JP2528114B2

JP2528114B2 - 腫瘍壊死因子を含んで成る組成物

Info

Publication number: JP2528114B2
Application number: JP62085887A
Authority: JP
Inventors: リーウィンケルヘイクジェフリー; ジンマーマンロバート
Original assignee: シタスコ−ポレイシヨン
Priority date: 1986-04-09
Filing date: 1987-04-09
Publication date: 1996-08-28
Anticipated expiration: 2011-08-28
Also published as: AU608509B2; GR3002779T3; FI871545A0; DK182387A; IL82143A; DK182387D0; JPS62242629A; EP0248516A1; CA1290249C; AU7117687A; FI871545A; DE3771584D1; ES2039236T3; IL82143A0; EP0248516B1

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕この発明は、腫瘍壊死因子（TNF）とインターロイキ
ン−２（IL−２）との相乗的混合物を含んで成る抗腫瘍
治療剤に関する。

〔従来の技術〕

正常末梢血リンパ球により生産されそして植物レクチ
ン、抗原又は他の刺激剤への暴露の後抗原又はマイトジ
エンにより刺激されたＴ細胞の増殖を誘導するリンホカ
インであるインターロイキン−２は、Morgan,D.A.等、S
cience（1976），193:1007−1008により最初に記載され
た。刺激されたＴリンパ球の増殖を誘導するその能力の
ためにＴ細胞増殖因子と呼ばれたが、現在ではこの増殖
因子としての性質に加えてインビトロ及びインビボで免
疫系細胞の種々の機能を調節することが認識され、イン
ターロイキン−２（IL−２）と再命名されている。

IL−２は最初、ヒト末梢血リンパ球（PBL）又は他のI
L−２生産性セルラインを培養することにより製造され
た。例えば、米国特許No.4,401,756を参照のこと。組換
DNA技法はIL−２の生産のためのPBL及びセルラインの代
替物を提供した。Taniguchi,T.等、Nature（1983），30
2:305−310;及びDevos,R.,Nucleic Acids Research（1
983），11:4307−4323はヒトIL−２遺伝子のクローニン
グ及び微生物中でのその発現を報告している。

米国特許No.4,518,584は、野性型又は天然の分子の12
5位に存在するシステインがセリン又はアラニンのごと
き中性アミノ酸で置き換えられているIL−２のミューテ
インを記載しそしてクレームしている。クロラミンＴ又
は過酸化物酸化に対して感受性の各メチオニンがアラニ
ンのごとき保存的アミノ酸により置き換えられている、
生物学的に活性なIL−２のごとき酸化耐性を製造するこ
とができる。米国特許No.4,530,787及びNo.4,569,790
は、組換天然型IL−２及びそのミューテインの精製方
法、並びに精製された形態のIL−２を開示しそしてクレ
ームしている。

PCT W085/04328は、微生物的に生産された酸化された
組換IL−２を含んで成る、医薬として許容される水性ビ
ヒクル中に再溶解するために適当なIL−２組成物を開示
している。IL−２は、悪性疾患又は前−悪性疾患治療に
おける細胞毒性化学療法もしくは照射又は外科手術との
組合せにおいて直接療法的に又はアジュバントとして、
あるいは他の免疫調節剤、天然に存在するリンホカイン
類（例えば、IL−１、IL−２、CSF−１及びIFN類）、又
は悪性疾患の治療における誘導性抗−細胞毒素との組合
せにおいて有用であると記載されている。

S.Rosenberg及び共同研究者〔Mule等、Science（198
4），225:1487;及びS.Rosenberg等、New England Journ
al of Medicine（1985），313:1485−1492を参照のこ
と〕によりヒトIL−２の種々の療法的適用が研究されそ
して報告されている。

インターフェロン（IFN）は、抗−ウイルス、抗−癌
及び免疫調節挙動を示すことが知られている天然蛋白質
の一群を構成する。IFNの２つのタイプ、すなわちＩ型
及びII型が、それらの観察された生物学的性質及び分子
構造の差異に基いて同定されている。β−インターフェ
ロン（IFN−β）は、ウイルスのチャレンジにより繊維
芽細胞中で誘導され得、そして約165個のアミノ酸を含
有するＩ型インターフェロンである。IFN−βは白血球
中で誘導されるＩ型IFNであり、そしてIFN−γは特異的
マイトジエン刺激に反応してリンパ球中で誘導されそし
て146個のアミノ酸を含有するII型IFNである。

ヒトIFN−βは、例えばSugano等の1981年６月６日に
公開されたEP 28,033、及びRevel等の1981年６月10日に
公表された英国特許No.2063,882に記載されている様に
して、組換DNA技法により製造することができる。さら
に、IFN−βは、米国特許No.4,588,585に記載されてい
る様に、生物学的活性に必須でないアミノ酸が他のアミ
ノ酸に置き換えられて安定性が増大しているミューテイ
ンであってもよい。マウスIFN−βもまた組換DNA技法に
より製造することができる。

Paucker等、Virology，17:324−334（1962）によりIF
NがマウスＬ細胞の増殖速度を抑制することが示された
後、多くの研究者がIFNによるマウスＬ細胞の処理、及
びIFNによる腫瘍細胞増殖の阻害を研究した。例えばBor
den,E.C.,Ann.Intern.Med.，91:472−479（1979）を参
照のこと。

腫瘍壊死因子（TNF）は最初Carswell等、PNAS（USA）
（1975），72:3666−3670により、マウス中で増殖する
場合に化学的に形質転換された腫瘍細胞の壊死を惹起す
る、エンドトキシンにより誘導される血清因子として記
載された。ネズミTNFの精製された調製物がネズミ及び
ヒトセルラインに対してインビトロで試験されている。
K.Haranaka及びN.Satomi,Japan J.Exp.Med.（1981），5
1:191。正常細胞とは異なり、両種からの腫瘍セルライ
ンはマウスTNFの細胞毒性活性に感受性であった。さら
に、ネズミTNFはヌードマウス中のヒト及びマウスの移
植された腫瘍に対して毒性であると報告された。K.Hara
naka等、Int.J.Cancer（1984），34:263−267。ヒトTNF
も新生物細胞に対して毒性であることが知られており、
そして組換形で製造されている。Pennica等、Nature（1
984），312:724−729;Shirai等、Nature（1985），313:
803−806;及びWang等、Science（1985），228:149−154
を参照のこと。

ラビットTNFのクローニングが、1985年６月26日に公
開されたEP 146,026（大日本製薬）及び1985年７月17日
に公開されたEP 148,311（旭化成工業）に開示されてい
る。151個及び155個のアミノ酸（天然型より２個及び６
個少ない）を有するヒトTNFのクローニングが1985年９
月25日に公開されたEP 155,549（大日本製薬）に開示さ
れており、そして155個のアミノ酸を有するヒトTNFが19
85年10月16日に公開されたEP 158,286及び1985年11月20
日に公告された対応するGB 2,158,829Aに開示されてい
る。成熟TNF（157個のアミノ酸）及びその種々の修飾形
（ミューテイン）が1986年１月15日に公開されたEP 16
8,214（ゼネンテック）及び1985年10月３日に出願され
そして1986年４月に公開されたPCT US85/01921（シタス
・コーポレイション）に開示されている。

ヒトの悪性腫瘍を治療するために２種類又はそれより
多くの抗癌剤を使用する組合せ療法が現在研究及び臨床
において使用されている。抗癌剤は抗代謝剤、アルキル
化剤、抗生物質、一般毒等であることができる。ほとん
どの癌、例えば癌腫、黒色腫、リンパ腫及び肉腫に対す
る相乗効果を得るため、並びに薬剤耐性細胞の出現を低
下せしめ又は除去するため及び各薬剤に対する副作用を
減少せしめるために、１つの試みとして薬剤の組合せが
投与される。

