JPS62192323A - 組織型プラスミノゲン活性化因子突然変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、天然に産出するｔ−ＰＡに比較して改良され
た結合特性を有する組織型プラスミノゲン活性化因子（
ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ　　ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　
　ａｃｔｉｖａｔｏｒ’）（ｔ−ＰＡ）突然変異体に関
する。また、本発明は、遺伝子工学技術により前記突然
変異体を調製する方法およびそこで使用する組み換え遺
伝情報に関する。最後に、本発明は、また、前記突然変
異体を治療または像形成（ｉｍａｇｉｎｇ）において使
用することおよび前記目的に適する製薬学的組成物に関
する。

組織型プラスミノゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）は、酵素
前駆体プラスミノゲンをプラスミンに転　□化するセリ
ンプロテアーゼ、すなわち、フィブリンの網状組織を分
解するセリプロテアーゼである（１）、ｔ−ＰＡの活性
はフィブリンの存在下に実質的に促進され、その性質は
効力のある治療的抗血栓発生剤（ａｎｔ　ｉ−ｔｈｒｏ
ｍｂｏｇｅｎｉｃ　　ａｇｅｎｔ）としてｔ−ＰＡに注
意が集中されている（２−４）、アイプリンの刺激的影
響の分子的機構は、基質のプラスミノゲンおよび酵素の
ｔ−ＰＡの両者がフィブリンのマトリックスへ結合しか
つその上で整列し、プラスミンの局在化した発生を促進
するという概念に基づく。

ｔ−ＰＡは脈管の内皮細胞により一本鎖ポリペプチドと
して合成されかつ分泌される（５）。この分子はプラス
ミンまたはトリプシンによって二硫化結合により接続さ
れた二本鎖ポリペプチドに転化される。ｔ−ＰＡの重（
Ｈ）鎖［ｈｅａｖｙ（Ｈ）ｃｈａｔ　ｎ］　　（Ｍｒ　
　３９　０００）はアミノ末端に位置し、一方軽（Ｌ）
鎖［１ｉ　ｇｈｔ（Ｌ）ｃｈａｉ　ｎ］　　（Ｍｒ　　
３３　０００）はカルボキシ末端に位置する（６）、セ
リンプロテアーゼ、プロトロンビン、表皮成長因子およ
びフィブロネクチンのトリプシン族の両者をもつｔ−ｐ
Ａのアミノ酸配列の相同性に基づいて、ｔ−ＰＡの二次
構造のためのモデルが提案された（６．７）、このモデ
ルにおいて、異なる構造的領域が組立てられて複合体の
モザイクポリペプチドがつくられた。、ｔ−ＰＡのＬ−
鎖は、プラスミノゲン活性化因子の活性の原因となるセ
リンプロテアーゼ部分を収容することが提案された。最
近、哺乳動物の細胞において、別々に発現されたｔ−Ｐ
ＡのＬ−鎖ｃＤＮＡは事実もっばらプラスミノゲンをプ
ラスミンに転化し、そしてこの活性はフィブリンにより
促進されないことをわれわれは立証した。ｔ−ＰＡのＨ
−鎖はいくつかの血漿蛋白質とかなりのアミノ酸の相同
性を含有する。血清アルブミンのそれらに類似する典型
的な信号ペプチド（Ｓ）およびプロ配列（ｐｒｏｓｅｑ
ｕｅｎｃｅ＞　　（Ｐ）は別として（８，９）、フィブ
リンの結合に含まれるフィブロネクチン上の領域に類似
する「フィンガー（ｆ　ｉ　ｎｇｅ　ｒ）Ｊ領域ＣＦ）
（１０，１１）およびヒトおよびマウスの表皮成長因子
（Ｅ）の両者に部分的に相同する構造（１２，１３）を
区別することができる。さらに、２つの「クリングル（
ｋｒｉｎｇｌｅ）Ｊ構造を、プラスミノゲンのアイプリ
ンの結合において含まれることを示すために、プラスミ
ノダン上の構造的および機能的領域に高度に相同する、
Ｈ−鎖のカルボキシ末端部分上に配置させることが提案
された（１４）。

ｔ−ＰＡＧの染色体の構造および完全アミノ酸配列との
整列の説明は、興味ある観察、すなわち、エクソンまた
はエクソンの組が提案した構造的領域と一致することを
明らかにした（６．１５．１６）、それらの研究および
他の研究は、モザイク蛋白質、例えば、ｔ−ＰＡおよび
他の血漿蛋白質が「エクソンのシャラフリング（ｓｈｕ
ｆｆｌｉｎｇ）Ｊ、進化の転移の事象の結果として異な
る機能的［モジュール（ｍｏｊｕｌｅ）Ｊから構成され
るという仮説に導いた。

ここで、別のエクソンまたはエクソンの組により暗号化
（ｅｎｃｏｄｅ）される、ｔ−ＰＡ蛋白質中の構造的領
域は自律的機能を収容するという証拠をわれわれは提供
する。

