JPS62242629A - 腫瘍壊死因子を含んで成る組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）及び／
又はインターフェロン−β（ＩＦＮ−β）及び腫瘍壊死
因子（ＴＮＦ）の組合わせ、並びに抗腫瘍治療剤として
のこの組合わせの使用に関する。

ｌ従来の技術〕 正常末梢血リンパ球により生産されそして植物レクチン
、抗原又は池の刺激剤への暴露の後抗原又はマイトジェ
ンにより刺激されたＴｌ胞の増殖な誘導するリンホカイ
ンであるインターロイキン−２は、Ｍｏｒ）（ａｎ　、
　Ｄ、＾０等、５ｃｉｅｎｃｅ（１９７６）　、　１９
３：１００７−１００８により最初に記載された。刺激
されたＴリンパ球の増殖を誘導するその能力のためにＴ
細胞増殖因子と呼ばれたが、現在ではこの増殖因子とし
ての性質に加えてインビトロ及びインビボで免疫系細胞
の種々の機能を調節することが認識され、インターロイ
キン−２（ＩＬ−２）と再命名されている。

ＩＬ−２は最初、ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）又は池
のＩＬ−２生産性セルラインを培養することにより製造
された。例えば、米国特許Ｎｏ。

４．４０１．７５６を参照のこと０組換ＤＮＡ技法はＩ
Ｌ−２の生産のためのＰＢＬ及びセルラインの代替物を
提供した。　Ｔａ＋＋ｉｇｕｃｈｉ　、　Ｔ、等、Ｎａ
ｔｕｒｅ（１９８３）　、　３０２　：　３０５−３１
０　；及び口ｅｖｏｓ　、　Ｒ，、Ｎｕｃｌｅｉｃ＾ａ
ｉｄｓ’　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ（１９８３）　、　１１　
：　４３０フー４３２３はヒトＩＬ−２３ｉ！伝子のク
ローニング及び微生物中でのその発現を報告している。

米国特許Ｎｏ、　４，５１８，５８４は、野性型又は天
然の分子の１２５位に存在するシスティンがセリン又は
アラニンのごとき中性アミノ酸で置き換えられているＩ
　Ｌ−２のミューティンを記載しそしてクレームしてい
る。クロラミンＴ又は過酸化物酸化に対して感受性の各
メチオニンがアラニンのごとき保存的アミノ酸により置
き攬えられている、生物学的に活性なＩＬ−２のごとき
酸化耐性を装造することができる。米国特許Ｎｏ、　４
，５３０，７８７及びＮｏ。

４．５６９，７９０は、組換天然型ＩＬ−２及びそのミ
ューテ、インの精製方法、並びに精製された形態のＩＬ
−２を開示しそしてクレームしている。

ＰＣＴ　ＷＯ３５／　０４３２８は、微生物的に生産さ
れた酸化された組換ＩＬ−２を含んで成る、医薬として
許容される水性ビヒクル中に再溶解するために適当なＩ
Ｌ−２組成物を開示している。ＩＬ−２は、悪性疾患又
は前−悪性疾患治療における細胞毒性化学療法らしくは
照射又は外科手術との組合せにおいて直接療法的に又は
アジュバントとして、あるいは池の免疫調節剤、天然に
存在するリンホカイン類（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２
、Ｃ３Ｆ−１及びＩＦＮＴ：［）、又は悪性疾患の治療
における誘導性抗−細胞毒素との組合せにおいて有用で
あると記載されている。

Ｓ、　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ及び共同研究者（Ｍｕｌｅ等
、Ｓｃ　１ｅｎｃｅ　”（１９８４）　、　２２旦：１
４８フ；及びＳ、　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ等、町！Ｅｎ　
１ａｎｃｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
（１９８５）　、　３１３　：　１４８５−１４９２を
参照のこと〕によりヒトＩＬ−２の種々の療法的適用が
研究されそして報告されている。

インターフェロン（ＩＦＮ）は、抗−ウィルス、抗−癌
及び免疫調節挙動を示すことが知られている天然蛋白質
の一群を構成する。ＩＦＮの２つのタイプ、すなわち夏
型及び■型が、それらの観察された生物学的性質及び分
子構造の差異に基いて同定されている。β−インターフ
ェロン（ＩＦＮ−β）は、ウィルスのチャレンジにより
繊維芽細胞中で誘導され得、そして約１６５個のアミノ
酸を含有する夏型インターフェロンである。ＩＦＮ−β
は白血球中で誘導される■型ＩＦＮであり、そしてＩＦ
Ｎ−γは特異的マイトジェン刺激に反応してリンパ球中
で誘導されそして１４６個のアミノ酸を含有する■型Ｉ
ＦＮである。

ヒトＩＦＮ−βは、例えば５ｕＨａｎｏ等の１９８１年
６月６日に公開されたＥＰ　２８，０３３、及びＲｅｖ
ｅ　Ｉ等の１９８１年６ｆロ０日に公表された英国特許
Ｎｏ。

２０６３　、８８２に記載されている様にして、ｆｆ１
ｆ＊ＤＮＡ技法により製造することができる。さらに、
ＩＦＮ−βは、米国特許Ｎｏ、　４，５８８，５８５に
記載されている様に、生物学的活性に必須でないアミノ
酸が他のアミノ酸に置き換えられて安定性が増大してい
るミューティンであってもよい。マウスＩＦＮ−βもま
た組換ＤＮＡ技法により製造することができる。

Ｐａｕｃｋｅｒ等、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　、　１７　：　
３２４−３３４（１９６２）によりＩＦＮがマウスＬ細
胞の増殖速度を抑制することが示された後、多くの研究
者がＴＦＮによるマウスＬ細胞の処理、及びＩＦＮによ
る腫瘍細胞増イ（の阻害を研究した０例えば［！ｏｒｄ
ｅｎ、Ｅ、　Ｃ，。

Ａｎｎ、　Ｉｎｔｅｒｎ、　Ｍｅｄ、、　９１　：　４
７２−４７９（１９７９）を参照のこと。

腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は最初Ｃａｒｓｗｅ　ｌ　１等
、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）　（１９７５）　、　７２　：　
３６６６−３６７０ニより、マウス中で増殖する場合に
化学的に形質転換された腫ｆ′Ｆ、細胞の壊死を惹起す
る、エンドトキシンにより誘導される血清因子として記
載された。ネズミＴＮＦの情製された調製物がネズミ及
びヒトセルラインに対してインビトロで試験されている
。Ｋ、ＩＩａｒａｎａｋａ及びＮ、Ｓａｔｏｍｉ　、　
Ｊａｐａｎ　、ｊ、旦ｘｐ、Ｍｅｄ、　（１９８１）　
、　５１　：１９１゜正常細胞とは異り、両押からの腫
瘍セルラインはマウスＴＮＦの細胞毒性活性に感受性で
あった。さらに、ネズミＴＮＦはヌードマウス中のヒＩ
・及びマウスの移植された腫瘍に対して毒性であると報
告された。Ｋ、ｌ１ａｒａｎａｋａ等、Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃ
ａｎｃｅｒ（１９８４）　、　３４　：　２６３−２６
７゜ヒトＴＮＦも新生物細胞に対して毒性であることが
知られており、そして組換形でＶ！遺されている。Ｐｅ
ｎｎ１ｃａ等、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）　、　３−１
２　：　７２４−７２９　；　５ｈｉｒａｉ笠、ｂハリ
（１９８５）、　３１３　：　８０３−８０６　、及び
ｌ１ｌａｎＨ等、５ｃｉｅｎｃ。

（１９８５）　、　２２す：　１４９−１５４ｔｒ−参
照のこと。

ラビッｌ−Ｔ　Ｎ　Ｆのクローニングが、１９８５年６
月２６日に公開されたＥＰ　１４６，０２６（大日本製
薬）及び１９８５年７月１７日に公開されたＥＰ　１４
８，３１１　（旭化成工業）に開示されている。１５１
個及び１５５個のアミノ酸（天然型より２個及び６個少
ない）を有するヒト　Ｔ　Ｎ　Ｆのクローニングが１９
８５年９月２５日に公開されたＥｌ’　１５５，５４９
（大日本製薬）に開示されており、そして１５５個のア
ミノ酸を有するヒ？−Ｔ　Ｎ　Ｆが１９８５年１０月１
６日に公開されたＥＰ　１５８，２８６及び１９８５年
１１月２０日に公告された対応するＧ［１２，１５８，
８２９Ａに開示されている。成熟Ｔ　Ｎ　Ｆ　（１５７
個のアミノ酸）及びその種々の修飾形（ミューティン）
が１９８６年１月１５日に公開されなＥＰ　１６８，２
１４（ゼネンテック）及び１９８５年１０月３日に出願
されそして１９８６年４月に公ｆｍ　サｔＬすＰＣＴ　
ＵＳ８５／　０１９２１　＜シ９　Ｘ　・：７−ボレイ
ション）に開示されている。

ヒトの悪性腫瘍を治療するために２種類又はそれより多
くの抗癌剤を使用する組合せ療法が現在研究及び臨床に
おいて使用されている。抗癌剤は抗代謝剤、アルキル化
剤、抗生物質、一般毒等であることができる。はとんど
の癌、例えば癌腫、黒色腫、リンパ腫及び肉腫に対する
相乗効果を得るため、並びに薬剤耐性細胞の出現を低下
せしめ又は除去するため及び各薬剤に対する副作用を減
少ぜしぬるために、１つの試みとして薬剤の組合せが投
手される。

相乗的な生物学的効果を得るために■型インターフェロ
ン及び■型インターフェロンを組合わせることが知られ
ている。例えば、Ｆｌｅｉ’ｓｈｍａｎ。

Ｗ、Ｒ，、Ｃａ−ｎ、ｃ、ｅｒ　Ｒｅｓ、（１９８２）
　、　４Ａ：　８６９−８７５及びＤｅＣｌｅｒｃｑ　
　、Ｅ、　　等、　Ｃａｎｃｅｒ　　Ｌｅｔｔｅｒｓ（
１９８２）　　、１５　：２２３−２２８　（マウスＩ
ＦＮ）、並びに１９８４年５月２日に公開されたヨーロ
ッパ特許出願公開１０７，４９８（ヒｔ−ＩＦＮ−γ及
びＩＦＮ−α又は−β）を参照のこと。Ｍａｒｋ等（シ
タス・コーポレイション）の米国特許Ｎｏ、　４，５１
８，５８４は、Ｉ　Ｌ−２ミユーテインとγ−インター
フェロン、Ｂ細胞増殖因子、及びＩＬ−１との組合せを
開示している。さらに、■し−２がＩＦＮ−γと共に、
腫瘍担持宿主を治療するために、相剰的結果をもって（
１９８５年７月２４０に公開されたヨーロッパ特許出願
Ｎｏ、　１４９，５５１（ゼネンテック）及び１９８５
年１０月３１日に公開された独国特許出願公開Ｎｏ、　
３４１１１８４（プント・ロテン・クロイツェス）〕、
又はナチュラルキラー活性の性の増強をもって［５ｖｅ
ｄｅｒｓｋｙ等、Ｊ、ｌｎｍｕｎｏｌ。