相乗的な生物学的効果を得るためにＩ型インターフェ
ロン及びII型インターフェロンを組合わせることが知ら
れている。例えば、Fleishman.W.R.,Cancer Res.（198
2），42:869−875及びDeClercq,E.等、Cancer Letters
（1982），15:223−228（マウスIFN）、並びに1984年５
月２日に公開されたヨーロッパ特許出願公開107,498
（ヒトIFN−γ及びIFN−α又は−β）を参照のこと。Ma
rk等（シタス・コーポレイション）の米国特許No.4,51
8,584は、IL−２ミューテインとγ−インターフェロ
ン、Ｂ細胞増殖因子、及びIL−１との組合せを開示して
いる。さらに、IL−２がIFN−γと共に、腫瘍担持宿主
を治療するために、相剰的結果をもって〔1985年７月24
日に公開されたヨーロッパ特許出願No.149,551（ゼネン
テック）及び1985年10月31日に公開された独国特許出願
公開No.3411184（デント・ロテン・クロイッェス）〕、
又はナチュラルキラー活性の性の増強をもって〔Sveder
sky等、J.Immunol.（1984），133:714−718、及びShala
by等、J.Interferon Res.（1985），5:571−581〕使用
されることが開示されている。しかしながら、Lopez−B
otet等、Eur.J.Immunol.（1984），14:1137−1141は、
ヒトＴ細胞クローンにおいてナチュラルキラー様活性を
誘導するためにIL−２及びIFN−γの組合せは十分でな
いと報告した。さらに、Dempsey等、J.Immun.（198
2），129:2504−2510から、ナチュラルキラー細胞の活
性化の惹起においてIFN−α又はIL−２単独よりもIFN−
α及びIL−２の組合せがより効果的であることが知られ
る。さらに、Preclinical Screening Lab.,BRMPのTalma
ge博士は1986年に、マウスにおける転移疾患を治療する
ためにTNF及びIFN−γを使用する効果の増強を報告し
た。1985年１月23日に公開されたEP 131,789（スローン
ケッタリングインスティテュート・フォア・キャンサー
リサーチ）、及び1986年１月15日に公開されたEP 168,2
14（ゼネンテック）はマウスにおける種々の腫瘍を治療
するためのTNF及びIFN−γの相乗効果を開示している。
1985年６月20日に公開されたEP 170,843は、癌の増殖に
対するTNFとIFN−α、−β及び／又は−γとの相剰効果
を開示している。さらに、ヒトTNF及びヒトIFNのインビ
ボ効果について、Williamson等、Proc.Natl.Acad.Sci.
（1983）50:5397−5401を参照のこと。

腫瘍担持動物に対するIL−２及びTNFのみ、又はこれ
らとIFN−βとの組合せの効果は研究されていない。

〔本発明の説明〕

従って、この発明は、TNF及びIL−２及び／又はIFN−
β（ここで、TNF、IL−２及びIFN−βは哺乳類種に由来
する）の混合物の相乗的効果を含んで成る癌の治療のた
めに哺乳類宿主に非経口的又は皮下投与するために適当
な組成物に関する。

他の観点において、この発明は、TNF及びIL−２及び
／又はIFN−β（ここで、TNF、IL−２及びIFN−βは哺
乳類種に由来する）の相乗的有効果を宿主に投与し、TN
F及びIL−２を逐次的に投与する場合にはIL−２の投与
の前にTNFを投与する、ことを含んで成る哺乳類宿主に
おける癌の治療方法を提供する。

好ましくはTNFはラビット又はヒトTNFであり、そして
IL−２はヒトIL−２であり、そしてIFN−βはヒト又は
マウスIFN−βであり、そしてすべての蛋白質は微生物
的に組換生産された蛋白質である。

IL−２とTNFとの組合せが、黒色腫、白血病、肥満細
胞腫、及び肺癌のごとき種々の形の癌の治療において驚
くべき相乗作用を提供することが見出される。

この明細書において使用する場合、“治療”なる語
は、患者が癌を有するとなんらかの手段により決定され
た後の、IFNとIL−２、TNFとIFN−β、又はTNFとIFN−
βとIL−２の患者への投与に関する。処置の後に腫瘍が
現われるか、又は存在する腫瘍負荷が低下もしくは除去
されない場合、その処置は療法的ではないと考えられ
る。投与の効果は時間と共に低下し、腫瘍が可視的とな
った後５〜７日が治療を与えることができる最大期間で
あり、主として腫瘍のタイプ及び投与量に依存する。

この明細書において使用する場合、“癌”なる語は、
あらゆる新生物疾患に関し、これには細胞性疾患を包含
し、例えば腎細胞癌、カポシ（Kaposi）肉腫、慢性白血
病、乳癌、肉腫、卵巣癌、直腸癌、咽喉癌、黒色腫、結
腸癌、膀胱癌、肥満細胞腫、肺癌、及び胃腸又は胃癌を
包含する。好ましくは、癌は白血病、肥満細胞腫、黒色
腫及びリンパ腫である。

この明細書において使用する場合、IL−２及びTNFに
適用される“相乗的有効量”なる語は、宿主の生存のた
めに有効であり、そしてTNFの投与量対IL−２の投与量
対宿主の生存の投与量−応答プロットにおいてTNF投与
量軸及びIL−２投与量軸のいずれとも交差しない混合物
中の各成分の量に関する。同じことがIFN−β及びTNFに
もあてはまる。INF−β、IL−２及びTNFがすべて存在す
る場合、３成分のために３軸が使用される。この発明に
おいて相乗性を決定するために使用される投与応答曲線
は、Sande等、the Pharmacological Basis of Therapeu
tics、マクミラン出版、ニューヨーク（1980）,1080−1
105頁に十分に記載されている。相剰作用決定のため、
治癒は、腫瘍を移植した日からMeth A腫瘍については14
日後、そして他のすべての腫瘍については60日後の宿主
の治癒として定義される。最適相乗性は、95％信頼限界
を用いて、投与量レベル、スケジュール及び応答のごと
き因子を変え、そしてIL−２とTNF、IFN−βとTNF、又
はIL−２とIFN−βとTNFとの種々の組合せについての応
答曲線からイソボログラムを生じさせるコンピューター
により生じるモデルを使用することにより決定すること
ができる。投与量応答曲線上の最高生存率は最適投与量
レベルと相関する。

この明細書において使用する場合、“組換（体）”な
る語は組換DNA技法により生産されたTNF、IL−２及びIF
N−βに関し、この技法においては一般に、既知の組換D
NA技法によりTNF、IL−２又はIFN−３をコードする遺伝
子がクローン化される。例えば、ヒトTNF又はIL−２のc
DNAあるいはマウスIFN−βのcDNAを鋳型として使用して
ヒトIL−２又はIL−２のcDNAあるいはマウスIFN−βのc
DNAに対する相補性を示す遺伝子を適当なDNAベクター、
例えば細菌プラスミド、好ましくはE.コリ（E.coli）プ
ラスミドに挿入して組換プラスミドを得、そしてこのプ
ラスミドを使用して適当な宿主を形質転換する。遺伝子
を宿主中で発現せしめることにより組換蛋白質を得る。
この目的のための組換プラスミドの例にはpBR322、pCR
1、pMB9/及びpSC1が含まれる。形質転換される宿主は真
核性宿主又は原核宿主であり、好ましくは原核性宿主で
ある。

この明細書において使用する場合、“医薬として許容
される”なる語は、活性成分の生物学的活性の有効性を
妨害せず、且つ投与される宿主に対して毒性でないキャ
リャー媒体に関する。