材料および方法 材料 制限エンドヌクレアーゼ、Ｔ４　　ＤＮＡ　　１１ガー
ゼ、Ｔ４　　ＤＮＡ　　ポリメラーゼ、Ｔ４　ポリヌク
レオチドキナーゼおよびエシェリヒア争コリ　　（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　　　ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラ
ーゼエ　［フレナラ（Ｋｌｅｎｏｗ）］をニュー・イン
グランド・バイオラプス（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　　Ｂ
ｉ　ｏ　ｌ　ａｂｓ）から購入した。ヤエナリ（Ｍｕｎ
ｇ　　Ｂｅａｎ）ヌクレアーゼをＰ　、　Ｌ　、　／＜
イオケミカルス・インコーホレーテッド（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓ　　Ｉｎｃｉから、ツニカマイシン（Ｔｕ
ｎｉｃａｍｙｃｉｎ）をカルビオサム（Ｃａ　ｌ　ｂ　
ｉ　ｏ　ｃｈｅｍ）から、イスコウブの変性培地（Ｉｓ
ｃｏｖｅ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄ　　ｍｅｄｉｕｍ）をフ
ロー・うポラトリーズ（Ｆｌｏｗ　　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ）から、そしてプラスミノゲン活性化因子のア
ッセイに必要なすべての試薬をカビ・ヒトラム（Ｋａｂ
ｉ　　Ｖｉｔｒｕｍ）からそれぞれ入手した。

一般的方法 プラスミドＤＮＡをアルカリーー溶解手順（１９）の修
正法および引続（ＣｓＣ１−平衡遠心により単離した。

酵素反応は標準条件を使用して実施した（２０）。ヌク
レオチド配列の決定はマクサム（Ｍａｘａｍ）およびギ
ルバート（Ｇｉｌｂｅ　ｒ　ｔ）　　（２１）の方法を
使用して実施した。

発現プラスミドの構成 プラスミドｐｔＰＡ８ＦＬはベクターｐＢＲ３２２およ
びこのベクターのＰｓｔＩ部位中にＧ−Ｃティリングに
より挿入された全長のｔ−ＰＡｃＤＮＡ　（２，５４０
ｂ　ｐ）から成る。ヒトｔ−ＰＡ　　ｃＤＮＡはポウウ
ェス・メラノマ（Ｂｏｗｅｓ　　Ｍｅｌａｎｏｍａ）の
ポリＡ＋ＲＮＡを使用して構成した。全長のｔ−ＰＡ　
　ｃＤＮＡの断片（２，０８７ｂｐ）は、ｂｐ７８から
２．１６５　［ｔ−ＰＡ　　ｃＤＮＡの番号はペン二カ
（ｒｅｎｎｉｃａ）（６）らに従う〕に伸びかつ全体の
解読配列を含有し、そしてこれをｐＵＣ９ポリリンカー
のＨｉｎｃＩＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間でサブクロ
ーニングして、プラスミドｐＵｃｔＰＡを得た。　ｐＵ
Ｃｔ　ＰＡｃｙ）Ｈｉ　ｎ　ｄＩＩＩ−３ａ　ｃ　Ｉ断
片をｐｔＰＡ８ＦＬｃ７）ＳａｃＩ−ＢｇｌＩＩ断片と
一緒にＰＳＶ２　（２２）ｃ））ＨａｅｍおよびＢｇｌ
■部位の間に挿入したｐｓＶ２ｔＰＡを生成した。この
プラスミドは複製の起源およびＰＢＲ３２２のβ−ラク
タマーゼ遺伝子、ＳＶ４０の早い（ｅ　ａ　ｒ　ｙ）プ
ロモーター、ｔ−ＰＡ−解読配列およびＳＶ４０スプラ
イス（３ｐｌｉｃｅ）およびポリアデニル化配列を含有
する。すべての少なくとも欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）−
突然変異体発現プラスミドは、ｐｓＶ２ｔＰＡから、仮
定の領域に隣接する制限部位を使用して解読配列中に欠
失を構成することによって誘導した。翻訳リーディング
フレームを保存するために、構成のあるものにおいて、
制限断片の末端をＤＮＡ修飾酵素を使用して変更した（
第１図への凡例に詳述されている）。ＤＮＡ−配列の決
定を実施して、各構成におけるすべての新しいｃＤＮＡ
接合（ｊ　ｕｎｃｔｉｏｎｓ）の正しいイン−フェイズ
結合（ｉｎ−ｐｈａｓｅ　　ｌｉｇａｔｉｏｎ）を明ら
かにした。プラスミドｐＳＶ２／１−ＰＡを含有するＥ
、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２ＤＨ１を、オランダ国バアアルン
（Ｂａａｒｎ）所在のザφセントラアアルビューロウ・
ブーア・シンンメルカルチュアーズ（ｔｈｅ　　Ｃｅｎ
ｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　　ｖ。

ｏｒ　　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｕｃｕｌｔｕｒｅｓ）（ＣＢ
Ｓ）に、１９８６年２月６日に受託した。