（１９８４）　、　１３３　：　７１４−７１８、及び
５ｈａｌａｂｙ等、しＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　Ｒｅｓ、
（１９８５）　、　５　：　５７１−５８１　）使用さ
れることが開示されている。しかしながら、Ｌｏｐｅｚ
　−Ｂｏｔｅｔ等、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、
　（１９８４）　、　１４　：　１１３７−１１４１は
、ヒトＴ細胞クローンにおいてナチュラルキラ一様活性
を誘導するためにＩＬ−２及びＩＦＮ−γの組合せは十
分でないと報告した。

さらに、Ｄｅｍｐｓｅｙ等、Ｊ、Ｉｍｍｕｎ、（１９８
２）　、　１２旦：　２５０４−２５１０から、ナチュ
ラルキラー細胞の活性化の惹起においてＩＦＮ−α又は
ＩＬ−２単独よりもＩＦＮ−α及びＩＬ−２の組合せが
より効果的であることが知られる９さらに、Ｐｒｅｃｌ
ｉｎｉｃａｌ　Ｓｃｒｅｅｎ−ｉｎｇ　Ｌａｂ、　、　
ＢＲＭＰのＴａｌ＋ｓａｇｅ博士は１９８６年に、マウ
スにおける転好疾患を治療するためにＴＮＦ及びＩＦＮ
−γを使用する効果の増強を報告した。

１９８５年１月２３日に公開されたＥＰ　１３１，７８
９　（スローンケッタリングインスティテユート・フォ
ア・キャンサーリサーチ）、及び１９８６年１月１５日
に公開されたＥＰ　１６８，２１４（ゼネンテック）は
マウスにおける種々の腫瘍を治療するためのＴＮＦ及び
ＩＦＮ−γの相乗効果を開示している。１９８５年６月
２０日に公開されたＥＰ　１７０．８４３は、癌の増殖
に対するＴＮＦとＩＦＮ−α、−β及び／又は−γとの
相剰効果を開示している。さらに、ヒトＴＮＦ及びヒト
Ｉ　Ｆ　Ｎのインビボ効果について、Ｗｉｌｌｉａｍｓ
ｏｎ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、　（
１９８３）５０　：　５３９７−５４０１を参照のこと
。

腫瘍担持動物に対するＩＬ−２及びＴＮＦのみ、又はこ
れらとＩＦＮ−βとの組合せの効果は研究されていない
。

〔本発明の説明〕

従って、この発明は、ＴＮＦ及びＩＬ−２及び／又はＩ
ＦＮ−β（ここで、ＴＮＦ、ＩＬ−２及びＩＦＮ−βは
哺乳類種に由来する）の混合物の相乗的有効果を含んで
成る癌の治療のために１甫乳類宿主に非経口的又は皮下
投与するために適当な組成物に関する。

他の観点において、この発明は、ＴＮＦ及びＩＬ−２及
び／又はＩＦＮ−β（ここで、ＴＮＦ、ＩＬ−２及びＩ
ＦＮ−βは哺乳類種に由来する）の相乗的有効果を宿主
に投与し、ＴＮＦ及びＩＬ−２を逐次的に投与する場合
にはＩＬ−２の投与の前にＴＮＦを投与する、ことを含
んで成る哺乳類宿主における癌の治療方法を提供する。

好ましくはＴＮＦはラビット又はヒトＴＮＦであり、そ
してＩＬ−２はヒトＩＬ−２であり、そしてＩＦＮ−β
はヒト又はマウスＩＦＮ−βであり、そしてすべての蛋
白質は微生物的に組換生産された蛋白質である。

ＩＬ−２とＴＮＦとの組合せが、黒色腫、白血病、肥満
細胞腫、及び肺癌のごとき種々の形の癌の治療において
驚くべき相乗作用を提供することが見出される。

この明細書において使用する場合、′°治療°”なる語
は、患者が癌を有するとなんらかの手段により決定され
た後の、ＩＮＦとＩＬ−２、ＴＮＦとＩＦＮ−β、又は
ＴＮＦとＩＦＮ−βとＩＬ−２の患者への投与に関する
。処置の後に腫瘍が現われるか、又は存在する腫瘍負荷
が低下もしくは除去されない場合、その処置は療法的で
はないと考えられる。投与の効果は時間と共に低下し、
腫瘍が可視的となった後５〜７日が治療を与えることが
できる最大期間であり、主として腫瘍のタイプ及び投与
量に依存する。

この明細書において使用する場合、“癌”なる語は、あ
らゆる新生物疾患に関し、これには細胞性疾患を包含し
、例えば腎細胞癌、カポシ（Ｋａｐｏｓｉ）肉腫、慢性
白血病、乳癌、肉腫、卵巣癌、直腸癌、咽喉筋、黒色腫
、結腸癌、膀胱癌、肥満細胞腫、肺癌、及び胃腸又は胃
癌を包含する。好ましくは、癌は白血病、肥満細胞腫、
黒色腫及びリンパ腫である。

この明細書において使用する場合、ＩＬ−２及びＴＮＦ
に適用される“相乗的有効量”なる語は、宿主の生存の
ために有効であり、そしてＴＮＦの投与量対ＩＬ−２の
投与量対宿主の生存の投与量一応答プロットにおいてＴ
ＮＦ投与量軸及びＩＬ−２投与量軸のいずれとも交差し
ない混合物中の各成分の量に関する。同じことがＴＦＮ
−β及びＴＮＦにもあてはまる。ＩＦＮ−β、ＩＬ−２
及びＴＮＦがすべて存在する場合、３度分のために３軸
が使用される。この発明において相乗性を決定するため
に使用される投与応答曲線は、５ａｎｄｅ等、ｔｈｅ　
Ｐｈａｒｍ−ａｃｏｌｏ　１ｃａｌ　Ｂａ５ｉｓ　ｏｆ
　’ｊｈｅｒａｐ、ｅｕｔｉｃｓ、マクミラン出版、ニ
ューヨーク（１９８０）　、　１０８０−１１０５頁に
十分に記載されている。相剰作用決定のため、治癒は、
腫瘍を移植した日からＭｅｔｈ　Ａ腫瘍については１４
日後、そして他のすべての腫瘍については６０日後の宿
主の治癒として定義される。

最適相乗性は、９５％信頼限界を用いて、投与量レベル
、スケジュール及び応答のごとき因子を変え、そしてＩ
　Ｌ−２とＴＮＦ、ＩＦＮ−βとＴＮＦ、又はＩＬ−２
とＩＦＮ−βとＴＮＦとの種々の組合せについての応答
曲線からイソボログラムを生じさせるコンピューターに
より生じるモデルを使用することにより決定することが
できる。投与量応答曲線上の最高生存率は最適投与量レ
ベルと相関する。

この明１１１１書において使用する場合、“組換（体）
”なる語は組換ＤＮＡ技法により生産されたＴＮＦ、Ｉ
Ｌ−２及びＩＦＮ−βに関し、この技法においては一服
に、既知の組換ＤＮＡ技法によりＴＮＦ、ＩＬ−２又は
ＩＦＮ−３をコードする遺伝子がクローン化される。例
えば、ヒトＴＮＦ又はＩＬ−２のｃＤＮＡあるいはマウ
スＩＦＮ−βのｃＤＮＡを鋳型として使用してヒトＩＬ
−２又はＩＬ−２のｃＤＮＡあるいはマウスＩＦＮ−β
のｃＤＮＡに対する相補性を示す遺伝子を適当なりＮＡ
ベクター、例えば細菌プラスミド、好ましくはＥ、コリ
（［’、ｃｏｌｉ）プラスミドに挿入して組換プラスミ
ドを得、そしてこのプラスミドを使用して適当な宿主を
形質転換する。遺伝子を宿主中で発現せしめることによ
り組換蛋白質を得る。この目的のための組換プラスミド
の例にはｐＢＲ３２２、ｐＣＲｌ、２間９／及びｐＳＣ
ｌが含まれる。形質転換される宿主は真核性宿主又は原
核性宿主であり、好ましくは原核性宿主である。

この明細書において使用する場合、“医薬として許容さ
れる”なる語は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨
害せず、且つ投与される宿主に対して毒性でないキャリ
ヤー媒体に関する。

この発明の方法は、相乗的有効量のＴＮＦとＩＬ−２、
ＴＮＦとＩＦＮ−β、又はＴＮＦとＩＬ−２とＩＦＮ−
βを哺乳類宿主、好ましくはヒト宿主に投与することを
含む、ＩＬ−２及び／又はＩＦＮ−β及びＴＮＦは投与
前にインビトロで混合することができ、又は宿主に別々
に投与することができる。ＩＦＮ−β及びＴＮＦは同時
に又は一方の成分に続いて他方の成分を投与することが
でき、第二の投与は第一の投与が完了した後一般に約５
〜１０分間以内、好ましくは約５分間以内に行う、ＩＬ
−２及びＴＮＦを使用する場合、これらを同時に、又は
ＴＮＦに続いてＩＬ−２を投与することができ、第二の
投与は一般に第一の投与が完了した後に行う、ＴＮＦの
投与前のＩＬ−２の投与は相剰作用をもたらさず、そし
てＩＬ−２はそれに続＜ＴＮＦ処置に対する腫瘍の感受
性を低下せしめる。

投与は適当な技法、例えば皮下投与又は非経口投与によ
り行うことができる。非経口投与の例には静脈内投与、
動脈内投与、筋肉的投与及び腹腔内投与が含まれ、ネズ
ミのモデルを使用する場合には腹腔内投与が好ましい（
便宜上）。

投与量及び投与方法は主として、ＩＬ−２、ＴＮＦ及び
ＩＦＮ−βが別々に又は同時に混合物として投与される
か否か、癌のタイプ、患者、及び患者の病歴に依存する
であろう。量は腫瘍の相乗的な減少を達成するために効
果的なものでなければならない、投与は単一投与でも多
数回投与でもよい。多数回投与が用いられる場合、好ま
しくは、投与の頻度は例えば宿主のタイプ、癌のタイプ
、投与量等に依存するであろう。幾つかのタイプの癌又
は癌セルラインのためには毎日の投与が効果的であり、
他方他の癌のためには隔日投与又は３日に１度の投与が
効果的であるが毎日の投与は効果的でない。臨床医は任
意の特定のケースについて、いかなる投与経路及び投与
頻度が最も効果的であるかを日常の実験の後に確認する
ことができよう。