この発明の方法は、相乗的有効量のTNFとIL−２、TNF
とIFN−β、又はTNFとIL−２とIFN−βを哺乳類宿主、
好ましくはヒト宿主に投与することを含む。IL−２及び
／又はIFN−β及びTNFは投与前にインビトロで混合する
ことができ、又は宿主に別々に投与することができる。
IFN−β及びTNFは同時に又は一方の成分に続いて他方の
成分を投与することができ、第二の投与は第一の投与が
完了した後一般に約５〜10分間以内、好ましくは約５分
間以内に行う。IL−２及びTNFを使用する場合、これら
を同時に、又はTNFに続いてIL−２を投与することがで
き、第二の投与は一般に第一の投与が完了した後に行
う。TNFの投与前のIL−２の投与は相剰作用をもたらさ
ず、そしてIL−２はそれに続くTNF処置に対する腫瘍の
感受性を低下せしめる。

投与は適当な技法、例えば皮下投与又は非経口投与に
より行うことができる。非経口投与の例には静脈内投
与、動脈内投与、筋肉内投与及び腹腔内投与が含まれ、
ネズミのモデルを使用する場合には腹腔内投与が好まし
い（便宜上）。

投与量及び投与方法は主として、IL−２、TNF及びIFN
−βが別々に又は同時に混合物として投与されるか否
か、癌のタイプ、患者、及び患者の病歴に依存するであ
ろう。量は腫瘍の相乗的な減少を達成するために効果的
なものでなければならない。投与は単一投与でも多数回
投与でもよい。多数回投与が用いられる場合、好ましく
は、投与の頻度は例えば宿主のタイプ、癌のタイプ、投
与量等に依存するであろう。幾つかのタイプの癌又は癌
セルラインのためには毎日の投与が効果的であり、他方
他の癌のためには隔日投与又は３日に１度の投与が効果
的であるが毎日の投与は効果的でない。臨床医は任意の
特定のケースについて、いかなる投与経路及び投与頻度
が最も効果的であるかを日常の実験の後に確認すること
ができよう。

この発明において最も効果的であると思われる投与量
は腫瘍を出現させず又は完全に消失させ、そして宿主に
対して毒性でない量である。この最適レベルは多くの因
子、例えば宿主のタイプ、癌のタイプ、投与の経路及び
スケジュール、存在する腫瘍負荷、IL−２、IFN−β及
びTNFのタイプ、並びに毒性の定義に依存するであろ
う。宿主に対する毒性は副作用の程度及びタイプによ
り、又は一定時間後の体重の減少量もしくは死により定
義される。体重の減少が毒性の基準である場合、典型的
には10〜20重量％の減少は許容され、20％より大きな減
少が毒性であると考えられるであろう。20％より多くの
体重の減少を毒性と考え、宿主がネズミでそして投与経
路がインビトロで調製される混合物の腹腔内投与であり
そして毎日又は隔日投与であれば、微生物的に生産され
た組換TNF及びIL−２の各投与の投与レベルは、宿主体
重kg当り約230〜260μｇ（さらに好ましくは約250μ
ｇ）のTNF、及び宿主体重kg当り約15,000〜15,000,000
ユニット（さらに好ましくは15,600〜625,000ユニッ
ト）のIL−２であろう（ここで1000ユニットは１μｇで
ある）。

非経口投与のため、IL−２、TNF及びIFN−βは一般
に、好ましくは本質的に非毒性でありそして非療法的で
ある医薬として許容されるキャリャー媒体中の単位投与
注射形（溶液、懸濁液、エマルジョン）に製剤化される
であろう。この様なビヒクルの例には、塩溶液、リンゲ
ル溶液、デキストロース溶液、マンニトール、及び正常
血清アルブミンが含まれる。硬化油及びオレイン酸エチ
ルのごとき非水性ビヒクルを使用することもできる。キ
ャリャー媒体は少量の添加剤、例えば等張性及び化学的
安定性等を増強する物質、例えば緩衝剤、並びに防腐剤
を含有することができる。IL−２、TNF及びIFN−βは典
型的にはこの様なキャリャー中にそれぞれ約0.1mg/ml〜
100mg/mlの濃度、好ましくは各0.2〜1mg/mlの濃度で配
合される。

この方法に代り、IL−２、TNF及びIFN−βを無菌の安
定な凍結乾燥形に製剤化することができ、この製剤中で
は精製されたIL−２、TNF及びIFN−βが嵩を与えるマン
ニトールのごとき水溶性キャリャー、並びに組換IL−２
及びIFN−βの水中への溶解性を保証するのに十分な量
のドデシル硫酸ナトリウムと混合されている。この製剤
は非経口投与のための水性注射液に再溶解するために適
当であり、そして安定でありそしてヒトの患者において
よく許容される。製剤化方法はPCT W085/04328にさらに
完全に記載されている。

他の態様においては、IL−２及びTNFの混合物は採用
される免疫療法において、医薬として許容されるキャリ
ャー中単離されたリンホカインで活性化されたリンパ球
と共に投与され、この場合リンパ球は、IL−２及びTNF
と共に腫瘍を有するヒトに投与された場合、腫瘍に対し
て反応性である。この方法は、S.Rosenberg等、New Eng
land Journal of Medicine（1985），313:1485−1492に
記載されている。S.Rosenberg等、Science,233:1318−1
321（1986）に記載された他の方法においては、IL−２
中で拡大された腫瘍インフィルトレート（tumor−ifilt
rating）リンパ球（TIL）が、特にシクロホスファミド
との組合せにおいて、治療のために移送される。Rosenb
erg等のTIL法も本発明において使用することができる。

上記のように、この発明のIL−２、TNF及びIFN−β
は、組織培養から又は組換技法により、そして任意の哺
乳類源、例えばマウス、ラット、ラビット、霊長類、ブ
タ、及びヒトから調製される任意のIL−２、TNF及びIFN
−βであることができる。好ましくは、TNFはラビット
又はヒトに由来し、さらに好ましくはヒトに由来し、IF
N−βはマウスに由来し、そしてIL−２はヒトに由来す
る。さらに好ましくは、IL−２、IFN−β及びTNFは組換
IL−２、組換IFN−β及び組換TNFである。組換IL−２
は、Taniguchi等、Nature，302:305−310（1983）及びD
evos,Nucleir Acids Research，11:4307−4323（1983）
に記載されているように、天然ヒトIL−２遺伝子をクロ
ーン化し、そしてこれを形質転換された微生物中で発現
せしめることにより得られる。これは、野性型又は天然
の分子の125位に通常存在するシステインが除去されて
いるか又はセリンもしくはアラニンのごとき中性アミノ
酸により置き換えられている、米国特許No.4,518,584に
記載のIL−２ミューテイン、あるいは野性型又は天然の
分子の104位に通常存在するメチオニンがアラニンのご
とき中性アミノ酸により置き換えられているIL−２ミュ
ーテインであることができる。

好ましくは、IL−２は、ヒトcDNA配列により、又は58
位及び105位のシステインのジスルフィド結合を含む天
然ヒトIL−２のアミノ酸配列と少なくとも実質的に同じ
アミノ酸配列を有しそして天然ヒトIL−２と共通の生物
学的活性を有する蛋白質をコードするIL−２の変形され
たヒトcDNA配列により形質転換された微生物により生産
される未グリコシル化蛋白質である。アミノ酸配列の実
質的同一とは、配列が同一であるか、又は合成蛋白質と
天然ヒトIL−２との間の不都合な機能的非類似性を惹起
しない１又はそれより多くのアミノ酸の変化（欠失、付
加、置換）により異ることを意味する。このような性質
を有するIL−２蛋白質の例には、Taniguchi等、Nature
（1983），302:305−310;Devos,Nucleir Acids Researc
h（1983），11:4307−4323;ヨーロッパ特許出願公開No.
91,539及び88,195;並びに米国特許No.4,518,584、前
掲、により記載されているもの並びにIL−2ala₁₀₄ser
₁₂₅が含まれる。最も好ましくは、IL−２は、最初の末
端アラニンが除去されておりそして125位のシステイン
がセリン残基に置き換えられているdes−ala₁−IL−2se
r₁₂₅ミューテイン、並びに天然IL−２の最初の５個のＮ
−末端アミノ酸の少なくとも１個が欠けているIL−２で
ある。