組織の培養およびトランスフェクションマウスＬｔＫ−
細胞を、ペニシリン、ストレプトマイシンおよび１０％
のウシ胎児血清を含有するイスコウブの変性最小培地中
で維持した。トランスフェクションは木質的に記載され
ているようにして実施した（２３）。トランスフェクシ
ョン後、細胞を、ペニシリン、ストレプトマイシンおよ
び０　、３　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌの酸処理したウシ胎児
血清アルブミンを含有する血清不合イスコウブの培地中
でインキュベーションした。実験のあるものにおいて、
ツニカマイシン（ＩＩＬｇ／ｍｌ）を添加した。トラン
スフェクション後５日に、細胞の培地は正規には８Ｘ１
０６の細胞につき１〜５ＪＬｇのｒｔ−ＰＡまたはｒｔ
−ＰＡ突然変異体の蛋白質を含有した。

ゼラチンープラスミノゲンのゲル電気泳動１３ｕ、ｇ／
ｍｌの共重合したプラスミノゲンを含有するゼラチンゲ
ルの電気泳動を木質的に記載されるようにして実施した
（２４）、０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを含有す
る１０％のポリアクリルアミドのゲルを、２．５％のト
リトン（Ｔｒ　ｉ　ｔ　ｏ　ｎ）　−Ｘ中で２時間電気
泳動してドデシル硫酸を除去した後、インキュベーショ
ンした。引続いて、ゲルを０．１モルのグリシン−Ｎａ
ＯＨ（ｐＨ８，３）中で６時間インキュベーションした
。ゲル中のプラスミノゲンの活性化によるフェラチンの
分解は、０．１％のアミドブラックを使用するコンドラ
ステイニング（ｃｏｎｔｒａｓｔａｉｎｉｎｇ）により
可視化した。

プラスミノゲン活性化因子のアッセイ プラスミノゲン活性化因子の活性は間接の分光光度アッ
セイを使用して実施した（２７）。このアッセイはプラ
スミノゲン活性化因子を触媒とするプラスミノゲンの転
化により発生するプラスミンのアミド分解活性を測定し
、そして発色性基質Ｄ−ｖａｌ−１ｅｕ−１ｙｓ　ｐＮ
ｉｔｒｏアニリド（５２２５１）中の結合の加水分解に
基づく、アッセイは０．１３ＩＬモルのプラスミノゲン
、０．１％のライ−ｙ（Ｔｗｅｅｎ）−８０，１２０Ｉ
Ｌｇ／ｍｌのＣＮＢｒ−消化７４ブリノゲン（示すとＳ
）および０．３０ミリモルの３２２５１を含有する、２
５０ＩＬ１の０．１モルのトリスＨＣＩ　（ｐＨ７，５
）中で３７℃において実施した＊４０５ｎｍにおける吸
収を６時間追跡した。

ｔ−ＰＡ　　Ｌ−鎖抗体についての免疫放射線アッセイ セファロース（Ｓ　ｅ　ｐ　ｈ　ａ　ｒ　ｏ　ｓ　ｅ）
のビーズへ結合したヤギー抗マウスＩｇＧを、制限量の
ネズミのモノクローナル抗ヒ）ｔ−ＰＡ　　Ｌ−鎖！ｇ
Ｇ　（ＥＳＰ２）（２５）および鵞２ＳＩ−放射線標識
されたｔ−ＰＡ）レーサーとともに、１％のウシ血清ア
ルブミン、０．１％のツイーン−８０および１０５９モ
ルのＥＤＴＡを含有するリン酸塩緩衝化生理的食塩水中
でインキュベージ、ンした。インキュベーションはエン
ド・オーバー・ｘンド（ｅｎｄ　　ｏｖｅｒ　　ｅｎｄ
）で１８時間室温において栓をしたポリスチレン管中で
実施した。結合した放射線標識トレーサーおよび遊離の
放射線標識トレーサーを３０００Ｘｇにおける２分間の
遠心により分離した。セファローズのビーズを２ｍ１７
）０．９モルのＮａＣ１，０，１％のツイーン、１０５
９モルのＥＤＴＡで４回洗浄し、そして結合した放射能
をガンマ−カウンターで決足した。標識しないボウウェ
ス・メラノマ（Ｂｏｗｅｓ　　Ｍｅ　ｌ　ａｎｏｍａ）
ｔ−ＰＡを１２５Ｉ−ｔ−ＰＡの結合の競争相手として
使用した＊　Ｏ−５ｍ　ｌの最終体積中のほぼ１１００
ｎのｔ−ＰＡは、トレーサーの結合を最大値の５０％ま
で減少させた。ｒｔ−ＰＡまたはｒｔ−ＰＡ突然変異体
の蛋白質を含有する培地を、また、モノクローナルＥＳ
Ｐ２　　ＩｇＧへの結合のために放射線標識したｔ−Ｐ
Ａのための競争相手として使用した。コンディジ、コン
デした培地およびボウウェス・メラノマ（Ｂｏｗｅｇ　
　Ｍｅｌａｎ。