この発明において最も効果的であると思われる投与量は
腫瘍を出現させず又は完全に消失させ、そして宿主に対
して毒性でない量である。この最適レベルは多くの因子
、例えば宿主のタイプ、癌のタイプ、投与の経路及びス
ケジュール、存在する腫瘍負荷、ＩＬ−２、ＩＦＮ−β
及びＴＮＦのタイプ、並びに毒性の定義に依存するであ
ろう。

宿主に対する毒性は副作用の程度及びタイプにより、又
は一定時間後の体重の減少量もしくは死により定義され
る０体重の減少が毒性の基準である場合、典型的には１
０〜２０重量％の減少は許容され、２０％より大きな減
少が毒性であると考えられるであろう。２０％より多く
の体重の減少を毒性と考え、宿主がネズミでそして投与
経路がインビトロで調製される混合物の腹腔内投与であ
りそして毎日又は隔日投与であれば、微生物的に生産さ
れた組換ＴＮＦ及びＩＬ−２の各投与の投与レベルは、
宿主体重に、当り約２３０〜２６０μｇ（さらに好まし
くは約２５０μｇ）のＴＮＦ、及び宿主体重に、当り約
１５．０００〜１５，０００，０００ユニット（さらに
好ましくは１５．６００〜６２５，０００ユニット）の
ＩＬ−２であろう（ここで１０００ユニットは１μｇで
ある）。

非経口投与のため、ＩＬ−２、ＴＮＦ及びＩＦＮ−βは
一最に、好ましくは本質的に非毒性でありそして非療法
的である医薬として許容されるキャリヤー媒体中の単位
投与注射形（溶液、懸濁液、エマルジョン）に製剤化さ
れるであろう。この様なビヒクルの例には、塩溶液、リ
ンゲル溶液、デキストロース溶液、マンニトール、及び
正常血清アルブミンが含まれる。硬化油及びオレイン酸
エチルのごとき非水性ビヒクルを使用することもできる
。キャリヤー媒体は少量の添加剤、例えば等張性及び化
学的安定性等を増強する物質、例えばＭ街剤、並びに防
腐剤を含有することができる。

ＩＬ−２、ＴＮＦ及びＩＦＮ−βは典型的にはこの様な
キャリヤー中にそれぞれ約０．１ｍｇ／ｍ１〜１１００
ｔａ／ｒａ１の濃度、好ましくは各０．２〜１　ｍｇ／
　ｒｔｒｌの濃度で配合される。

この方法に代り、ＩＬ−２、ＴＮＦ及びＩＦＮ−βを無
菌の安定な凍結乾燥形に製剤化することができ、この製
剤中では精製されたＩＬ−２、ＴＮＦ及びＩＦＮ−βが
嵩を与えるマンニトールのごとき水溶性キャリヤー、並
びに組換ＩＬ−２及びＩＦＮ−βの水中への溶解性を保
証するのに十分な量のドデシル硫酸ナトリウムと混合さ
れている。この製剤は非経口投与のための水性注射液に
再溶解するために適当であり、そして安定でありそして
ヒトの患者においてよく許容される。製剤化方法はＰＣ
Ｔ　１０８５１０４３２８にさらに完全に記載されてい
る。

他の態様においては、ＩＬ−２及びＴＮＦの混合物は採
用される免疫療法において、医薬として許容されるキャ
リヤー中単離されたリンホカインで活性化されたリンパ
球と共に投与され、この場合リンパ球は、ＩＬ−２及び
ＴＮＦと共に腫瘍を有するヒトに投与された場合、腫瘍
に対して反応性である。この方法は、Ｓ、Ｒｏｓｅｎｂ
ｅｒｇ等、１Ｅｎ　１ａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９８５）　、　３１３　：　１４
８５−１４９２に記載されている。Ｓ、Ｒｏｓｅｎｂｅ
ｒｇ等、針ｊμ徂、　２３３　：　１３１８−１３２１
（１９８６）に記載された他の方法においては、ＩＬ−
２中で拡大された腫瘍インフィルトレート（ｔｕｔｏｒ
−ｉｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ）リンパ球（ＴＩＬ）が、特
にシクロホスファミドとの組合せにおいて、治療のため
に移送される。Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ等のＴＩＬ法も本発
明において使用することができる。

上記のように、この発明のＩＬ−２、ＴＮＦ及びＩＦＮ
−βは、組織培養から又は組換技法により、そして任意
の哺乳類源、例えばマウス、ラット、ラビット、霊長類
、ブタ、及びヒトから調製される任意のＩＬ−２、ＴＮ
Ｆ及びＩＦＮ−βであることができる。好ましくは、Ｔ
ＮＦはラビット又はヒトに由来し、さらに好ましくはヒ
トに由来し、ＩＦＮ−βはマウスに由来し、そしてＩＬ
−２はヒトに由来する。さらに好ましくは、ＩＬ−２、
ＩＦＮ−β及びＴＮＦは組換ＩＬ−２、組換ＩＦＮ−β
及び組換ＴＮＦである。組換ＩＬ−２は、Ｔａｎｉｇｕ
ｅｈｉ等、Ｎａｔｕｒｅ　、　３０２　：　３０５−３
１０（１９８３）及びＤｅｖｏｓ　、　Ｎｕｃｌｅｉｒ
　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　、　１１：４３０７
−４３２３　（１９８３）に記載されているように、天
然ヒトＩＬ−２遺伝子をクローン化し、そしてこれを形
質転換された微生物中で発現せしめることにより得られ
る。これは、野性型又は天然の分子の１２５位に通常存
在するシスティンが除去されているか又はセリンもしく
はアラニンのごとき中性アミノ酸により置き換えられて
いる、米国特許Ｎｏ。

４．５１８，５８４に記載のＩＬ−２ミユーテイン、あ
るいは野性型又は天然の分子の１０４位に通常存在する
メチオニンがアラニンのごとき中性アミノ酸により置き
換えられているＩＬ−’２ミューティンであることがで
きる。

好ましくは、ＩＬ−２は、ヒｆ−ｃＤＮＡ配列により、
又は５８位及び１０５位のシスティンのジスルフィド結
合を含む天然ヒトＩＬ−２のアミノ酸配列と少なくとも
実質的に同じアミノ酸配列を有しそして天然ヒトＩＬ−
２と共通の生物学的活性を有する蛋白質をコードするＩ
　Ｌ−２の変形されたヒトｃＤＮＡ配列により形質転換
された微生物により生産される未グリコジル化蛋白買で
ある。

アミノ酸配列の実買的同−とは、配列が同一であるか、
又は合成蛋白質と天然ヒトＩＬ−２との間の不都合な機
能的非類似性を惹起しない１又はそれより多くのアミノ
酸の変化（欠失、付加、置換）により異ることを意味す
る。このような性質を有するＩＬ−２蛋白質の例には、
Ｔａｎ１Ｈｕｃｈｉ等、Ｎａｔｕｒｅ（１９８３）　、
　３０２　：　３０５−３１０　；　Ｄｃｖｏｓ　、　
Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ（１９８
３）　、　１１　：　４３０７−４３２３　；ヨーロッ
パ特許出願公開Ｎｏ、　９１，５３９及び８８，１９５
　、並びに米国特許Ｎｏ、４，５１８，５８４、前掲、
により記載されているもの並びにＩ　Ｌ　−２ａｌａ＋
ｏ＜Ｓｅｒ＋ｚｓが含まれる。最も好ましくは、ＩＬ−
２は、最初の末端アラニンが除去されておりそして１２
５位のシスティンがセリン残基に置き換えられているｄ
ｅｓ−ａｌａ＋　−Ｉ　Ｌ　−２ｓｅｔ、□、ミューテ
ィン、並びに天然ＴＬ−２の最初の５個のＮ−末端アミ
ノ酸の少なくとも１個が欠けているＩＬ−２である。

ＩＬ−２は１９８６年２月１１日に発行された米国特許
Ｎｏ、４，５６９，７９０中に記載されている方法によ
り臨床的純度に精製することができる。

他の製剤において、ＩＬ−２は洗剤によってではなく、
ＩＬ−２をポリエチレングリコールホモポリマー又はポ
リオキシエチル化ポリオールから選ばれた活性化された
ポリマーと反応ぜしめることによって可溶化される。ポ
リマーは好ましくは３００〜１００，０００ダルトン、
さらに好ましくは３５０〜４０．０００ダルトンの分子
量を有する。このポリマーは、ＩＬ−２のアミノ基又は
チオール基及びホモポリマーのヒドロキシ基の両者と反
応する末端基を有するカップリング剤との接合により活
性化される。このようなカップリング剤の例にはヒドロ
キシベンゼンスルホン酸エステル、シアヌル酸クロリド
、及びＮ−ヒドロキシサクシンイミドが含まれる。この
修飾により、生理的ｐＨにおいてＩＬ−２を可溶可する
なめに洗剤を添加する必要がない０次に、インターロイ
キンを水溶性キャリヤー及びＭ街液と上記のように配合
し、そして配合物を凍結乾燥し、そして凍結乾燥された
混合物を上記のように再溶解する。

この発明のＩＦＮ−βは、Ｍｅｔｚ　、　％勧」よ、　
１０　：　１０１−１５６により教示されるように、ウ
ィルス又は二本鎖ポリリボヌクレオチドのごときインタ
ーフェロン誘導剤に暴露された細胞により自然に生産さ
れる。ＩＦＮ−βはまた、１９８１年６月６日に公表さ
れたＥＰ　２８，０３３により開示されている方法のよ
うな組換手段によっても製造される。

ＩＦＮ−βのミューティンはまた、米国特許Ｎｏ。

４．５８８，５８５に記載されているようにしても製造
される。特に、好ましいＩＦＮ−βミューティンは、グ
リコジル化されておらず、Ｎ−末端メチオニンを欠き、
そして天然ＩＦＮ−βの１７位のシスティン残基が部位
特異的変異誘発によってセリンで置き換えられているＩ
ＦＮ−β５ｅＳ１７である。