IL−２は1986年２月11日に発行された米国特許No.4,5
69,790中に記載されている方法により臨床的純度に精製
することができる。

他の製剤において、IL−２は洗剤によってではなく、
IL−２をポリエチレングリコールホモポリマー又はポリ
オキシエチル化ポリオールから選ばれた活性化されたポ
リマーと反応せしめることによって可溶化される。ポリ
マーは好ましくは300〜100,000ダルトン、さらに好まし
くは350〜40,000ダルトンの分子量を有する。このポリ
マーは、IL−２のアミノ基又はチオール基及びホモポリ
マーのヒドロキシ基の両者と反応する末端基を有するカ
ップリング剤との接合により活性化される。このような
カップリング剤の例にはヒドロキシベンゼンスルホン酸
エステル、シアヌル酸クロリド、及びＮ−ヒドロキシサ
クシンイミドが含まれる。この修飾により、生理的pHに
おいてIL−２を可溶可するために洗剤を添加する必要が
ない。次に、インターロイキンを水溶性キャリャー及び
緩衝液と上記のように配合し、そして配合物を凍結乾燥
し、そして凍結乾燥された混合物を上記のように再溶解
する。

この発明のIFN−βは、Metz,Adv.Drug Res.，10:101
−156により教示されるように、ウイルス又は二本鎖ポ
リリボヌクレオチドのごときインターフェロン誘導剤に
暴露された細胞により自然に生産される。IFN−βはま
た、1981年６月６日に公表されたEP 28,033により開示
されている方法のような組換手段によっても製造され
る。IFN−βのミューテインはまた、米国特許No.4,588,
585に記載されているようにしても製造される。特に、
好ましいIFN−βミューテインは、グリコシル化されて
おらず、Ｎ−末端メチオニンを欠き、そして天然IFN−
βの17位のシステイン残基が部位特異的変異誘発によっ
てセリンで置き換えられているIFN−βses₁₇である。IF
N−βは米国特許No.4,462,940に記載されている方法に
よって製造することができる。

さらに、この発明の好ましいIFN−βであるマウスIFN
−βは既知の組換技法により製造することができる。

組換ヒトTNFは、Pennica等は、Nature（1984），312:
724−729;Yamada等、J.Biotechnology（1985），3:141
−153;Wang等、Science（1985），228:149−154;1985年
９月29日に公開されたEP 155,549;1985年10月16日に公
開されたEP 158,286;1986年１月15日に公開されたEP 16
8,214;及び1986年４月に公開されたPCT US85/01921に記
載されている様にして得ることができる。組換ラビット
TNFは、1985年６月26日に公開されたEP 146,026、及び1
985年７月17日に公開されたEP 148,311に記載されてい
る様にして製造することができる。好ましくは、TNFは
最初の８個のアミノ酸残基が除去されているヒトTNFで
あるか、又はTNFは米国特許No.4,518,584に記載されて
いるのと同様にして調製されたシステインが除去された
ミューテインである。

この発明の種々の観点を次の例によってさらに記載す
るが、これによりこの発明の範囲を限定するものではな
い。これらの例においては、特にことわらない限り、固
体についてのすべての重量により、そして液体及び気体
のすべての％は容量により、そしてすべての温度は０℃
で示す。

例1. A.一般的処置マウス雌性BDF1、C57B1及びBalb/cマウス並びにCDラットを
インビトロ試験に使用した。マウスは処置群（５又は10
匹）が平均20g±3gとなる様に体重を一致させそしてラ
ンダム化した。すべての動物を検疫観察のため到着後７
日間保持し、マイクロアイソレーターケージに保持し、
そして水を自由に取らせながら標準実験室飼料を供与し
た。

IL−２この例において使用した組換IL−２はWang等、Scienc
e（1984）224:1431−1433により記載されている。des−
ala₁−IL−2ser₁₂₅である。このIL−２のアミノ酸配列
は、天然分子の最初のアラニンを欠いておりそして125
位のシステインがセリンに変っている点において天然ヒ
トIL−２のアミノ酸配列と異る。このIL−２を生産する
E.コリのサンプルはシタス・コーポレイションによりア
メリカン・タイプ・カルチュア・コレクション，パーク
ラウンドライブ12301,ロックビル,Md,米国に1983年９月
26日に受託番号No.39,452として寄託され、そして1984
年３月６日受託番号No.39,626としてブタペプト条約に
基き寄託された。

IL−２はTCT W085/04328の明細書及び第１図に記載さ
れている様にして処理しそして精製した。但し、ｏ−ヨ
ードソベンゾエートによってではなく米国特許No.4,57
2,798に記載されている様にして塩化銅を用いて酸化を
行った。IL−２をクロマトグラフィー段階から回収した
時、これを凍結乾燥し、そしてIL−２を還元状態に保つ
ために還元剤（DTT）を含有しそしてそれを溶液状に保
つために可溶化剤を含有する中性水性緩衝液中に再懸濁
した。クロマトグラフィー段階後の組換IL−２の純度は
95％以上であり、そしてこのIL−２はリムナス試験によ
り決定した場合約0.02ng/ml未満のエンドトキシンを含
有した。

精製されたIL−２（３〜５×10⁶ユニット/mg）を無菌
バイアル中の凍結乾燥粉末として製造し、そして使用前
４日以内に無菌リン酸緩衝化塩を用いて再溶解し、そし
て50mg/mlマンニトールを伴う0.3mg/mlの濃度に製剤化
した。

これに代る製剤においては、Ｎ−ヒドロキシサクシン
イミドを用いて接合体化されたポリエチレングリコール
との反応によりIL−２を製剤化した。接合体にされた蛋
白質（IL−２−PEGと称する）を水中に直接製剤化し
た。

TNF Ｎ−末端から最初の８個のアミノ酸が除去されている
ヒトTNFのミューテインを、Wang等、Science（1985）22
8:149−153により記載されている様にして調製した。要
約すれば、TNFをHL−60細胞から誘導し、精製しそして
配列決定した。次に、富化されたmRNAを調製し、cDNAラ
イブラリーを造成し、プローブを選択し、そして該ライ
ブラリーをプローブして配列を回収することによりヒト
TNFをコードするイントロンを含まない配列を調製し
た。次に、成熟蛋白質のＮ−末端バリンをコードするGT
Cのすぐ前に部位特異的変異誘発によりATG開始コドンを
導入した。クローンを選択し、そして鎖を発現ベクター
に連結してミューテインの原核性発現を得た。次にミュ
ーテインをカラム精製し、精製緩衝液中に回収し、そし
て無菌バイアル中凍結乾燥粉末として得た。最後に、使
用前４日以内にこれを無菌リン酸緩衝化塩溶液を用いて
再溶解し、４℃にて貯蔵した。このTNFは、製造ロット
に依存して0.001〜0.006ng未満のエンドトキシン／蛋白
質を有していた。