ｍａ）ｔ−ＰＡの系統的希釈の競争の百分率を比咬する
と、存在するＬ−鎖抗原の量を推定することができる。

結果 ｔ−ＰＡ欠失−突然変異体発現プラスミドの横ｔ−ＰＡ
の別々の仮定の生物学的性質を研究するため、Ｈ−鎖上
に１または２以上の領域の解読配列を系統的に欠くｌ系
列のｔ−ＰＡ　　ｃＤＮＡ発現プラスミドをわれわれは
構成した。その目的に、９５−ｂｐの５°−非翻訳区域
、１，８８６−ｂｐの解読領域および７５９−ｂｐの３
゛−非翻訳領域から構成された、われわれのクローニン
グした全長のｔ−ＰＡ　　ｃＤＮＡを使用した。制限酵
素の分析および部分的ヌクレオチド配列の快足は、ペン
二カ（Ｐｅｎｎｆｃａ）らが報告したＤＮＡ配列（６）
との同一性を立証した。全長のｔ−ＰＡ　　ｃＤＮＡの
区画を、プラスミドＰＢＲ３２２および真核生物のウィ
ルスＳＶ４０の部分から成る［シャツトルベクター（ｓ
ｈｕｔｔｌｅｖｅｃｔｏｒ）Ｊ　　（ｐＳＶ２）の中に
挿入した。これらの構成において、ｔ−ＰＡ　　ｃＤＮ
ＡはＳＶ４０の早いプロモーターにより先行され、そし
てその３′末端においてスプライスおよびボリアデニル
化の信号に結合している。すべての構造は共通の２つの
面をもつ。第１に、それらはｔ−ＰＡ信号ペプチドのた
めの解読配列（８５から少なくとも１５６までのヌクレ
オチド）を収容して（突然変異体の）ポリペプチドの分
泌を保証する。第２に、すべての構造はｔ−ＰＡ　　Ｌ
−鎖の全体の解読領域（ヌクレオチド９５３から１，７
７１まで）を含有する。後者の領域はプラスミノゲン活
性化因子の活性の原因となり、これにより生物学的活性
の便利なアッセイを可能とする。さらに、フィブリンに
よるｔ−ＰＡのプラスミノゲン活性化因子の活性の刺激
へのＨ−鎖の異なる領域への包含は、容易にアッセイす
ることができる。構造の木質的接合を翻訳リーディング
フレームの連続性を立証するためにシーフェンシングし
た（ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ）　、　Ｈ−鎖　ｔ−ＰＡｃＤ
ＮＡ−欠失突然変異体の概略的表示は第１図に示されて
いる。

発現産生物の特性づけ マウスＬｔｋ−細胞は効率よくトランスフェクシゴンさ
れ、そして１または２以上のプラスミノゲン活性化因子
を含有せずあるいは分泌しないので、ｔ−ＰＡ　　ｃＤ
ＮＡ収容プラスミドによりプログラミングされた、ｒｔ
−ＰＡの一時的発現に適当な宿主であるように思われた
。血清不合培地中にトランスフェクション後に存在する
、異なるの発現産生物を、ゼラチンープラスミノゲンの
ゲル電気泳動により分析した。この技術は５ＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル中においてプラスミノゲン活性化因
子の活性を局在化した。この方法は、流延の時にポリア
クリルアミドマトリックスの中に組込まれたとき、プラ
スミノゲンおよびゼラチンが電気泳動の間に保持される
という原理に依存する。正常位置の（ｉｎ−ｓｉｔｕ）
プラスミンの形成および結局のゼラチンの分解は、ネガ
ティブの着色（ｎｅｇａｔｉｖｅ　　Ｓｔａｆｎｆｎｇ
）により可視化することができる。明らかなように、メ
ラノ−Ｆ　（Ｍｅ　ｌ　ａｎｏｍａ）ｔ−ＰＡおよびｒ
ｔ−ＰＡは、このゲル系において同様な移動性を表わす
。ｒｔ−ＰＡ−欠失の突然変異体は、また、明らかに信
号ペプチドにより方向ずけられたルーチング（ｒｏｕｔ
ｉｎｇ）のために分泌された。欠失−突然変異体の蛋白
質の移動性は期待される値に相当する。明らかなように
、すべての突然変異体の蛋白質は、Ｌ−鎖がこの活性の
ために十分であるというわれわれの前の観測に従い、基
本のプラスミノゲン活性化因子の活性を示す、産生物の
異質性が差別的なグリコジル化から生ずることを立証す
るために、Ｎ−グリコジル化の阻害剤であるツニカマイ
シンを産生物の発現の間に細胞培地へ添加した。結果（
示さない）は、これらの条件下に、すべての蛋白質がゼ
ラチンゲル上で単一の帯を表示することであった。この
事実により、それらは独特のポリペプチドとして発現さ
れることを示す。われわれのデータおよび他のデータ（
２６）は、ｔ−ＰＡの炭水化物の部分がその生物学的活
性に含まれないことを示す。発現産生物はｔ−ＰＡ分子
のまだ仮定的な領域の生物学的性質を研究するときの価
値ある道具であると、われわれは考える。