ＩＦＮ−βは米国特許Ｎｏ、４，４６２，９４０に記載
されている方法によって製造することができる。

さらに、この発明の好ましいＩＦＮ−βであるマウスＩ
ＦＮ−βは既知の組換技法により製造することができる
。

組換ヒトＴＮＦは、Ｐａｎｎ１ｃａ等、Ｎａｔｕｒｑ−
（１９８４）　。

３１２　：　７２４−７２９　；　Ｙａｍａｄａ等、Ｊ
、［ｌｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏＨ（１９８５）　、　３　
：　１４１−１５３　；　ＷａＢ等、５ｃｉｅｎｃｅ（
１９８５）　４■８　：　１４９−１５４　；　１９８
５年９月２９日に公開されたＥＰ１５５．５４９　；　
１９８５年ｌＯ月１６日に公開されたＥＰ　１５８，２
８６゜１９８６年１月１５０に公開されたＥＩ）　１６
８，２１４　、及び１９８６年４月ニ公開さｉりＰＣＴ
　ＵＳ８５１０１９２１に記載されている様にして得る
ことができる。組換ラビッｌ−Ｔ　Ｎ　Ｆは、１９８５
年６月２６日に公開されたＥＰ１４６．０２６、及び１
９８５年７月１７日に公開されたＥＰ１４８．３１１に
記載されている様にして製造することができる。好まし
くは、ＴＮＦは最初の８個のアミノ酸残基が除去されて
いるヒトＴＮＦであるか、又はＴＮＦは米国特許Ｎｏ、
４，５１８，５８４に記載されているのと同様にしてｙ
Ｊ製されたシスティンが除去されたミューティンである
。

この発明の種々の観点を次の例によってさらに記載する
が、これによりこの発明の範囲を限定するものではない
。これらの例においては、特にことわらない限り、固体
についてのすべての重量により、そして液体及び気体の
すべての％は容量により、そしてすべての温度は℃で示
す。

例１゜ Ａ、二求ｌμｕ１ マウス 雌性Ｂ　Ｄ　Ｆ　１　、Ｃ５７Ｂ１及びＢａ１ｂ／ｃ？
ウス並びにＣＤラットをインビトロ試験に使用した。マ
ウスは処置群（５又は１０匹）が平均２０ｇ±３ｇとな
る様に体重を一致させそしてランダム化した。すべての
動物を検疫観察のため到着ｔ＆７日間保持し、マイクロ
アイソレーターケージに保持し、そして水を自由に取ら
せながら標準実験室飼料を供与した。

ＩＬ−２ この例において使用した組換ＩＬ−２は−ａｎｇ等、５
ｃｉｅｎｃｅ（１９８４）２２４　：　１４３１−１４
３３により記載されている。ｄｅｓ　　ａｌａ＋　　Ｉ
　Ｌ　　２ｓｅｒ１２５である。このＩＬ−２のアミノ
酸配列は、天然分子の最初のアラニンを欠いておりそし
て１２５位のシスティンがセリンに変っている点におい
て天然ヒトＩＬ−２のアミノ酸配列と異る。このＩＬ−
２を生産するＥ、コリのサンプルはシタス・コーポレイ
ションによりアメリカン・タイプ・カルチュア・コレク
ション、パークラウンドライブ１２３０１　、ロックビ
ル、　Ｍｄ　、米国に１９８３年９月２６日に受託番号
Ｎｏ。

３９．４５２として寄託され、そして１９８４年３４６
日受託番号Ｎｏ、　３９，６２６としてブタベプト条約
に基き寄託された。

ＩＬ−２はＴＣＴ　Ｈ０８５１０４３２８の明細書及び
第１図に記載されている様にして処理しそして精製した
。但し、０−ヨードソベンゾエートによってではなく米
国特許Ｎｏ、４，５７２，７９８に記載されている様に
して塩化銅を用いて酸化を行った。ＩＬ−２をクロマト
グラフィ一段階から回収した時、これを凍結乾燥し、そ
してＩＬ−２を還元状態に保つなめに還元剤（ＤＴＴ）
を含有しそしてそれを溶液状に保つために可溶化剤を含
有する中性水性ＨＨＲ液中に再懸濁した。クロマトグラ
フィ一段階後の組換ＩＬ−２の純度は９５％以上であり
、そしてこのＩＬ−２はリムナス試験により決定した場
合的０．０２ｎｇ／ｍｌ’未満のエンドトキシンを含有
した。

精製されなＩＬ−２（３〜５Ｘ１０’ユニット／ｍｇ）
を無菌バイアル中の凍結乾燥粉末として製造し、そして
使用前４日以内に無菌リン酸！！Ｗ化塩を用いて再溶解
し、そして５０ｍｇ／ｍＮマンニトールを伴う０．３ｍ
ｇ／ｍ１の濃度に製剤化した。

これに代る製剤においては、Ｎ−ヒドロキシサクシンイ
ミドを用いて接合体化されたポリエチレングリコールと
の反応によりＩＬ−２を製剤化した。接合体にされた蛋
白質（ＩＬ−２−ＰＥＧと称する）を水中に直接製剤化
した。

ＴＮＦ Ｎ−末端から最初の８個のアミノ酸が除去されているヒ
トＴＮＦのミューティンを、Ｈａｎｇ等、Ｓｃ　１ｅｎ
ｃｅ（１９８５）２２旦：　１４９−１５３により記載
されている様にしで調製した。要約すれば、ＴＮＦをＨ
Ｌ−６０Ｊａ胞から誘導し、精製しそして配列決定した
０次に、富化されたｍＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡライブ
ラリーを造成し、プローブを選択し、そして該ライブラ
リーをプローブして配列を回収することによりヒトＴＮ
Ｆをコードするイントロンを含まない配列を調製した０
次に、成熟蛋白質のＮ−末端バリンをコードするＧＴＣ
のすぐ前に部位特異的変異誘発によりＡＴＧ開始コドン
を導入しな。クローンを選択し、そして鎖を発現ベクタ
ーに連結してミューティンの原核性発現を得た。次にミ
ューティンをカラム精製し、精製緩衝液中に回収し、そ
して無菌バイアル中凍結乾燥粉末として得た。最後に、
使用前４日以内にこれを無菌リン酸１１１８化塩溶液を
用いて再溶解し、４℃にて貯蔵した。このＴＮＦは、製
造ロットに依存してｏ、ｏｏｔ〜０．００６ｎｇ未満の
エンドトキシン／蛋白質を有していた。

乳−ｔｔＩ、−５４７ 使用した標的細胞はネズミ腫瘍Ｌ　１２１０（白血病）
、Ｐ３８８（白血病）、Ｐ８１５（肥満細胞腫）、及び
ＥＬ−４（リンパ腫）（これらはいずれもアメリカン・
タイプ・カルチュア・コレクション、ロックビル、ＭＤ
から得られる）、並びにＦｉｄｌｅｒセルラインの１０
回のインビボ継代及びインビボ継代によって得られるＦ
ｉｄｌｅｒラインＦ１０（黒色腫ネズミセルライン）の
サブクローンでありそしてＷｉｎｋｅｌｈａｋｅ等、す
１鱈Ｌ」川、　（１９７９）担：　３０５８−３０６４
により記載されている口１６ＷｌＯ（黒色腫）である。

すべてのセルラインは、移植の直前に凍結ストックから
組織培養（３７℃、８％ＣＯ□、１０％ウシ胎児血、清
及び２ｍＭ　　Ｌ−Ｇｌｎを含有するＲＰＭｌ　１６４
０培地中）を２回通してた。すべての腫瘍及びセルライ
ンはマイコプラズマ及びマウス抗−ウイルス抗体生産に
ついての試験において陰性であった。

皮下−Ｍ１組セ引 腫瘍細胞を培養懸濁液又はモルレーヤーから収得した。

皮下腫瘍のため、細胞（５ｘｌＯ５〜１０６）を肩甲骨
上領域に注射した。腹腔内（ｉｐ）腫瘍のため、１０５
細胞をマウスに接種しな、　８１６Ｗ１０黒色腫静脈内
注射（肺、ｉｖ）転移モデルのため、細胞をトリプシン
−ＥＤＴ＾を用いて組織培養プレートから取り出し、リ
ン酸緩衝化塩溶液中で２回すすぎ、そして１０４ａ胞を
０．２ｍｌの容量で側圧静脈に注射した。マウスがいず
れのリンホカインによっても処置されなかった場合、ｉ
ｐ、　ｉｖ又はｓｑのいずれの場合にも、接種後２０〜
３０日以内にすべて死亡した。

実ｌリハＬ 投与当り５匹のマウスから成る群を使用した。

但し、８１６Ｗ１０　　ｉｖモデルについては群サイズ
を１０とした。動物は特にことわらない限り０日に腫瘍
チャレンジを受け、そしてすべての処置はｉｐであり、
腫瘍チャレンジの後爪された日に始め、そして１日１回
、１４日間続けた。皮下モデルについては、各実験を通
じて同じ測定により直交する三方向において直線キャリ
バスを用いて腫瘍を測定した。この技法を適用する場合
個体間の差が存在したが、同じ個体により行われた反復
測定は５％未満の誤差を示した。検討されたすべての腫
瘍は約２ｃｍ’の体積に増殖することが許容され、この
点からその後の測定が困難となり、動物を殺した。

ｉｐ腫瘍については、動物を毎日生存について観察した
。試験されたすべての腫瘍は移植の約３０日以内にネズ
ミにとって致死的となるので、延命の観察を６０日間以
上行った。

ｉν投与されたＢ１６モデルについては、細胞接種の後
１７〜２１日で動物を殺し、そして肺コロニーを計数し
た。

１、周一１ １、第１表は、ＴＮＦ単独、ＩＬ−２単独、及びＴＮＦ
とＩＬ−２との種々の混合物（インビトロ調製されたも
の）をマウス体重１ｋｇ当り示された址で、２Ｘ１０’
のＰ８１’Ｊｌ胞をｓｑ移植された群当り５匹の雌性Ｂ
Ｄ２Ｆ１マウスに、腫瘍の移植の後１日日から始めて２
０日間続けて１日１回投与した。対照にはＰＢＳのみを
２０日間にわたり毎日１回注射しな。

表中、゛触知″は触知可能な腫瘍を意味する。

以下余白 第−１−人 ００２６偏２１５０　　齢苓詩 ０　　３９．０６２　　　３触知　　ずべて　２９００
　　　大きすぎて触　知　　　　　　測定できず ０　　１５６．２５０　　　３触知　　すべて　２００
５　　　奈朶苓γ手触知 ０　　６２５．０００　　　１触知　　すべて　１２５
０　　　　５６７５角蜘 ５０　　　　０　　３触知　　すべて　３３００　　　
大きずぎ触知 ２５０００触知　０触知　１触知　　１，７６９５０　
　　６２５．０００　　　　　０角蜘　　　２猷　　　
３．７３３　　　　　２９０５この結果によれば、皮下
Ｐ８１５肥大細胞腫モデル（これは１日目から１４４日
目で毎日１回２５０μｇ／ｋｇのＴＮＦをｉｐ投与した
ことに相当し、そしてＩＬ−２を同じ方法で１０，００
０，０００ユニット／ｋｇまで投与したことに相当しな
い）は、ＩＬ−２を同時に投与した場合、ＴＮＦの５倍
少い投与量に相当しな。さらに、ＴＮＦ及びＩＬ−２を
それぞれ２５０μｇ／ｋｇ及び６２５，０００ユニツ）
・／ｋｇで一緒に投与した場合、腫瘍が出現しなかっな
。