癌セルライン使用した標的細胞はネズミ腫瘍L 1210（白血病）、P
388（白血病）、P 815（肥満細胞腫）、及びEL−４（リ
ンパ腫）（これらはいずれもアメリカン・タイプ・カル
チュア・コレクション、ロックビル、MDから得られ
る）、並びにFidlerセルラインの10回のインビトロ及び
インビボ継代によって得られるFidlerラインF 10（黒色
腫ネズミセルライン）のサブクローンでありそしてWink
elhake等、Cancer Res．（1979）39:3058−3064により
記載されているB16W10（黒色腫）である。

すべてのセルラインは、移植の直前に凍結ストックか
ら組織培養（37℃,8％CO₂、10％ウシ胎児血，清及び2mM
L-Glnを含有するRPMI 1640倍地中）を２回通してた。
すべての腫瘍及びセルラインはマイコプラズマ及びマウ
ス抗−ウイルス抗体生産についての試験において陰性で
あった。

皮下腫瘍注射腫瘍細胞を培養懸濁液又はモノレーヤーから収得し
た。皮下腫瘍のため、細胞（５×10⁵〜10⁶）を肩甲骨上
領域に注射した。腹腔内（ip）腫瘍のため、10⁵細胞を
マウスに接種した。B16W10黒色腫静脈内注射（肺、iv）
転移モデルのため、細胞をトリプシン−EDTAを用いて組
織培養プレートから取り出し、リン酸緩衝化塩溶液中で
２回すすぎ、そして10⁴細胞を0.2mlの容量で側尾静脈に
注射した。マウスがいずれのリンホカインによっても処
置されなかった場合、ip、iv又はsqのいずれの場合に
も、接種後20〜30日以内にすべて死亡した。

実験方法投与当り５匹のマウスから成る群を使用した。但し、
B16W10 ivモデルについては群サイズを10とした。動物
は特にことわらない限り０日に腫瘍チャレンジを受け、
そしてすべての処置はipであり、腫瘍チャレンジの後示
された日に始め、そして１日１回、14日間続けた。皮下
モデルについては、各実験を通じて同じ測定により直交
する三方向において直線キャリパスを用いて腫瘍を測定
した。この技法を適用する場合個体間の差が存在した
が、同じ個体により行われた反復測定は５％未満の誤差
を示した。検討されたすべての腫瘍は約２cm³の体積に
増殖することが許容され、この点からその後の測定が困
難となり、動物を殺した。

ip腫瘍については、動物を毎日生存について観察し
た。試験されたすべての腫瘍は移植の約30日以内にネズ
ミにとって致死的となるので、延命の観察を60日間以上
行った。

iv投与されたB16モデルについては、細胞接種の後17
〜21日で動物を殺し、そして肺コロニーを計数した。

B.結果 1.第１表は、TNF単独、IL−２単独、及びTNFとIL−２と
の種々の混合物（インビトロ調製されたもの）をマウス
体重1kg当り示された量で、２×10⁶のP815細胞をsq移植
された群当り５匹の雌性BD2F1マウスに、腫瘍の移植の
後１日目から始めて20日間続けて１日１回投与した。対
照にはPBSのみを20日間にわたり毎日１回注射した。

表中、“触知”は触知可能な腫瘍を意味する。

この結果によれば、皮下P815肥大細胞腫モデル（これ
は１日目から14日目まで毎日１回250μg/kgのTNFをip投
与したことに相当し、そしてIL−２を同じ方法で10,00
0,000ユニット/kgまで投与したことに相当しない）は、
IL−２を同時に投与した場合、TNFの５倍少い投与量に
相当した。さらに、TNF及びIL−２をそれぞれ250μg/kg
及び625,000ユニット/kgで一緒に投与した場合、腫瘍が
出現しなかった。

2.第２表は,TNFのみ、IL−２のみ、及びTNFとIL2との種
々の混合物（インビトロで調製したもの）をマウス体重
kg当り示された量で、10⁶個のL1210細胞をsq移植された
群当り10匹の雌性BDF1マウス（体重24±3g）に、腫瘍の
移植後１日目から始めた13日間続けて一日１回投与した
場合に得られた結果を示す。対照にはPBSのみを13日間
毎日１回注射した。

この結果は、L1210腫瘍が250μg/kgのTNF単独（最大
許容投与量）にも5,000,000ユニット/kgのIL−２単独に
も応答しなかったことを示した。約260μg/kgより多く
のTNF又は937,500ユニット/kgより多くのIL−２の投与
は20％を超える体重の減少をもたらし、毒性を示した。
250μg/kgのTNFを9,900ユニット/kgのIL−２と組合わせ
た場合を除き、IL−２及びTNFを一緒に投与した場合腫
瘍が生じなかった。

3.第３表は,TNF単独、IL−２単独、及びTNFとIL−２と
の種々の混合物（インビトロで調製されたもの）をマウ
スの体重kg当り示された量で、１×10⁶個のB16細胞をsq
移植された群当り５匹の雌性BDF1マウスに、腫瘍の移植
の後１日目から始めて14日間続けて毎日１回腹腔内投与
した場合に得られた結果を示す。対照にはPBSを14日間
毎日１回注射した。

TNFとIL−２との組合わせは腫瘍の増殖を防止したがI
L−２又はTNF単独はそれを防止しなかった。ネズミB16
黒色腫はヒトの黒色腫に非常に類似しており、そしてそ
れ故にこのセルラインに対して多くの研究が行われた。
TNFとIL−２との組合わせはB16細胞に対して効果的であ
るという事実はそれがヒト黒色腫の治療において有効で
あることを示す。

ネズミ腫瘍L12100、p388及びB16は、これらの腫瘍が
腹腔内にある場合でも皮下にある場合でも、TNFにとっ
て基本的に制御しがたいことが見出された。腫瘍サイズ
のわずかな減少がL1210について観察された。この制御
の困難さは、TNF処置が腫瘍の移植後１日間、５日間又
は10日間のいずれにおいても存在した。

4.この実験は,IL−２とTNFとを組合わせて投与するため
の最適スケジュール決定するために行われた。腫瘍が出
現しない最も苛烈なモデル（好結果の治療のための腫瘍
移植後の最終日）を決定した。

この実験において,L1210腫瘍細胞を動物の群に移植
し、そして処置を1,3,7,10、又は14日後に開始した。

第４表は、250μg/kgのTNFと39,060ユニット/kgIL−
２の混合物を、５×10⁶個のL1210細胞をsq移植された群
当り５匹の雌性BDF1マウスに、腫瘍の移植後1,3,7,10、
又は14日から始めて最初の移植から20日目まで毎日続け
て腹腔内投与した場合に得られた結果を示す。対照には
PBSを19日間毎日注射した。

群３〜５及びPBS対照は７日目に触知可能な腫瘍を有
していた。このデーターは、最も苛烈なモデルが３日又
は５日のそれであることを示した（治療を腫瘍移植後７
日目に開始した場合腫瘍の増殖は防止できなかった）。

5.第５表は、TNF単独、IL−２単独、及びIL−２とTNFと
の種々の混合物をマウスの体重kg当り示された量で、３
×10⁶個のP388白血病細胞をsq移植された群当り５匹の
雌性BDF1マウスに、腫瘍移植後１日目から始めて14日間
毎日続けて投与した場合に得られた結果を示す。対照に
はPBSを14日間毎日注射した。

すべての腫瘍が15日目から漸進的に増殖し、21日目ま
でに大き過ぎそして不規則で測定できなくなった。従っ
て、P388腫瘍モデルにおいてはTNFとIL−２とを組み合
わせた毎日の投与は機能しなかった。