突然変異体の蛋白質のプラスミノゲン活性化、フィブリ
ノゲン断片の影響 欠失−突然変異体の蛋白質のプラスミノゲン活性化因子
の活性へのフィブリンの作用を研究するために、発色性
基質５２２５１に頼る、アミド分解アッセイ（ａｍｉｄ
ｏｌｙｔｉｃ　　ａ　ｓ　ｓ　ａｙ）をわれわれは使用
した。フィブリンの増強作用をまねることが知られてい
る消化物である、臭化シアン−消化フィブリノゲンの存
在下および不存在下にｒｔ−ＰＡおよびｒｔ−ＰＡ突然
変異体の蛋白質の活性をわれわれは決定した（２７）。

データを第２図に記載する。フィブリノゲン断片の不存
在下に、ｒｔ−ＰＡのみは基本的活性を有するが、フィ
ブリノゲン断片を添加すると、プラスミノゲン活性化因
子の活性は大きく促進される。突然変異体の蛋白質のし
およびＬＫＩは基本的活性のみを表示し、そしてフィブ
リノゲン断片によるプラスミノゲン活性化因子の活性の
有意の刺激は検出されなかった。これと対照的に、突然
変異体の蛋白質ＬＥＫ　１−２、ＬＫ　１−２およびＬ
Ｋ２はｒｔ−ＰＡと同一の大きさでフィブリノゲン断片
により刺激された。突然変異体の蛋白質ＬＦＥおよびＬ
Ｆ（示さず）のプラスミノゲン活性化因子の活性は、ま
た、フィブリノゲン断片により刺激されたが、その程度
はに２領域含有突然変異体の蛋白質よりも小さかった。

これらの結果が示すように、ｔ−ＰＡ　　Ｈ−鎖のに２
領域は、そして、小さい程度に、フィンガー（Ｆ）領域
は、フィブリンの刺激作用を仲介する。最後に、「クリ
ングル（ｋｒｉｎｇｌｅ）ＪＫＩおよびＥＧＦ領域は明
らかに刺激機構（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ　　ｍｅｃｈ
ｎｉ　ｓｍ）に寄与しない。フィブリンにより刺激のた
めの分子基準はフィブリンポリマーにより拘束され、こ
れによりｔ−ＰＡをその基質と整列させると推測される
（２．２８）、したがって、われわれはｔ−ＰＡ欠失−
突然変異体蛋白質のフィブリン結合性質を検査した。

フィブリンの結合 フィブリンマトリックスをｒｔ−ＰＡまたはｒｔ−ＰＡ
欠失−突然変異体の蛋白質の存在下に形成し、引続いて
沈殿させた（２９）、上澄み液および沈殿の可溶化物の
プラスミノゲン活性化因子の活性をゼラチンープラスミ
ノゲンゲル上で分析した（示さず）、ｒｔ−ＰＡおよび
Ｌの場合において、使用した合計量（入力）、非結合分
画および結合分画を研究した。ｒｔ−ＰＡ−人力分画の
大部分はフィブリンマトリックスに結合し、これに対し
てＬ−鎖の蛋白質の有意の結合は検出されなかった。他
の蛋白質へ結合した入力および分画をまた研究した。Ｌ
Ｋｌはフィブリンへの有意の結合を示さなかった。突然
変異体ＬＥＫＩ−２、ＬＫＩ−２およびＬＫ２を含有す
るに２−領域はほぼ同一程度にフィブリンに結合したが
、ｒｔ−ＰＡの結合はど効率的でなかった。ＬＦＥおよ
びＬＦ突然変異体もフィブリンへ結合したが、その程度
は突然変異体蛋白質を含有するに２−領域よりも劣った
。それゆえ、クリングルに２によりおよびより低い程度
にＦ領域により仲介される、プラスミノゲン活性化因子
の活性へのフィブリノゲン断片の刺激作用は、これらの
領域のフィブリン結合特性と良好な相関関係をもつ、明
らかなように、ｔ−ＰＡのプラスミノゲン活性化因子の
活性の加速は究極的にはフィブリンマトリックスへの結
合に関連する。

考察 ニイ（Ｎ　ｙ）ら（１５）によるｔ−ＰＡ遺伝子の構造
の説明は、別のエクソンまたは別のエクソンの組が、他
の血漿蛋白質との相同性を基準にして仮定された、構造
的領域を暗号化することを明らかにした。これらの自律
的構造的領域が事実自律的機能を有するかどうかを試験
するために、われわれは１または２以上の構造的領域を
欠く１系列のｒｔ−ＰＡ欠失−突然変異体の蛋白質を発
現（ｅｘｐｒｅｓｓ）Ｌ、そして残りの生物学的性質を
研究した。この研究所からの早期の研究は、別々に発現
されたＬ−鎖の分子がプラスミノゲン活性化因子の活性
を収容するが、この活性はフィブリンにより刺激されえ
ないことを示した。それらの研究において、Ｌ−鎖の分
子は、Ｌ−鎖のＣＤＮＡの発現に使用されなかった組織
培養細胞により分泌されなかった。この論文において、
われわれは、信号ペプチドが異なる欠失突然変異体のｃ
ＤＮＡ（７）５’末端において暗号化（ｅｎｃｏｄｅ）
される場合、発現産生物の効率よい分泌が起こることを
示ことができた。この結果は、ｔ−ｐＡ信号ペプチドが
自律的機能を有することを示す。