２、第２表は、ＴＮＦのみ、ＩＬ−２のみ、及びＴＮＦ
とＩＬ−２との踵々の混合物（インビトロで調製したも
の）をマウス体重ｋｇ当り示された量で、１０６個のＬ
　１２１０細胞をｓｑ移植された群当り１０匹の雌性Ｂ
ＤＦＩマウス（体重２４±３ｇ）に、腫瘍の移植後１日
目から始めて１３日間続けて一日１回投与した場合に得
られた結果を示す。

対照にはＰＢＳのみを１３日間毎日１回注射しな。

以下余白 １」し去 ０　　　０　８触知　　８６０　　３８７９　　　大き
過ぎ０　　３９．０６２　　７触知　１３５０　　４３
０８　　　大き過ぎ２５０　　３９．０６２　　０触知
　０触知　０触知　０触知２５０　　１９．９８１　　
　０触知　０触知　　１触知　　　　１２５０９・９９
０　　　１＋（１？）　　　４０５　　−猛冒ｇｆ）ｇ
れ、０触知 この結果は、Ｌ　１２１０１！瘍が２５０μｇ／ｋｇの
ＴＮＦ単独（最大許容投与量）にも５，０００，０００
ユニット／に、のＩＬ−２単独にも応答しながったこと
を示した。約２６０μｇ／ｋｇより多くノＴＮＦ又ハ９
３７，５００ユニツ）／ｋｇより多くのＩＬ−２の投与
は２０％を超える体重の減少をもたらし、毒性を示した
。

２５０μｓ／　ｋｇｆ）　Ｔ　Ｎ　Ｆを９　、９００ユ
ニー　ット／ｋｇノＩＬ−２と組合わせた場合を除き、
ＩＬ−２及びＴＮＦを一緒に投与した場合腫瘍が生じな
かった。

３、第３表は、ＴＮＦ単独、ＩＬ−２単独、及びＴＮＦ
とＩＬ−２との種々の混合物（インビトロで調製された
もの）をマウスの体重ｋｇ当り示された量で、Ｉ　Ｘ　
１０’個の８１６細胞をｓｑ移植された群当り５匹の雄
性ＢＤＦＩマウスに、Ｍ瘍の移植の後１日目がら始めて
１４日間続けて毎日１回腹腔内投与した場合に得られた
結果を示す。対照にはＰＢＳを１４日間毎日１回注射し
た。

以下余日 策−」二」及 ０　　　　　０　　　　１６１　　　６１２　　　大き
過ぎ２５０　　　　　０　　　　　９０　　　２７７　
　　大き過ぎ２５０　　　６２．５００　　　　　　０
　　　　　０　　　　０２５０　　６２５．０００　　
　　　　０　　　　　０　　　　００　　６２．５００
　　　　６５　　　１７７　　　大き過ぎ０　　３１２
．５００　　　　２７　　　１３３　　　大き過ぎＴＮ
ＦとＩＬ−２との組合わせはｉＩ癌の増殖を防止したが
ＩＬ−２又はＴＮＦ単独はそれを防止しなかった。ネズ
ミＢ１６黒色腫はヒトの黒色腫に非常に預似しており、
そしてそれ故にこのセルラインに対して多くの研究が行
われた。ＴＮＦとＩＬ−２との組合わせはＢ　１６ａ胞
に対して効果的であるという事実はそれがヒト黒色腫の
治療において有効であることを示す。

ネズミ腫瘍Ｌ１２１００．　ｐ３８８及びＢ１６は、こ
れらの腫瘍が腹腔内にある場合でも皮下にある場合でも
、ＴＮＦにとって基本的に制御しがたいことが見出され
た。腫瘍サイズのわずかな減少がＬ　１２１０について
観察された。この制御の困難さは、ＴＮＦ処置が腫瘍の
移植後１日間、５日間又は１０日間のいずれにおいても
存在した。

４、　この実験は、ＩＬ−２とＴＮＦとを組合わせて投
与するための最適スケジュール決定するために行われた
。腫瘍が出現しない最も苛烈なモデル（好結果の治療の
ための腫瘍移植後の最終日）を決定した。

この実験において、Ｌ　１２１０腫瘍細胞を動物の群に
移植し、そして処置を１．３，７，１０、又は１４日後
に開始した。

第４表は、２５０μｇ／ｋｇのＴＮＦと３９，０６０ユ
ニット／ｋｇＩＬ−２の混合物を、５Ｘ１０’個のＬ　
１ｚｔｏ細胞をｓｑ移植された群当り５匹の雌性ＢＤＦ
１マウスに、腫瘍の移植後１．３，７．１０又は１４日
から始めて最初の移植から２００日目で毎日続けて腹腔
的投与した場合に得られた結果を示す６対照にはＰＢＳ
を１９日間毎日注射した。

剃−生一民 ３　　　　７　　　　２４９　　　大き過ぎ４　　　　
１０　　　　２４３　　　大き過ぎ５　　　　１４　　
　　２７１　　　大き過ぎ群３〜５及びＰＢＳ対照は７
日目に触知可能な腫瘍を有していた。このデーターは、
最も苛烈なモデルが３日又は５日のそれであることを示
した（治療を腫瘍移植後７日目に開始した場合腫瘍の増
殖は防止できなかった）。

５、第５表は、ＴＮＦ単独、ＩＬ−２単独、及びＩＬ−
２とＴＮＦとの種々の混合物をマウスの体重ｋｇ当り示
された量で、３Ｘ１０’個のＰ３８８白血病細胞をｓｑ
移植された群当り５匹の雌性ＢＤＦ１マウスに、ｐａｒ
ｓ移ｍｆ＆１日目か日日めて１４日間毎日続けて投与し
た場合に得られた結果を示す。

対照にはＰＢＳを１４日間毎日注射した。

策−１−夫 ０　　８２．５００　　　１１４　　　３０６０　　３
１２．５００　　　１２９　　　３２１０　　６２５．
０００　　　　４３　　　２８８２５０　　６２５．０
００　　　１１３　　　２９７２５０　　６２．５００
　　　１１２　　　２９７すべての腫瘍が１５日目から
漸進的に増殖し、２１日目までに大き過ぎそして不規則
で測定できなくなった。従って、Ｐ３８８腫瘍モデルに
おいてはＴＮＦとＩＬ−２とを組み合わせた毎日の投与
は機能しなかった。

６、この実験においてはＩＬ−２の代りにルー２−　Ｐ
ＥＧを使用し、そして毎日投与ではなく隔日投与を行っ
た。第６表に結果を示す。

策Ｕ ０　　０　０　毎日　猷　２７１ ０　　　３１２．５００　　　　０　　１日３回　　青
膨　　３３０２５０　　　６２５．０００　　　　０　
　１，３．７日目　　０００　　　　　０　　６２５０
　　１癌　日　　　触知　　１３８２５０　　　０　６
２５０　　隔日　　０１２１この結果は、ＩＬ−２及び
ＩＦＮによる１日目、３０目及び７日目の処置が最も効
果的であり、毎日の処置は効果的でないことを示した。

７、第７表は、１２，５００ユニツｌ”／ｋｇのＩＬ−
２及び５μｇ／ｋｇのＴＮＦ’の混合物（インビトロ調
製したもの）を、ｌＸｌ０’個のＥＬ−４マウスリンパ
腫細胞をｓｑ移植された群当り５匹の雌性ＢＤＦ１マウ
スに、腫瘍移植後１日目から始めて１４日間続けて毎日
ｉｐ投与した場合に得られた結果を示す。対照にはＰＢ
Ｓを１４日間注射した。

策−二−表 ＥＬ−４００００ ＴＮＦ及びＩＬ−２の組合わせがＥＬ−４リンパ腫の腫
虐増殖を防止し、他方対照はそれを防止しなかった。

８、　第８表は、１２，５００ユニット／ｋｇのＩＬ−
２と５μｇ／ｋｇのＴＮＦとの混合物（インビトロ調製
したもの）を、ｌＸｌ０’個の８１６細胞をＳＯ移植さ
れた群当り１０匹の雌性ＢＤＦＩマウスに、腫瘍移植後
１，３．５．７、及び１０日目から始めて２０日間続け
て毎日ｉｐ投与した場合に得られた結果を示す。

暮−比二民 ２　　３　　　触知　　５６　　３２６　　２２８３３
　　　５　　　触知　　３９　　１９９　　２４５９４
　　７　　　触知　　９２　　３５６　　３１９５この
結果は、組合せ療法が用いられた場合に小さい■瘍負荷
のみが治癒することを示している。

９、第９表は、１２５，０００ユニット／ｋｇのＩＬ−
２と５　ｕ　ｇ／　ｋｇのＴＦＮとの混合物（インビト
ロで調製したもの）を、ｌＸｌ０’個の８１６Ｗ１０細
胞を腹腔内（ｉｐ）又は静脈内（ｉｖ）移植された群当
り５匹又は１０匹のＢＤＦ１マウスに、腫瘍移！ｆ＆１
日日から始めて少なくとも１４日間にわたり毎日続けて
ｉｐ投与した場合に得られた結果を示す、対照には少な
くとも１４日間毎日ＰＢＳをｉｐ又はｉｖ注射した。１
４日後に、ｉｖ注射された動物を殺し、そしてそれらの
黒い小瘤としての肺コロニーを計数し、そして−セット
の肺当りの転移として示した。

以下余白 策−」し」友 ５　　　１　　　　ｉｐ　　　２５日目に５１５生存５
２ｉｐ対照　１１日目に１１５生存 １０　　　３　　　　ｉ　ｖ　　　１７日目にＩｌ市転
移なしこれらの結果は、静脈内移植された腫瘍について
人工的肺転荘が存在しないことを示している。

腹腔内移植された腫瘍については対照に対する有意な延
命が存在する。従って、この実験は、ＩＬ−２及びＴＮ
Ｆの投与が皮下以外の身体中のいずれに位置する腫瘍細
胞にも機能することを示している。

伊ドユ マウス宿主に移植された標的細胞がメチルコラントレン
で誘導された肉１ｉ（Ｍｅｔｈ＾）（［１ａｌｂ／ｃ）
（Ｌｌｏｙｄ　Ｏ１ｄ博士、メモリアル・スローン・ケ
ツタリングから腹水経由腫瘍として入手し、スト・ツク
として凍結し、そして使用前に腹水を少なくとも２回経
由したもの）である場合、数日間にわたり毎日ｉｐ注射
された５０μｇ／ｋｇマウス体重のＴＮＦのみ、又は１
５，６２５ユニット／ｋｇマウス体重のＩＬ−２のみは
腫瘍の完全な退化を惹起した。しかしながら、移植後６
０日以内に８０％のマウスにおいて腫瘍が盛り返した。