6.この実験においてはIL−２の代りにIL−２−PEGを使
用し、そして毎日投与ではなく隔日投与を行った。第６
表に結果を示す。

この結果は、IL−２及びIFNによる１日目、３日目及
び７日目の処置が最も効果的であり、毎日の処置は効果
的でないことを示した。

7.第７表は、12,500ユニット/kgのIL−２及び５μg/kg
のTNFの混合物（インビトロ調製したもの）を、１×10⁶
個のEL−４マウスリンパ腫細胞をsq移植された群当り５
匹の雌性BDF1マウスに、腫瘍移植後１日目から始めて14
日間続けて毎日ip投与した場合に得られた結果を示す。
対照にはPBSを14日間注射した。

TNF及びIL−２の組合わせがEL−４リンパ腫の腫瘍増
殖を防止し、他方対照はそれを防止しなかった。

8.第８表は、12,500ユニット/kgのIL−２及び５μg/kg
のTNFとの混合物（インビトロ調製したもの）を、１×1
0⁶個のB16細胞をsq移植された群当り５匹の雌性BDF1マ
ウスに、腫瘍移植後1,3,5,7、及び10日目から始めて20
日間続けて毎日ip投与した場合に得られた結果を示す。

この結果は、組合せ療法が用いられた場合に小さい腫
瘍負荷のみが治癒することを示している。

9.第９表は、12,500ユニット/kgのIL−２と５μg/kgのT
NFとの混合物（インビトロで調製したもの）を、１×10
⁵個のB16W10細胞を腹腔内（ip）又は静脈内（iv）移植
された群当り５匹又は10匹のBDF1マウスに、腫瘍移植後
１日目から始めて少なくとも14日間にわたり毎日続けて
ip投与した場合に得られた結果を示す。対照には少なく
とも14日間毎日PBSをip又はiv注射した。14日後に、iv
注射された動物を殺し、そしてそれらの黒い小瘤として
の肺コロニーを計数し、そして一セットの肺当りの転移
として示した。

これらの結果は、静脈内移植された腫瘍について人工
的肺転移が存在しないことを示している。腹腔内移植さ
れた腫瘍については対照に対する有意な延命が存在す
る。従って、この実験は、IL−２及びTNFの投与が皮下
以外の身体中のいずれに位置する腫瘍細胞にも機能する
ことを示している。

例2. マウス宿主に移植された標的細胞がメチルコラントレ
ンで誘導された肉腫（Meth A）（Balb/c）（Lloyd Old
博士、メモリアル・スローン・ケッタリングから腹水経
由腫瘍として入手し、ストックとして凍結し、そして使
用前に腹水を少なくとも２回経由したもの）である場
合、数日間にわたり毎日ip注射された50μg/kgマウス体
重のTNFのみ、又は15,625ユニット/kgマウス体重のIL−
２のみは腫瘍の完全な退化を惹起した。しかしながら、
移植後60日以内に80％のマウスにおいて腫瘍が盛り返し
た。これに対して、50μg/kgマウス体重のTNFと、15,62
5ユニット/kgマウス体重のIL−２とのインビトロ調製さ
れた混合物を同じ日数にわたって毎日Meth Aマウスにip
注射した場合、移植後60日以内に腫瘍の盛り返しはなか
った。例１において使用したのと同じIL−２及びTNFを
使用した。この結果が示すところによれば、TNFとIL−
２の混合物は完全な治癒をもたらし、他方いずれかの成
分単独は、例１のモデルに比べて療法剤に対して一般的
に感受性であるMeth-A退化モデルにおいてわずか20％の
治癒をもたらした。

例3. 例１及び２の実験（但し、P388は使用しない）を数回
反復して投与群当り10〜50の動物についてデーターを得
た。これらの研究において、最大許容投与量（MTD）
を、死亡が起こらずそして療法中又はその後５日間の体
重の減少が５％未満であるように注射され得るリンホカ
インの最大量として定義した。TNFについてはこのMTDが
250μg/kg（５μg/20gマウス）であることが見出され
た。IL−２については、すべての療法注射について0.1m
lに維持された容量において最大溶解量8mg/mlを使い
た。従って、IL−２の投与量は、14日間毎日500〜800μ
g/kg（10〜16μg/20gマウス）のip投与であった。

この研究のため、ip腫瘍モデルについての“有意な”
延命は、対照（PBS処置）群の150％より大きい死亡まで
の時間として定義される。腫瘍獲得（tumor take）の完
全なブロック（“治癒”）はsqモデルにおいて最初の腫
瘍チャレンジの後60日間に測定可能な腫瘍が証明されな
いこととして定義される。

この結果が示すところによれば、L1210、P815、B16W1
0及びEL−４モデルにおいてすべての動物がsq腫瘍を生
じさせ、他方動物の95％が一貫してsq Meth-A腫瘍を生
じさせた。２種類のリンホカインを単一剤として療法効
果について評価した場合、TNFがMTDにおいて投与されれ
ば腫瘍チャレンジ後１日目に治療を始めた場合、TNF処
置により幾らかの初期増殖阻害が観察された（L1210及
びP815の場合顕著であった）。IL−２が単一剤として14
日間毎日投与された場合、治療が腫瘍移植の１日以内に
開始された場合にのみ、幾つかの非−MethM-A腫瘍モデ
ル（特にP815）について類似のわずかな効果が見られ
た。

MethM-Aモデルにおいてリンホカインは一層劇的に効
果的であった。なぜなら、TNFの単一投与が、治療が開
始される前10日まで増殖が許容された腫瘍の退化をもた
らしたからである。高投与量のIL−２療法を用いる場
合、７〜10日のMethM-A腫瘍について類似の結果が見ら
れた。しかしながら、TNF又はIL−２が単一剤として最
初の14日間にわたりわずか１日の腫瘍を担持する動物に
反復投与した場合、MethM-A腫瘍の増殖が有意数の動物
について治療終了後約30日間遅れたが、しかし大部分が
45日目までに腫瘍を生じさせた。

非−MethM-Aモデルの結果は、MTDのTNFを最適（溶解
する）量のIL−２と同時に腫瘍のチャレンジの後１日以
内に投与された動物は腫瘍を生じさせないことを示し
た。興味あることには、組合せ中のIL−２投与量は幾つ
かの場合において、腫瘍の“獲得”をブロックするため
に、最適量の１％に減少せしめることができたが、混合
物中のTNFの量は50％を超えて減少せしめることができ
なかった。

IL−２＋TNFの組合せを用いる種々のモデルについて
可能な腫瘍獲得期間の決定のため、処置を１日目に開始
した場合に多部分のモデルにおいて腫瘍獲得をブロック
する固定された投与量（250μg/kgのTNF＋500μg/kgのI
L−２）を用い、そして効果的な組合せ療法を開始する
前に各腫瘍タイプが増殖することが許容され得る時間を
研究した。効果的なTNF＋IL−２療法のためになお許容
される腫瘍獲得のための最大許容時間は平均３〜５日で
あり、但しB16W10については１日目に治療を開始しなけ
ればならなかった。逆にMeth-Aについては、10日腫瘍は
真に“治癒可能”であり、そして退化を示した。これら
のモデルのそれぞれにおいて、最適腫瘍獲得期間の後に
始まる組合せ治療は腫瘍増殖の阻害をもたらしたが治癒
をもたらさなかった。興味あることには、増殖阻害効果
は２週間の処置期間の内１週中初期においてのみ見られ
（言うまでもなく、退化及び増殖阻害が非常に長く続く
Meth-Aを除く）、そして全体的に有効なTNF＋IL−２の
投与量より少い量を投与された動物中の腫瘍は２及び３
週中に対照レベルに急速に増殖した。