フィンガー（ｆ　ｉ　ｎｇｅ　ｒ）ＣＦ）領域はフィブ
リン結合機能を示し、そしてまた、ｔ−ＰＡのプラスミ
ノゲン活性化因子の活性への「フィブリン」の刺激作用
を一部分仲介する。

明らかなように、Ｋ２領域はフィブリンの結合において
ならびにｔ−ＰＡのプラスミノゲン活性化因子の活性へ
のフィブリンによる仲介する刺激において自律的機能を
有する。驚くべきことには、クリングル（ｋｒ　ｉ　ｎ
ｇ　１　ｅ）Ｋｌ領域はｔ−ＰＡのフィブリン結合性質
に含まれるように思われない。クリングルＫｌおよびに
２のアミノ酸配列は高度に相同性であり、そして二次構
造は類似する（６．７）ようであるが、明らかに微妙な
差はフィブリンの親和性を特定することができる。この
ような差は、この分子上のクリングル構造の存在にかか
わらず、ウロキナーゼ（ｕ−ＰＡ）のフィブリン親和性
の欠如を説明できるであろう。

ｔ−ＰＡのフィブリン結合特性がフィンガー領域（Ｆ）
およびに２領域の両者により仲介（ｍｅｄｉｔａｔｅ）
され、後者は大部分結合に寄与することをわれわれは提
案する。フィブリン結合へのクリングルに２領域の包含
についての追加の証拠は、ネズミのモノクローナル抗ヒ
トｔ−ＰＡ抗体（ＥＳＰ５）（２５）、これはｔ−ＰＡ
のフィブリン結合を一部阻止することがわかった、がＬ
Ｋ２へ特異的に結合するが、Ｌ−頻度生物へ結合しない
という観察（結果は示されていない）によす得られた。

このコンフォメーション（ｃｏｍｆｏｒｍａｔｉｏｎ）
依存性のモノクローナル抗体はｔ−ＰＡとならびにに２
領域含有突然変異体蛋白質と等しく良好に反応したとい
う事実は、Ｋ２領域が欠失−突然変異体蛋白質中におい
てその自然コンフォメーションを保持することを示す。

モザイク（ｍｏｓａｉｃ）蛋白！（例えば、ｔ−ＰＡ）
は［エクソンのシャラフリング（ｅｘ。

ｎ　　ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）Ｊ、すなわち、異なる機能
的構造を結合する進化的過程（ｅｖｏｌｕｔｉ　ｏｎａ
ｒｙ　　ｐｒｏｃｅｓｓ）、により発生することが提案
された。別々のエクソンまたはエクソンの組により暗号
化される、ｔ−ＰＡ中の構造的領域が自律的領域である
ことを示すことによす、われわれの研究は機構として新
しい遺伝子をつくるというエクソンのシャラフリングの
概念を支持する。われわれの見解において、これらおよ
び他の欠失突然変異体とのｔ−ＰＡ分子の構造−機能の
関係を研究するためにここで探索するアプローチは、ど
の領域が、垂液流からのｔ−ＰＡの急速な除去（ｃｌｅ
ａｒａｎｃｅ）の原因となる、プラスミノゲン活性化因
子阻害剤とのｔ−ＰＡの複合体（ｃ　ｏｍ、ｐ　ｌ　ｅ
　ｘ）の形成（３０，３１）におよび肝臓中の１または
２以上の受容体へのｔ−ＰＡの結合（３２，３３）に含
まれるかを説明できる。

要約すると、われわれは、５Ｖ４０−ｐＢＲ３２２−誘
導ｔ−ＰＡ　　ｃＤＮＡプラスミドにより暗号化される
１組み換えヒト組織型プラスミノゲン活性化因子（ｒｔ
−ＰＡ）またはｒｔ−ＰＡ欠失−突然変異体の蛋白質の
一時的な発現のためにトランスフェクションしたマウス
Ｌｔｋ−＋１８１１胞を使用した。ｔ−ＰＡ　　ｃＤＮ
Ａ−欠失突然変異体は、共通の２つの面、すなわち、信
号ペプチドをプログラミングするｃＤＮＡおよびＬ−鎖
のための解読区域を有する。結局、ｒｔ−ＰＡ突然変異
体蛋白質は効率的に分泌され、そしてプラスミノゲン活
性化因子の活性を表示する。Ｎ−末端のＨ−鎖は、他の
血漿蛋白質（「フィンガー」、「表皮成長因子」、「ク
リングル」）に相同する構造的領域の列であり、制限エ
ンドヌクレアーゼを使用して突然変異させてｌまたは２
以上の構造的領域を欠失させた。ｔ−ＰＡのプラスミノ
ゲン活性化因子の活性へのフィブリノゲン断片の刺激作
用は、クリングル領域によりおよび少ない程度にフィン
ガー領域により仲介されるが、クリングルに１およびＥ
ＧＦ領域により仲介されないことが立証された。これら
のデータはｒｔ−ＰＡ欠失−突然変異体蛋白質のフィブ
リン結合性質と良好に相関関係をもち、フィブリノゲン
断片による活性の刺激がフィブリンマトリックス上の基
質プラスミノゲンおよびｔ−ＰＡの整列に基づくことを
示す。われらの結果は、また、蛋白質の自律的機能を構
成する構造的領域を配置する、「エクソンのシャラフリ
ング」の進化的概念を支持する。