これに対して、５０μｇ／ｋｇマウス体重のＴＮＦと１
５，６２５ユニット／ｋｇマウス体重のＩＬ−２とのイ
ンビトロ調製された混合物を同じ日数にわたって毎日Ｍ
ｅｔｈ＾マウスにｉｐ注射した場合、移植後６０日以内
に腫瘍の盛り返しはなかった。例１において使用したの
と同じＩＬ−２及びＴＮＦを使用した。この結果が示す
ところによれば、ＴＮＦとＩＬ−２の混合物は完全な治
癒をもたらし、他方いずれかの成分単独は、例１のモデ
ルに比べて療法剤に対して一般的に感受性であるＭｅｔ
ｂ−Ａ退化モデルにおいてわずか２０％の治癒をもたら
した。

ｒＩＡすユ 例１及び２の実験（但し、Ｐ２Ｓ５は使用しない）を数
回反復して投与群当り１０〜５０の動物についてデータ
ーを得た。これらの研究において、最大許容投与ｉ（Ｍ
ＴＤ）を、死亡が起こらずそして療法中又はその後５日
間の体重の減少が５％未満であるように注射され得るリ
ンホカインの最大量として定義した。ＴＮＦについては
このＭＴＤが２５０μｇ／ｋｇ（５μｇ／２０ｇマウス
）であることが見出された。ＩＬ−２については、すべ
ての療法注射について０．１＋１１１に維持された容量
において最大溶解量８　ｍｇ／社を使いた。従って、Ｉ
Ｌ−２の投与量は、１４日間毎日５００〜８００μｇ／
ｋｇ（１０〜１６μｇ／２０ｇマウス）のｉｐ投与であ
った。

この研究のため、ｉｐ腫瘍モデルについての゛有意な゛
′延命は、対照（Ｐ　Ｂ　Ｓ処Ｍ）群の１５０％より大
きい死亡までの時間として定義される。腫瘍獲得（ｔｕ
ａ＋ｏｒ　Ｌａｋｅ）の完全なブロック（“治癒”）は
ｓｑモデルにおいて最初の腫瘍チャレンジの後６０日間
に測定可能なＭ瘍が証明されないこととして定義される
。

この結果が示すところによれば、Ｌ　１２１０、Ｐ８１
５．８１８１１０及びＥＬ−４モデルにおいてすべての
動物が５ｑｌｉ瘍を生じさせ、他方動物の９５％が一貫
してＳＱ　Ｍｅｔｈ−＾ＭｆＦｊを生じさせた。２種類
のリンホカインを単−剤として療法効果について評価し
た場合、ＴＮＦがＭＴＤにおいて投与されれば腫瘍チャ
レンジ後１ロ目に治療を始めた場合、ＴＮＦ処置により
幾らかの初期増殖阻害が［察された（Ｌ１２１１びＰ８
１５〕場合ｆｆｌ著であツタ）。ＩＬ−２が単−剤とし
て１４日間毎日投与された場合、治療が腫瘍移植の１日
以内に開始された場合にのみ、幾つかの非−Ｍｅｔｈ−
＾腫瘍モデル（特にＰ８１５）について類似のわずかな
効果が見られた。

Ｍｅｔｈ−＾モデルにおいてリンホカインは一層劇的に
効果的であった。なぜなら、ＴＮＦの単一投与が、治療
が開始される前１０日まで増殖が許容された肝癌の退化
をもたらしたからである。高投与量のＩＬ−２療法を用
いる場合、７〜１０日のＭｅｔｂ−＾腫瘍について類似
の結果が見られた。しかしながら、ＴＮＦ又はＩＬ−２
が単−剤として最初の１４日間にわたりわずか１日の腫
瘍を担持する動物に反復投与した場合、Ｍｅｓｈ−＾腫
瘍の増殖が有意数の動物について治療終了後的３０日開
運れたが、しかし大部分が４５５日目でに腫瘍を生じさ
せた。

非−Ｍｅｔｈ−＾モデルの結果は、ＭＴＤのＴＮＦを最
適（溶解する）量のＩ　Ｌ−２と同時にＩ）ｉ瘍のチャ
レンジの後１日以内に投与された動物は腫瘍を生じさせ
ないことを示した。興味あることには、組合せ中のＩＬ
−２投与量は幾つかの場合において、Ｉｔ！Ｔｉ瘍の°
“獲得′°をブロックするために、最適量の１％に減少
せしめることができたが、混合物中のＴＮＦの量は５０
％を超えて減少せしめることができなかった９ ＩＬ−２＋ＴＮＦの組合せを用いる種々のモデルについ
て可能な腫瘍獲得期間の決定のため、処置を１日目に開
始した場合に多部分のモデルにおいて腫瘍獲得をブロッ
クする固定された投与量（２５０μｇ／ｋｇのＴＮＦ＋
５００μｇ／ｋｇのＩＬ−２）を用い、そして効果的な
組合せ療法を開始する前に各腫瘍タイプが増殖すること
が許容され得る時間を研究した。

効果的なＴＮＦ＋ＩＬ−２療法のためになお許容される
腫＃５獲得のための最大許容時間は平均３〜５日であり
、但し８１６１１０については１日目に治療を開始しな
ければならなかった。逆にＭｅｔｈ−＾については、１
０日腫瘍は真に゛治癒可能°°であり、そして退化を示
しな。これらのモデルのそれぞれにおいて、最適腫瘍獲
得期間の後に始まる組合せ治療は腫瘍増殖の阻害をもた
らしたが治癒をもたらさなかった。興味あることには、
増殖阻害効果は２週間の処置期間の内１週中初期におい
てのみ見られ（言うまでもなく、退化及び増殖阻害が非
常に長く続（Ｍｃｔｂ−八を除く）、そして全体的に有
効なＴＮＦ＋ＴＬ−２の投与量より少い量を投与された
動物中の腫瘍は２及び３週中に対照レベルに急速に増殖
した６５種類のネズミ腫瘍の腹腔内モデルについての単
−剤及び組合せ（ＴＮＦ及びＩＬ−２）蛋白質療法の結
果を検討した。すべてのケースにおいて、腫瘍細胞接種
後１日目に処置を開始した。ＴＮＦ及びＩＬ−２の組合
わせが皮下モデルにおける腫瘍獲得をブロックしたが、
これらのリンホカインを組合わせて又は単独で投与した
場合腹腔内モデルにおいて類似のブロックは存在しなか
った。しかしながら、皮下モデルにおいてＭ瘍獲得を全
体的にブロックするのと同じ方法を用いてＩＬ−２とＴ
ＮＦとの組合わせを投与した場合、腹腔８１６黒色脛、
ＥＬ−４リンパ腫、及びＭｅｔｈ−＾腫瘍について有意
な延命が見られた。

最後に、ＩＬ−２とＴＮＦの組合せ療法を、Ｂ１６Ｗ１
０黒色ｆＩｍ胞を静脈内接種された動物における単−剤
投与と比較した。皮下ｆｆ１ｆ１ｆＩについて腫瘍細胞
負荷獲得期間を試験するのと同様の研究を行って、治癒
療法を開始する前の腫瘍増殖のために許容され得る時間
をさらに明確に決定できるようにした。ＩＬ−２及びＴ
ＮＦによる処置は、最適量で同時に投与された場合、処
置が腫瘍移植の後１日目に開始されたなら、相乗的であ
った。処置が移植ｆ＆３日目日日始された場合、肺転移
の数は対照に比べて有意に少なかったが、しかしすべて
の動物が腫瘍を有していた。

結論として、ＴＮＦ＋ＩＬ−２組合せ療法の相乗性は、
（ａ）　Ｒ大許容日用量のＴＮＦを必要とするが、毎日
投与におけるＩＬ−２の量は９９％削減することができ
、（ｂ）腫瘍負荷、又は移植された細胞が治療の開始前
に取ることが許容される時間に拘束され、そしてこの時
間は腫瘍のタイプにより異り、そして（ｃ）皮下腫瘍及
び肺腫瘍のためには効果的であるがしかし腹腔内腫瘍の
獲得のブロックをもたらさない、ことが見出された。

これらのモデルにおけるＴＮＦとＩ　Ｌ−２の相乗効果
はおそらく複雑な相互作用の結果であろう。

好結果の免疫療法の宿主の腫瘍負荷への見かけ上の依存
性に加えて、いずれかの理論に拘束されるわけではない
が、ＴＮＦとＩＬ−２との間の相乗性は、（ａ）腫瘍細
胞へのＴＮＦの直接作用、（ｂ）細胞溶解性細胞の増加
〔おそらく不均一細胞集団（例えばマクロファージ）に
対するＴＮＦ作用の間接的結果としてのＩＬ−２リセプ
ターの発現は他のリンホカイン（例えば、Ｉ　Ｌ−２リ
セブターの発現に影響を与えるＩＬ−１）の放出を生じ
させる〕、又は（ｃ）ＩＬ−２及びＴＮＦの両者による
細胞溶解性細胞の直接活性化により説明されるであろう
。事実、組合せがＴ細胞を過剰活性化（ｈｙｐｅｒａｃ
ｔｉｖａｔｅ　）　Ｌ、又はＬＡＫ様活性を開始する可
能性がある。それぞれＣＴＬ及びＬＡＫ及びＣＴＬ依存
性であるヌードマウス又はＮｔｌ＋−３（ベージュ−ヌ
ード−ＸＩＤ）マウス中で増殖した場合にＴ　Ｎ　Ｆと
ＩＬ−２との同じ組合せがこれら同じ腫瘍について腫瘍
獲得をブロックしないという事実によって証明されるよ
うに、ここに報告される効果はそのようなエフェクター
細胞現象のためであろう。

鮮紅 この例においては、最適投与方法を決定するためにＩＬ
−２及びＴＮＦの投与を評価した６次の実験を行った。

Ａ、混り］兜 １．７ＮＦ及びこれに続＜ＩＬ−２ Ｈ瘍が皮下にあるＭｅｔｈ−＾腫瘍モデルを使用して、
７日間にわたり（ＰＢＳ＋ＩＬ−２の１つのケースにお
いては１１日間）腫瘍を担持する５匹ずつのＢａ１ｂ／
Ｃマウスの群をランダム化し、耳に標識をし、そしてＴ
ＮＦにより、ＩＬ−２により、ＴＮＦ及びこれに続＜：
１Ｌ−２により、ＰＢＳにより、又はＰＢＳ及びこれに
続＜　Ｉ　Ｌ−２により処置した。