５種類のネズミ腫瘍の腹腔内モデルについての単一剤
及び組合せ（TNF及びIL−２）蛋白質療法の結果を検討
した。すべてのケースにおいて、腫瘍細胞接種後１日目
に処置を開始した。TNF及びIL−２の組合わせが皮下モ
デルにおける腫瘍獲得をブロックしたが、これらのリン
ホカインを組合わせて又は単独で投与した場合腹腔内モ
デルにおいて類似のブロックは存在しなかった。しかし
ながら、皮下モデルにおいて腫瘍獲得を全体的にブロッ
クするのと同じ方法を用いてIL−２とTNFとの組合わせ
を投与した場合、腹腔B16黒色腫、EL−４リンパ腫、及
びMeth-A腫瘍について有意な延命が見られた。

最後に、IL−２とTNFの組合せ療法を、B16W10黒色腫
細胞を静脈内接種された動物における単一剤投与と比較
した。皮下腫瘍について腫瘍細胞負荷獲得期間を試験す
るのと同様の研究を行って、治癒療法を開始する前の腫
瘍増殖のために許容され得る時間をさらに明確に決定で
きるようにした。IL−２及びTNFによる処置は、最適量
で同時に投与された場合、処置が腫瘍移植の後１日目に
開始されたなら、相乗的であった。処置が移植後３日目
に開始された場合、肺転移の数は対照に比べて有意に少
なかったが、しかしすべての動物が腫瘍を有していた。

結論として、TNF＋IL−２組合せ療法の相乗性は、
（ａ）最大許容日用量のTNFを必要とするが、毎日投与
におけるIL−２の量は99％削減することができ、（ｂ）
腫瘍負荷、又は移植された細胞が治療の開始前に取るこ
とが許容される時間に拘束され、そしてこの時間は腫瘍
のタイプにより異り、そして（ｃ）皮下腫瘍及び肺腫瘍
のためには効果的であるがしかし腹腔内腫瘍の獲得のブ
ロックをもたらさない、ことが見出された。

これらのモデルにおけるTNFとIL−２の相乗効果はお
そらく複雑な相互作用の結果であろう。好結果の免疫療
法の宿主の腫瘍負荷への見かけ上の依存性に加えて、い
ずれかの理論に拘束されるわけではないが、TNFとIL−
２との間の相乗性は、（ａ）腫瘍細胞へのTNFの直接作
用、（ｂ）細胞溶解性細胞の増加〔おそらく不均一細胞
集団（例えばマクロファージ）に対するTNF作用の間接
的結果としてのIL−２リセプターの発現は他のリンホカ
イン（例えば、IL−２リセプターの発現に影響を与える
IL−１）の放出を生じさせる〕、又は（ｃ）IL−２及び
TNFの両者による細胞溶解性細胞の直接活性化により説
明されるであろう。事実、組合せがＴ細胞を過剰活性化
（hyperactivate）し、又はLAK様活性を開始する可能性
がある。それぞれCTL及びLAK及びCTL依存性であるヌー
ドマウス又はNIH−３（ベージュ−ヌード−XID）マウス
中で増殖した場合にTNFとIL−２との同じ組合せがこれ
ら同じ腫瘍について腫瘍獲得をブロックしないという事
実によって証明されるように、ここに報告される効果は
そのようなエフェクター細胞現象のためであろう。

例4. この例においては、最適投与方法を決定するためにIL
−２及びTNFの投与を評価した。次の実験を行った。

A.Meth-A腫瘍 1.TNF及びこれに続くIL−２腫瘍が皮下にあるMeth-A腫瘍モデルを使用して、７日
間にわたり（PBS＋IL−２の１つのケースにおいては11
日間）腫瘍を担持する５匹ずつのBalb/cマウスの群をラ
ンダム化し、耳に標識をし、そしてTNFにより、IL−２
により、TNF及びこれに続くIL−２により、PBSにより、
又はPBS及びこれに続くIL−２により処置した。腫瘍体
積、体重及び腫瘍の重量の測定は通常14日目に停止し
た。なお、これらの実験中の幾つかの群は43日間維持し
て長期間治癒（すなわち、腫瘍が完全に根絶される場
合）の頻度を評価した。実験の方法を下に記載する。す
べての薬剤は0.2mlの容積で静脈内投与した（ku＝キロ
ユニットを示す）。

結果を第10表に示す。ここで、ΔBWはマウスの１つの
群内における０日目の平均体重と14日目における平均体
重の比率を示し、そしてΔTWはマウスの１つの群内の０
日目における平均腫瘍体積と14日目における平均腫瘍体
積の比率である。

結論として、TNF及びこれに続くIL−２の投与が、い
ずれかの薬剤単独と比較して抗−腫瘍効果を有意に増強
し、20ku/投与のIL−２により処置された群において長
期間治癒が得られた。７日腫瘍又は11日腫瘍に対する５
及び20ku/投与のIL−２の投与量において、IL−２又はT
NF単独は効果にほとんど又は全く影響を与えなかった。

2.IL−２及びこれに続くTNF 腫瘍が皮下にあるMeth-A腫瘍モデルを用いて、７日間
（又はPBS＋IL−２の場合には11日間）にわたる腫瘍を
担持する５匹のBalb/cマウスから成る群をランダム化
し、耳に標識をし、そしてTNFにより、IL−２及びこれ
に続くPBSにより、PBS及びこれに続くTNFにより、PBS/S
DS/により、又はIL−２及びこれに続くTNFにより処置し
た。腫瘍体積、腫瘍重量、及び体重の測定は14日目に停
止した。これらの実験の方法を下に示す。すべての薬剤
は0.2mlの容量で静脈内投与した（kuはキロユニットを
示す）。

結果を第11表に示す。表中ΔBW及びΔTWは第10表に定
義した通りである。

この結果は、IL−２がTNFの前に投与された場合には
効果の増強が観察されないことを示している。いずれか
１つの理論に限定されないが、IL−２が最初に投与され
た場合に、腫瘍又は宿主のTNFに対する感受性をIL−２
が変化せしめ、このことが腫瘍をTNFに対して耐性にす
るという、TNFの殺作用の低下のヒントが存在した。

B.L1210モデル 1.TNF及びこれに続くIL−２例１に記載したL1210腫瘍モデルを用いて、３×10⁶個
のL1210細胞を０日目に移植された５匹ずつのBD2F1マウ
スから成る群を３日目にTNFとIL−２により一緒に、TNF
及びこれに続くIL−２により、PBSにより、又はIL−２
及びこれに続くTNFにより腹腔内処置した。結果を第12
表に示す。

27日目及び60日後に、この苛烈な腫瘍モデルにおいて
群２においてはなお腫瘍形成の証拠がなかった。群1,2,
4及び５の間の結果の差異は、スケジュール及び投与量
並びに投与の順序がL1210モデルにおいて良好な応答を
得るために重要であることを示している。

例5. この例においては、前記のMeth-A腫瘍モデルを使用し
て、クラスＩインターフェロンの市販の誘導剤であるポ
リI/Cと前記TNFのミューテインとの組合わせを試験し
た。

この組合せを同時に投与した場合、各薬剤単独に比べ
て相乗的抗−腫瘍効果が観察され、そして幾つかのケー
スにおいては治癒が観察された。投与順序の効果を決定
するための実験において、ポリI/C及びTNFの順序が観察
される相乗効果に影響を与えることは示されなかった。
いずれの順序も同様に良好に機能した。

これらの実験は、クローン化マウスIFN−β及びTNFを
一緒に使用して相乗効果が期待されることを示してい
る。

例6. 14日間にわたり１日１回ip投与された、及び14日間内
で種々の順序で投与されたINF及びIL−２の組合せがB16
皮下腫瘍に対して効果を示している。この実験は、“臨
床的”スケジュール（例えば週末休み）でのTNFとIL−
２の投与が同等の効果を示すか否かを決定するために設
計された。さらに、筋肉内（im）投与されたIL−２とip
投与されたTNFとの組合せ（１日１回14日間）の効果を
試験した。