前述のわれわれの研究は、天然に産出する１−ＰＡの形
態に比較して、および多分ｌまたは２以上のプラスミノ
ゲン活性化因子阻害剤との複合体の形成および／または
肝臓中の１または２以上の受容体への結合においてより
望ましい性質を有するｔ−ＰＡ突然変異体に比較して、
フィブリンに向う改良された結合特性を有するｔ−ＰＡ
突然変異体を理解しかつその設計および実際の生産に必
要な道具（ｔ　ｏ　ｏ　１　ｓ）を提供する。

われわれの研究の直接の結果は、フィブリンに向う改良
された結合特性を有するｔ−ＰＡ突然変異体からなり、
フィブリンの血餅阻止血液循環の状態、例えば、静脈の
血栓症、動脈の血栓症、真菌拘束および肺のまくれこみ
（ｌｕｎｇ　　ｅｍｂｏｌｙ）の治療において有益であ
りうる製薬学的組成物の開発である。もちろん、治療の
目的に使用するｔ−ＰＡ突然変異体は、少なくとも、プ
ラスミノゲン活性化因子の活性を収容するＬ−鎖からな
らなくてはならない、この要件は、フィブリンに向う改
良された特性を有する新規なｔ−ＰＡ突然変異体の使用
の第２種類、すなわち、フィブリンの血餅、例えば、血
栓の像形成（ｉ　ｍ　ａ　ｇ　ｉｎｇ）において存在し
ない、しかしながら、突然変異体は検出可能な標識、例
えば、放射性同位元素を含むべきである。

ｔ−ＰＡを含有する製薬学的組成物は既知であり（４）
、したがってここにおいて特許請求するｔ−ＰＡ突然変
異体を含有する製薬学的組成物の配合において問題は存
在しないであろう。

異なる投与の道筋を用いることができるが、通常静脈内
、動脈内または冠状動脈内の投与は最も急速な結果を得
るために好ましいであろう、これらの投与の道筋につい
て、製薬学的組成物は、通常、ｔ−ＰＡ突然変異体の水
溶液からなり、必要に応じて、慣用の添加剤、例えば、
ｔ−ＰＡ自体を含有する水溶液についてよく知られてい
るような、ｔ−ＰＡ突然変異体の溶解を促進する添加剤
をさらに含有する。

図面に対する凡例 叢↓量　ｒｔ−ＰＡおよびｒｔ−ＰＡ欠失突然変異体発
現ベクター中に存在するｔ　−ＰＡ　　ｃＤＮＡの略図
、ｒｔ−ＰＡは全体の解読ｃＤＮＡにより遺伝情報を指
定される。欠失突然変異体ｃＤＮＡは、ある場合酵素的
に修飾して翻訳リーディングフレームを保存するように
したｔ−ＰＡ制限断片の末端を融合することによって構
成した。Ｌ［塩基対１５８から９５３（含まず）までの
欠失（Δ１５８９−９５３）］をＥｃｏＲＩＩ　（１５
３）末端［Ｅ、ｃｏｌｌｉ　　ＤＮＡポリメラーゼ−Ｉ
の大きい断片［フレナラ（Ｋｌｅｎｏｗ）］により充填
された］を５ｃａＩ　（９５０）−末端に融合すること
によって構成した。ＬＫ２　（Δ１５Ｂ−７１１）；Ｂ
ｓｔＮＩ　（１５３）−末端［フレナラ（Ｋｌｅｎｏｗ
）］をＤｄｅＩ（７１０）−末端［フレナラ（Ｋｌｅｎ
ｏｗ）］に融合する。ＬＫＩ−２（Δ１５８−４５８）
；Ｅｃ。

ＲＩＩ（１５３）−末端［フレナラ（Ｋｌｅｎ。

ｗ）　］をＨａｅｍ　（４５６）−末端に融合する。

ＬＫＩ（Δ１５８−４５８／Δ７１３−９５３）：１つ
の余分の欠失をもつＬＫＩ−２と同様にＤｄｅＩ（７１
０）−末端［フレナラ（Ｋｌｅｎ。

ｗ）（ＴＴＰ、ｄＧＴＰ）により、次いでヤエナリヌク
レアーゼ処理により部分的に充填される］をＳ　ｃ　ａ
　Ｉ　（９５０）−末端に融合することによってつくら
れた。ＬＥＫＩ−２（Δ１５８−３２６）；ＥｃｏＲＩ
Ｉ　（１５３）−末端［フレナラ（Ｋｌｅｎｏｗ）］を
ＤｒａＩＩＩ（３１９）−末端（Ｔ４−ＤＮＡポリメラ
ーゼに融合し、ｄＡＴＰのみを付加し、次いでヤエナリ
ヌクレアーゼ処置をする。ＬＦＥ　（Δ４５５−９５３
）；ＢｓｔＮＩ　　（４５２）−末端［フレナラ（Ｋｌ
ｅｎ。