腫瘍偉績、体重及び腫瘍の重量の側定は通常１４日日目
停止した。なお、これらの実験中の幾つかの群は４３日
間維持して長期間治癒（すなわち、腫瘍が完全に根絶さ
れる場合）の頻度を評価した。

実験の方法を下に記載する。すべての薬剤は０．２ｍｌ
の容開で静脈内投与した（ｋｕ＝キロユニットを示す）
。

以下全白 ＴＮＦ（５０μｇ／ｋｇ）　　　　　　　　な　　し３
日目毎に２回 ＴＮＦ（５０μｓ／　ｋｇ）　　　　　　ＩＬ−２（５
ｋｕ／投与）３日目毎に２回　　　　　　１週間に５日
、１日１回’Ｊシ酸緩街化塩溶液　　　　な　し １週間に５日、１日１回 ■し一陥５ｋｕ／投与）　　　　な　し１週　に５日、
１日１回 ＩＬ−４ｉ２０ｋｕ／　Ｆ、与）　　　　な　し１週　
に５日、　日１回 結果を第１０表に示す。ここで、ΔＢＷはマウスの１つ
の群内におけるＯ日日の平均体重と１４４日間おける平
均体重の比率を示し、そしてΔＴＷはマウスの１つの群
内のＯ日日における平均！瘍体積と１４４日間おける平
均腫瘍体積の比率である。

ＴＮＦ（５０μｇ／ｋｇ）　　１．１８　１８．５　０
１５０１５　−−　　−−＋ＩＬ−２（５ｋｕ）　　　
１．０４　２．２０１５　０１５　−−　−−＋ｒＬ−
２（２０ｋｕ）　　　１．０１　０．５３１５　０１５
　３／３　１１５ＰＢＳ（７日腫瘍）　　　１．１９　
５６．１　０１５　０１５　−−　　−−）ｆＬ−２（
５ｋｕ）　　　１．２２　４４．６０１５０１５　−−
　−＋ＩＬ−２（２０ｋｕ）　　　１．１９４９．７０
１５０１５　−−　　−−１’ＢＳ（１１日腫瘍）　　
１．２５　６３．３　−−　　−−＋ｒｔ、−ｚ　　　
　　　　１．３６　３９．９−１１５（腫瘍負荷）＋Ｉ
Ｌ−２１，１８２７，９−−−− ［Ｌ−２（５ｋｕ）　　　　１．３３４２．０　−−　
−−ＩＬ−２（２０ｋｕ）　　　　１．１８　４９．１
　−−　　−−結論として、ＴＮＦ及びこれに続＜ＩＬ
−２の投与が、いずれかの薬剤単独と比較して抗−腫瘍
効果を有意に増強し、２０ｋｕ／投与のＩＬ−２により
処置された群において長期間治癒が得られた。

７日Ｎｔｇ又は１１日腫瘍に対する５及び２０ｋｕ／投
与のＩＬ−２の投与量において、ＩＬ−２又はＴＮＦ単
独は効果にほとんど又は全く影響を与えなかった。

２、　　ＩＬ−２及びこれに続＜ＴＮＦ腫瘍が皮下にあ
るＭｅｔｈ−＾腫瘍モデルを用いて、７日間（又はＰＢ
Ｓ４１Ｌ−２の場合には１１日間）にわたるＨ瘍を担持
する５匹のＢａ１ｂ／ｃマウスから成る群をランダム化
し、耳にＷ識をし、そしてＴＮＦにより、ＩＬ−２及び
これに続＜ＰＢＳにより、ＰＢＳ及びこれに続＜ＴＮＦ
により、ＰＢＳ／　ＳＤＳにより、又はＩＬ−２及びこ
れに続（ＴＮＦにより処置した。腫瘍体積、腫瘍重量、
及び体重の測定は１４４日目停止した。これらの実験の
方法を下に示す。すべての薬剤は０，２社の容量で静脈
内投与した（ｋｕはキロユニットを示す）。

ＩＬ−２（５ｋｕ／投与＞　　　　　１１ＢＳ１、ｔＮ
間に５日、１日１回　　　３日目毎に２回ＩＬ−２（２
０ｋｕ／投与）　　　　　ＰＢＳ１週間に５日、１日１
回　　　３日目毎に２回ｒ’［ｌｓ＋０．１％ＳＤＳ　
　　　　　　ＴＮＦ　（５０μｇ／ｋｇ）１週間に５日
、１日１回　　　３日目毎に２回Ｉ　Ｌ　−Ｍ　５ｋ　
ｕ　／投与）　　　　　ＴＮＦ（５０μｓ／ｋｇ）１週
　に５日、１日１回　　　３日目毎に２回ＩＬ−２（２
０ｋｕ／投与）　　　　　ＴＮＦ（５０μｓ／　ｋｇ）
１週間に５日、１日１回　　　３日目毎に２回ＳＤＳ　
（１％）　　　なし 結果を第１１表に示す６表中ΔＢＷ及びΔＴＷは第１０
表に定義した通りである。

、以下余白 第１」ｊ（ ＩＬ−２（５ｋｕ）＋ＰＢＳ　　　　１．２６　５９．
３　　−−　　−ＩＬ−２（２０ｋｕ）十ＰＢＳ　　　
１．１９　５４．７　−−　　−−−６２．（５憂、’
、”’　　１．２７５８．３　−一　〜−ＩＬ−２（２
０ｋｕ）−ト丁ＮＦ　　　　１．１６　　　９．２　　
　−−　　　　−−（５０μｇ／ｋｇ） ＰＢＳ＋ＴＮＦ （５０，ｇ／ｋｇ）　　　　　１．１４　９．７　０／
４　１１５ＳＤＳ（０，１％）　　　　　　　１．２３
　４９．０　　−−　　　−−この結果は、ＩＬ−２が
ＴＮＦ’の前に投与された場合には効果の増強が観察さ
れないことを示している。いずれか１つの理論に限定さ
れないが、ＩＬ−２が最初に投与された場合に、腫瘍又
は１宿のＴＮＦに対する感受性をＩＬ−２が変化せしめ
、このことが腫瘍をＴＮＦに対して耐性にするという、
ＴＮＦの殺作用の低下のヒントが存在した。

Ｂ、　　Ｌ１２１０モール １、　ＴＮＦ及びこれに続＜ＩＬ−２ 例１に記載したＬ　１２１０腫瘍モデルを用いて、３×
１０６個のＬ　１２１０細胞を０日目に移植された５匹
ずつのｎＤ２Ｆ１マウスから成る群を３日目にＴＮＦと
ＩＬ−２により一緒に、ＴＮＦ及びこれに続＜ＩＬ−２
４：より、ＰＢＳにより、又はＩＬ−２及びこれに続＜
ＴＮＦにより腹腔的処置しな。結果を第１２表に示す。

以下余白 一群エ　−薬　　びスケジュール ３　　１２．５ｋｕ／投与のｒＬ−２を１日１回３日間
、次に５μｇ／ｋｇのＴＮＦを１日１回５日間４　２．
５μｇ／ｋｇのＴＮＦを３日目毎に２回注射次に２００
ｋｕ／投与のＩＬ−２を１日１回５日ｔｒｉ５　２．５
μｓ／ｋｇのＴＮＦを３日目毎に２回注射次に１２．５
ｋｕ／投与のＩＩ、−２を１日１回５日曲°　活用１″
′：、、心冨昌俳Ｎぽ釉よ。。

７　　１２．５ｋｕ／投与のＩＬ−２を１日１回５日間
、次に２．５μｇ７ｋｇのＴＮＦを３日目毎に２回注射
ｓ　　　ｐｕｓ対照１日１回１０日間 第１２表 ｏ　　　　　ｏｏ　　　　　ｏ　　　　　　。

触知　　１３９　　１４５６　　　大きな腫瘍負荷　殺
した２７日間及び６０日後に、この苛烈な腫瘍モデルに
おいて群２においてはなおｐａ瘍影形成証拠がなかった
。群１，２．４及び５の間の結果の差異は、スケジュー
ル及び投与量並びに投与の順序がＬ　１２１０モデルに
おいて良好な応答を得るために重要であることを示して
いる。

鮮り この例においては、前記のＭｅｔｈ−＾腫瘍モデルを使
用して、クラス■インターフェロンの市販の誘導剤であ
るポリＩ／Ｃと前記ＴＮＦのミューティンとの組合わせ
を試験した。

この組合せを同時に投与した場合、各薬剤単独に比べて
相乗的抗−腫瘍効果が観察され、そして幾つかのケース
においては治癒が観察された。投与順序の効果を決定す
るための実験において、ポリＩ／Ｃ及びＴＮＦの順序が
観察される相乗効果に影響を与えることは示されなかっ
た。いずれの順序も同様に良好に機能した。

これらの実験は、クローン化マウスＩＦＮ−β及びＴＮ
Ｆを一緒に使用して相乗効果が期待されることを示して
いるや 例旺 １４日間にわたり１日１回ｉｐ投与された、及び１４日
間内で種々の順序で投与されたＩＮＦ及びＩＬ−２の組
合せがｌ３１６皮下腫瘍に対して効果を示している。こ
の実験は、°°臨床的°°スゲジュール（例えば週末休
み）での’Ｉ’ＮＦとＩＬ−２の投）７が同等の効果を
示すか否かを決定するために設計された。さらに、筋肉
内（ｉｎ）投与されたＩｔ、−２とｉｐ投与された′Ｉ
″Ｎ　）？との組合せ（１日１回１４［］間）の効果を
試験した。

この実験においては、群当り５匹ずつのＢ　ｌ）　Ｆ１
Ｍ性マウスに、０日日にマウス当り５Ｘ１０’個のＢＩ
６細胞を皮下注射した。１日日に処置を開始した。特に
ことわらない限りすべての注射はｉｐで行った。腫瘍の
測定は１０日、１４日、２１日　２８日、３５日及び４
２日間に行った。

各群のマウスを次のスケジュールに従って処置し、この
場合０．２５ｍｇ／ｋｇの’Ｔ’　Ｎ　）’及び１ｍｇ
／ｋｇのＩＬ−２を示された各時点で投与・した。

１　　　ＰＢＳ１日１回 ４　　　ＴＮｍ−５ｉ／、ＩＬ〜２（８−１２日）。

残りの１　　反復 ５　　１’ＮＦ（１−１４日、　ｉｐ）　＋　ＩＬ−２
（１−１４日、　ｉｍ）腫瘍内債が２０００ｍ＋ｓ’よ
り大になった時、又は６０日過ぎても腫瘍が存在しなか
った時を終点とした。結果を第１３表に示す。