この実験においては、群当り５匹ずつのBDF1雌性マウ
スに、０日目にマウス当り５×10⁶個のB16細胞を皮下注
射した。１日目に処置を開始した。特にことわらない限
りすべての注射はipで行った。腫瘍の測定は10日、14
日、21日、28日、35日及び42日目に行った。

各群のマウスを次のスケジュールに従って処置し、こ
の場合0.25mg/kgのTNF及び1mg/kgのIL−２を示された各
時点で投与した。

腫瘍体積が2000mm³より大になった時、又は60日過ぎ
ても腫瘍が存在しなかった時を終点とした。結果を第13
表に示す。

この結果によれば、この研究において使用した週末休
みを模倣するTNF/IL−２投与スケジュールはいずれもな
んらの効果も示さなかった。B16皮下腫瘍モデルにおい
ては、TNF、IL−２又は組合せの投与は、効果的である
ためには、24時間以内に行わなければならず、そして７
日間より長期間続けなければならないことを示してい
る。

TNFのip投与及びIL−２のim投与を受けたマウスはす
べて第８投与により死んだ。さらに、同容量の塩溶液を
im投与された対照動物９回の注射の後死んだ。従って、
試験群は実際の注射に耐えられず、そして死亡は被験物
質とは無関係のようである。

例7. この実験はすでに効果的である組合せを10日腫瘍負荷
に対して試験することにより一層苛烈なモデルにおける
それらの効果を決定した。

この例においては、０日目に５×10⁶個のB16細胞を皮
下注射された群当り５匹ずつのBDF1雌性マウスを使用
し、11日目に処置を開始した。すべての注射はipで行
い、そして腫瘍の測定は10日目、14日目、21日目及び28
日目に行った。

各マウス群を次の投与量及びスケジュールに従って試
験した。

腫瘍体積が2000mm³より大きくなった時又は42日過ぎ
ても腫瘍が存在しなかった時に終止とした。

結果を第14表に示す。

この結果が示すところによれば、１日腫瘍に対して効
果的であったTNF（0.25mg/kg、１−３日）、及びIL−２
（1mg/kg、４−14日）の同じ投与量及び順序スケジュー
ルは一層苛烈な10日B16皮下モデルにおいても効果的で
あった（群２）。これに代るTNF及びIL−２スケジュー
ル（群３）は効果的でなかった。

最初の３日間及び次の11日間続けて同時に１日１回投
与された同じ量のIL−２及びTNFは１日又は３日の腫瘍
を担持するマウスにおいては有効であったが10日腫瘍を
担持するマウスにおいては有効でなかった（３日後のIL
−２及びTNFの混合物は逐次投与ほど良くなかった）。
このことは、逐次投与が混合物の投与より良いことを示
唆している。

例8. A.実験計画 1.種：ラットCD系 2.処置期間:1日１回14日間 3.投与経路:I.V. 4.投与レベル:TNFのみ50μg/kg;IL−２のみ0.5又は1.0m
g/kg;TNF/IL−２の組合わせ、TNF（50μg/kg）/IL−２
（0.5mg/kg）、又はTNF（50μg/kg）/IL−２（1.0mg/k
g） 5.投与レベル当り動物数:5匹の雄及び５匹の雌 6.評価パラメーター死亡率体重及び体重変化臨床症状の観察肉眼的壊死血液状態可能な組織病理学的評価 B.結果 TNF又はIL−２単独群として比較して両TNF/IL−２組
合せ群において体重増加が少なくなった。TNF（50μg/k
g）/IL−２（1.0mg/kg）のTNF/IL−２組合せ投与の１回
の注射の後に死亡した３匹の雌性ラットを除き、他のす
べての試験ラットは１日１回の14回の投与に対して生存
した。死亡したことが見出される前に３動物の内の２動
物について“血便"/下痢”が認められ、そして３動物す
べてが死体解剖におい“流体に満たされたG.I.管”（fl
uid−filled G.I.tract）を有していた。“血便／下
痢”又は“流体に満たされたG.I.管”はラットにおける
TNF毒性の典型的な症状であるから、３動物すべてがTNF
毒性により死亡した様である。研究の14日目まで生存し
たすべての動物は研究の１及び２日目においてのみ“血
便"/下痢”のエピソードを示し、そしてこれらは死体解
剖においてIL−２毒性及びTNF毒性の徴候を有さなかっ
た。TNF（50μg/kg）/IL−２（0.5mg/kg）、又はTNF（5
0μg/kg）IL−２（1.0mg/kg）の投与レベルのTNF−/IL
−２組合せにおいて雄性ラット及び雌性ラットの両者に
白血球の数、好中球の数、リンパ球の数及び好エオシン
球の数の上昇が観察された。両TNF/IL−２組合せ投与レ
ベルについて雌性ラット及び雄ラットの両者において投
与量依存的に赤血球の数、ヘモグロンビン濃度及びヘマ
トクリット（％）の有意な低下が認められた。

C.要約この研究の結果に基づき、最大許容投与量（MTD）
は、TNFとIL−２との組合せを14日間にわたり連日ラッ
トに静脈内投与する場合、TNF（50μg/kg）:IL−２（0.
5mg/kg）であることが確立された。このMTDはTNF単独で
処置された場合のMTDに匹敵し、そしてIL−２単独で処
理された場合より幾分低かった（IL−２単独のMTDは1.0
mg/kgであった）。

TNF又はIL−２が単独で投与された場合と比べて、TNF
及びIL−２の組合せがこの試験条件下で投与される場
合、異る毒性症状は観察されなかった。この研究の結果
からは真の“観察されない効果レベル”（NOEL）は確立
されなかった。体重増加の低下、白血球の上昇、白血球
百分率、赤血球数の減少、及び関連パラメーターのため
である。

要約すれば、この発明は、抗腫瘍活性を有しそしてさ
らに哺乳類宿主において有意に増加した毒性を示さな
い、TNF及びIL−２及び／又はIFN−βの組合せを提供す
る。予想外のことには、インビトロでのヒト腫瘍モデル
において幾らかの細胞を殺すがしかしインビボにさかの
ぼるために試験されたそれらの細胞のヌードマウス異種
移植片モデルにおいてもインビボでの古典的なネズミ腫
瘍モデルにおいても細胞を殺さないTNFが、少量のIL−
２及び／又はIFN−βと組合わされた場合には、効果的
な抗癌剤であった。さらに、予想外のことには、TNF及
びIL−２のサイトカイン混合物は毒性の有意な増加を生
じさせない（IL−２とIFN−γとの組合わせはそれぞれ
単独よりも有意に毒性が高い）。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】腫瘍壊死因子（TNF）とインターロイキン
−２（IL−２）との混合物の相乗的有効量を含んで成
る、哺乳類種に非経口投与又は皮下投与するのに適する
癌の治療のための組成物。
【請求項２】TNF及びIL−２のための医薬として許容さ
れる担体をさらに含んで成る特許請求の範囲第１項に記
載の組成物。
【請求項３】TNFがヒト又はラビットのTNFであり、そし
てIL−２がヒトIL−２である特許請求の範囲第１項又は
第２項に記載の組成物。
【請求項４】TNFが最初の８個のアミノ酸が除去された
ミューテインであり、そしてIL−２がdes−ala₁−IL−2
ser₁₂₅である特許請求の範囲第３項に記載の組成物。
【請求項５】TNFの量が宿主の体重kg当り230〜260μｇ
であり、そしてIL−２の量が宿主の体重kg当り15,000〜
800,000ユニットである特許請求の範囲第４項に記載の
組成物。
【請求項６】癌が白血病、黒色腫、肥満細胞腫又はリン
パ腫である特許請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１
項に記載の組成物。