーゼ力価は６００　ｐ、ｔＪ、／　
ｍｌであったＯ実施例　３ＪＪ容＋’！Ｉ酵槽に、ｏ　、りｔ％（Ｗ／Ｖ）可ｇ性
殿粉、／、３３％（Ｗ／Ｖ）ポリペプトン、Ｏ０！４　
（Ｗ／Ｖ　）　ＫＨ，ＰＯ２，０、ｊ　％　（Ｗ／Ｖ　
）　ＭｇＳＯ４゜ｏ　、　ｏ　３％　（Ｗ／Ｖ　）酵母
エキスを含む液体培地（ｐＨｔ　、　ｊ　）を１２０℃
で１０分間加熱殺菌したもの／、ＯＬを入れ、該培地に
、マルトエキス斜面培養培地より採取したアスペルギル
ス・オリゼーＩＡＭコロ０９の胞子懸濁液を接種（胞子
数：ｔ　、、、２Ｘ／　ｏ６／ｌｕｇ）ｔ、、　Ｓｏ°
Ｃ，ａ気量ｉ　Ｖ、Ｖ、Ｍ、。

攪拌数ｊ　００　ｒ、ｐａｍ＋＋で培養を開始した。な
お、培養中のｐＨは、！ＮのＨ，Ｓｏ４を用いて常時乙
、！程度に保持される様に調整を行なった０培養開始後、クコ時間経過した時点（増殖末期）で、該
培養液に、蛋白質原料を含む液体培地〔ハ！％　（Ｗ／
Ｖ　）　脱脂大豆粉末、　ｏ　、　７３％　（Ｗ／Ｖ　
）可溶性殿粉、Ｏ８！係（Ｗ／Ｖ　’）　Ｋ１（２ＰＯ
１，０、３％　（Ｗ／Ｖ　’）　ＭｇＳＯ４，０、ＯＪ
％　（Ｗ／Ｖ　）Ｉｔ母エキスを含有する液体培地（ｐ
Ｈｔ　、　ｓ　）を１２０℃でｉｏ分間加熱殺菌したも
の〕をｌコθｍＢ添加し、その後７２時間毎に／コＯｒ
ｎｌづつ加え、温度３０°Ｃ，Ｎ　養Ｗ　ノｐＨ７、０
，通気量／Ｖ、Ｖ、Ｍ、、攪拌数グθＯ−≦００　ｒ、
ｐ、ｍ、で該醗醪槽内で３日間珊養し〔培養培地中の糖
濃度は０．００／〜０．０！θ％（Ｗ／Ｖ　Ｌ、　窒素
８１度＆ｔｏ　、　ｏ　ｑ　〜ｏ　、　ｔ　ｓ％（Ｗ／
Ｖ））プロテアーゼ含有層養液を得た。このようにして
得られた培養液のプロテアーゼ力価はＪ−ｔ　ｏ　Ｐ、
Ｕ、／屁であった。

実施例　４３ノ容ジヤーフアメンターに、７．０％ＣＷ／■）ポリ
ペプトン、０．６幅（Ｗ／Ｖ）殿粉、０１５％（Ｗ／Ｖ
　’）　ＫＩ（、ＰＯ４−０、０ｊ　％　（Ｗ／Ｖ　）
ＭｇＳＯ４゜０　、０　、？　’Ｇ　（Ｗ／　Ｖ　）　
Ｍｌ　母エキス及ヒ／　０　％　（Ｗ／Ｖ）食塩を含有
する液体培地（ｐＨ７，０）を７２０℃で７０分間加熱
殺菌したものコ！を入れ、該培地に、マルトエキス斜面
培養培地より採取したアスペルギルス・ソーヤＩｋＭ２
２ｏ３の胞子懸濁液を接種（胞子数：／　、０Ｘ１０’
／ｒｒｌｔ）シ、ｊθ０Ｃ１通気量ｔ　Ｖ、Ｖ、Ｍ、、
攪拌数−５′００　ｒ、ｐ、ｍ、テｊｇ　ａを開始した
。なお、珊養途中のｐＨは、ｔＮのＨ２ｓｏ４及びｔＮ
のＮａｐ（を用いて常時７．０に保持される様に調整を
行なった。

培養開始後、グ♂時間経過した時点（増殖末期）で、該
培養液４ｔ　００　ｒｒＬｌを取り出し口より取り出し
た後、速やかに培−養液に、蛋白質原料を含む液体培地
〔１，０％（Ｗ／Ｖ）分離大豆蛋白、Ｏ１１％　（Ｗ／
Ｖ　）　ＫＨ２ＰＯ，ｏ　、　ｒ％　（Ｗ／Ｖ　）　可
溶性膜ｍ−０、ｏｒ％　（Ｗ／Ｖ）　ＭｇＳＯ４，ｏ　
、　０３％（Ｗ／Ｖ　）　酵母：ｒ−＊ス、　／　ｏ％
（Ｗ／Ｖ）食塩を含有する液体培地（ｐＨ７，０）を、
１２０℃で７０分間加熱殺菌したもの〕を４ｔｏｏ酩加
えた０その後７２時間毎に前記操作を繰り返し行ないつ
つ一温ＦＩ　３０　’Ｃ，培養Ｒ（１”）　ｐＨ７、０
，通気量／　Ｖ、Ｖ、Ｍ、。

攪拌数４ｔ００−６００　ｒ、ｐ、ｍ、で培養し〔培養
開始後３日目以降の培養液中の糖濃度は０．θｏｉ〜ｏ
　、／　００％（Ｗ／Ｖ）、　窒素濃に＆’Ｌ　ｏ　、
　ｏ　、ｒ　〜０、ｌｊ係（Ｗ／Ｖ）］−］プロテアー
ゼ含有養液を断続的に得た。

このようにして得られた培養液のプロテアーゼ力価を第
５表に示す０

Claims

【特許請求の範囲】

プロテアーゼ生産能を有する糸状菌を液体培地に培養し
てプロテアーゼを製造するに際し、増殖末期以降におけ
る培養液中の糖濃度を０．１０％（Ｗ／Ｖ）以下、窒素
濃度を０．０６％（Ｗ／Ｖ）以上となるように、蛋白質
原料を含む液体培地を連続的もしくは断続的に加えて培
養することを特徴とするプロテアーゼの製造法。