蘇襲退 群　〜１９丁１１１１　　　　１４Ｆ１目−−ハ、ロロ
ー　−ヱ坦目−迦日日−２触知なし／１　　前動■をし
／１　　　２２／１　　　　１５７９／１　　　　殺し
た３　　角Ｖ邪ｔし／２　　角ｖ■２Ｌ／２　　　２９
／２　　　　２５°７５／２　　　　殺した４　青膨な
し／１　　触知なし／１　　１２／ｌ　　　　１８７０
／２　　　　殺したこの結果によれば、この研究におい
て使用した週末休みを模倣するＴＮＦ／１Ｌ−２投与ス
ケジユールはいずれもなんらの効果も示さなかった。ｌ
３１６皮下腫瘍モデルにおいては、ＴＮＦ、ＩＩ、−２
又はｆＪ１合せの投与は、効果的であるためには、２４
時間以内に行わなければならず、そして７日間より長期
間続けなければならないことを示している。

ＴＮＦのｉｐ投与及びＩ　Ｌ−２のｉｍ投与を受けたマ
ウスはすべて第８投与により死んだ。さらに、同容量の
塩溶液をｉｍ投与された対照動物９回の注射の後死んだ
、従って、試験群は実際の注射に耐えられず、そして死
亡は被験物質とは無間係のようである。

倒７− この実験はすでに効果的である組合せを１０日腫瘍負荷
に対して試験することにより一層苛烈なモデルにおける
それらの効果を決定した。

この例においては、０日日に５Ｘ１０’個のＢ１６＋ｔ
ｊｌｌ胞を皮下注射された群当り５匹ずつのＢＤＦＩＭ
性マウスを使用し、１１日目に処置をｉｍ始した。すべ
ての注射はｉｐで行い、そして腫瘍の測定は１０日１］
、１４日目、２１日目及び２８日目に行った。

各マウス群を次の投与量及びスケジュールに従って試験
した。

１　１’ＢＳ ２　■凹）！ｉミニ７６１マ吉雷日・及び腫瘍体積が２
０００ｍｌ１１’より大きくなった時又は４２日過ぎて
も腫瘍が存在しながった時に終止とした。

結果を第１４表に示す。

以下余白 この結果が示すところによれば、１日腫瘍に対して効果
的であったＴ　Ｎ　Ｆ　（０，２５論ｇ／ｋｇ、１−３
日）、及びＩ　Ｌ　−２（１ｒｎｇ／ｋｇ、４−１４日
）の同じ投与量及び順序スケジュールは一層苛烈な１０
日８１６皮下モデルにおいても効果的であった（群２）
。これに代るＴＮＦ及びＩＬ−２スケジユール（群３）
は効果的でなかった。

最初の３日間及び次の１１日間続けて同時に１日１回投
与された同じ量のＩＬ−２及びＴＮＦは１日又は３日の
腫瘍を担持するマウスにおいては有効であったが１０日
腫瘍を担持するマウスにおいては有効でなかった（３日
後のＩＬ−２及びＴＮＦの混合物は逐次投与はど良くな
かった）。

このことは、逐次投与が混合物の投与より良いことを示
唆している。

倒ｊユ Ａ、実験計画 １、種：ラットＣＤ系 ２、処置期間：１日１回１４日間 ３、投与経路：１．Ｖ。

４、投与レベル：ＴＮＦのみ５０ノｔｇ／ｋｇ：ＩＬ−
２のみ０．５又は１．０　ｍｇ／　ｋｇ　；　ＴＮＦ／
ＩＬ−２の組合わせ、ＴＮＦ（５０μｇ／ｋｇ）／ＩＬ
−２（０，５彌ｇ／ｋｇ）、又はＴＮＦ（５０μｇ／ｋ
ｇ）／　Ｉ　Ｌ　−２（１，０ｍｇ／ｋｇ）５、投与レ
ベル当り動物数＝５匹の雄及び５匹の雌 ６、評価パラメーター 死亡率 体重及び体重変化 臨床症状の観察 肉眼的壊死 血液状態 可能な組織病理学的評価 Ｂ、結果 ＴＮＦ又はＩＬ−２単独群と比較して両ＴＮＦ／ＩＬ−
２組合せ群において体重増加が少なくなった。

ＴＮＦ（５０μｇ／　ｋｇ＞／　ＩＬ　−２（１，０ｍ
ｇ／　ｋｇ）のＴＮＦ／ＩＬ−２組合せ投与の１回の注
射の後に死亡した３匹の雌性ラットを除き、他のすべて
の試験ラツトは１日１回の１４回の投与に対して生存し
た。死亡したことが見出される前に３動物の内の２動物
について゛血便／下痢゛′が認められ、そして３動物す
べてが死体解剖において°“流体に満たされたＧ、１．
管”（ｆｌｕｉｄ−ｆｉｌｌｅｄ　Ｃ，１，ｔｒａｃｔ
）を有していた。゛血便／下痢”又は゛流体に満たされ
たＧ、Ｉ。

管°゛はラットにおけるＴＮＦ毒性の典型的な症状であ
るから、３動物すべてがＴＮＦ毒性により死亡した様で
ある。研究の１４日日目で生存したすべての動物は研究
の１及び２日日においてのみ゛°血便／下痢°′のエビ
ンードを示し、そしてこれらは死体解剖においてＩＬ−
２毒性及びＴＮＦ毒性の徴候を有さなかっな、ＴＮＦ（
５Ｑμｇ／ｋｇ）／ＩＬ−２（０，５ｗＩｇ／　ｋｇ）
、又はＴＮＦ（５０μｓ／ｋｇ）／ＩＬ−２（１、Ｏｍ
ｇｌ　ｋｇ）の投与レベルのＴＮＦ／ＩＬ−２組合せに
おいて雄性ラット及び雌性ラットの両者に白血球の数、
好中球の数、リンパ球の数及び好エオシン球の数の上昇
が観察された。両ＴＮＦ／ＩＬ−２組合せ投与レベルに
ついて雌性ラッＩ・及び雄ラットの両者において投与量
依存的に赤血球の数、ヘモグロビン濃度及びヘマトクリ
ッ？−（％）の有意な低下が認められた。

Ｃ１要約 この研究の結果に基き、最大許容投与ｍｃＭＴＤ）は、
ＴＮＦとＩＬ−２との組合せを１４日間にわたり連日ラ
ットに静脈内投与する場合、ＴＮＦ（５０μｇ／　ｋｇ
）／　ＴＬ　−２（０，５薗ｇ／ｋｇ）であることが確
立された。このＭＴＤはＴＮＦ単独で処置された場合の
ＭＴＤに匹敵し、そしてＩＬ−２単独で処理された場合
より幾分低かった（ＩＬ−２単独のＭＴＤは１．０＋＊
ｇ／ｋｇであった）。

ＴＮＦ又はＩＬ−２が単独で投与された場合と比べて、
ＴＮＦ及びＩＬ−２の組合せがこの試験条件下で投与さ
れた場合、異る毒性症状は観察されなかった。この研究
の結果からは真の“観察されない効果レベル“”　（Ｎ
０ＥＬ）は確立されなかった。

体重増加の低下、白血球の上昇、白血球百分率、赤血球
数の減少、及び関連パラメーターのなめである。

要約すれば、この発明は、抗１！ｉｇｆｊ活性を有しそ
してさらに哺乳類宿主において有意に増加した毒性を示
さない、ＴＮＦ及びＩ　Ｌ−２及び／又はＩＦＮ−βの
組合せを提供する。予想外のことには、インビトロでの
ヒト腫瘍モデルにおいて幾らかの細胞を殺すがしかしイ
ンビボにさかのぼるために試験されたそれらの細胞のヌ
ードマウス異種移植片モデルにおいてもインビボでの古
典的なネズミ腫瘍モデルにおいても細胞を殺さないＴＮ
Ｆが、少量のＩＬ−２及び／又はＩＦＮ−βと組合わさ
れた場合には、効果的な抗癌剤であった。さらに、予想
外のことには、ＴＮＦ及びＩＬ−２のサイトカイン混合
物は毒性の有意な増加を生じさせない（ＩＬ−２とＩＦ
Ｎ−γとの組合わせはそれぞれ単独、Ｌりも有意に毒性
が高い）。

以下余白

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）とインターロイキン−２（
   ＩＬ−２）との混合物、ＴＮＦとインターフェロン−β
   （ＩＦＮ−β）との混合物、又はＴＮＦとＨＬ−２とＩ
   ＦＮ−βとの混合物（ＴＮＦ、ＩＬ−２及びＩＦＮ−β
   は哺乳動物種に由来する）の相乗的有効量を含んで成る
   、癌の治療のために哺乳類種に非経口投与又は皮下投与
   するのに適する組成物。 ２、ＴＮＦ及びＩＬ−２及び／又はＩＦＮ−βのための
   医薬として許容される担体をさらに含んで成る特許請求
   の範囲第１項に記載の組成物。 ３、ＴＮＦ及びＩＬ−２が使用され、そしてＴＮＦがヒ
   ト又はラビットのＴＮＦであり、そしてＩＬ−２がヒト
   ＩＬ−２である特許請求の範囲第１項又は第２項に記載
   の組成物。 ４、ＴＮＦが最初の８個のアミノ酸が除去されたミュー
   ティンであり、そしてＩＬ−２がｄｅｓ−ａｌａ＿１−
   ＩＬ−２ｓｅｒ＿１＿２＿５である特許請求の範囲第３
   項に記載の組成物。 ５、ＴＮＦの量が宿主の体重ｋｇ当り２３０〜２６０μ
   ｇであり、そしてＩＬ−２の量が宿主の体重ｋｇ当り１
   ５，０００〜８００，０００ユニットである特許請求の
   範囲第４項に記載の組成物。 ６、ＴＮＦ及びＩＦＮ−βが使用され、そしてＩＦＮ−
   βがマウスＩＦＮ−βでありそしてＴＮＦがヒトＴＮＦ
   である特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の組成物
   。 ７、癌が白血病、黒色腫、肥満細胞腫又はリンパ腫であ
   る特許請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載
   の組成物。 ８、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）とインターロイキン−２（
   ＩＬ−２）、ＴＮＦとインターフェロン−β（ＩＦＮ−
   β）、又はＴＮＦとＩＬ−２とＩＦＮ−β（ＴＮＦ、Ｉ
   Ｌ−２及びＩＦＮ−βは哺乳類種に由来する）の相乗的
   有効量を投与することを含んで成り、ここでＴＮＦ及び
   ＩＬ−２を逐次的に投与する場合にはＩＬ−２の投与の
   前にＴＮＦを投与する、ヒトを除く哺乳類の癌の治療方
   法。 ９、ＩＮＦ及びＩＬ−２を別々に投与する特許請求の範
   囲第８項に記載の方法。 １０、ＴＮＦ及びＩＬ−２をインビトロで混合した後に
   投与する特許請求の範囲第８項又は第９項に記載の方法
   。