Ｗ）　］を５ｃａＩ　（９５０）−末端に融合する。

ＬＦ（Δ３３２−９５３）は？工程で構成した。

ａ）ＬＫＩ−２をＮａｒＩ　（５１７）およびＳｃａ　
Ｉ　（９５０）で消化し、そしてフレナラ（Ｋｌｅｎｏ
ｗ）で処理した。ＢｂｖＩ断片（２５２−３４１）をｐ
ＳＶ２／１−ＰＡ　　ＤＮＡから単離し、ＢｂｖＩで消
化した。この断片をＴ４−ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＡＴ
Ｐ、ｄｃＴＰ、ＴＴＰとともに、次いでヤエナリヌクレ
アーゼとともにインキュベーションした。この修飾した
断片を、前述のようにして調製したＬＫＩ−２の中に挿
入した。ｂ）生ずるプラ血清をＤｒａｍで消化した（３
１９および１３６５において；　３３２−９５３を欠失
する）。前記欠失を含有するＤｒａＩＩＩをｐＳＶ２／
１−ＰＡ（７）ｒ無傷の（ｉｎｔａｃｔ）４Ｄｒａｍ断
片（３１９−１３６５）と置換してＬＦを生成した。

ＤＮＡシークエンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）はＴ
４−ＤＮＡポリメラーゼまたはヤエナリヌクレアーゼが
ＢｂｖＩ末端において「ニブルした（ｎｉｂｂｌｅｄ）
Ｊしたことを示した。Ｓ、信号ペプチド二Ｐ、プロペプ
チド；Ｆ、フィンガー領域；Ｅ、ＥＧＦ領域；Ｋｌおよ
びに２、クリングル領域、およびＬ、軽鎖。

！エヌ　　発色性基質５２２５１を使用して決定したプ
ラスミノゲン活性化へのｒｔ−ＰＡ、ｕ−ＰＡ、Ｌ、Ｌ
ＫＩ、ＬＫ２．ＬＥＫＩ−２およびＬＦＥ蛋白質による
「フィブリン」　（フィブリノゲン断片）の影響（２７
）。約０．１５ピコモル（免疫放射線測定アッセイによ
り決定して）の異なる発現生産物を含有する２ｍＵのｕ
−ＰＡまたは２０ＩＬｌの領域不合培地を使用した。４
０５ｎｍにおける吸収を少なくとも４時間追跡し、そし
てＬｔｋ−細胞の血清不合媒質をコンディショニングし
、それをプロモーター不含ｐ　ｔ　ＰＡ８ＦＬＤＮＡで
転写し、そして対照として使用した。

○、＋フィブリノゲン断片：Δ、−フィブリノゲン。

参考文献 １、：ＩＬ／７　（Ｃｏ　ｌ　ｌ　ｅｎ）　、　Ｄ、　
（１９８Ｏ）血栓症および１Ｆ血（Ｔｈｏｒｏｍｂｓ、
Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、）、４３．７７−８９゜２、ワレ
ｙ　（Ｗａｌ　ｌ　ｅｎ）、Ｐ、（１９７７）血栓症お
よびウロキナーゼ（Ｔｈｏｒｏｍｂｓｉｓ　　ａｎｄ　
　Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ）、パオレー２チ（Ｐａｏｌｅｔ
ｔｉ）、Ｒ，およびシェリー（Ｓｈｅ　ｒ　ｒｙ）　、
　Ｓ　−１７１［アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ　　Ｐ　ｒ　ｅ　ｓ　ｓ）　　、ニューヨーク１．
９１−１０２ページ。

３、ホイアエルツ（Ｈｏｙａｅｒｔｓ）、Ｍｏ、リジタ
ノ（Ｒｉ　ｊｋｅｎ）、Ｄ、Ｃ，、リジネン（Ｌｉｊｎ
ｅｎ）、Ｈ−Ｒ，およびコレン（Ｃｏｌｌｅｎ）、Ｄ、
（１９８２）ジャーナル・オブ・バイオロジカル拳ケミ
ストリー（Ｊ、Ｂｉ　ｏ　１　、Ｃｈｅｍ、）２５７．
１９１２−２９１９゜ ４、ゲラデル（Ｇｏｅｄｄｅ　１）、Ｄ、Ｖ−、コール
（Ｋｈｏｒ）、Ｗ、Ｊ、ペン二カ（Ｐｅｎｎｎｉｃａ）
およびベハール（Ｖｅｈａｒ）、Ｇ、Ａ、（１９８３）
、欧州特許（ＥＰ−Ａ）００９３６１９゜ ５、リジケン（Ｒｉ　ｊｋｅｎ）、Ｄ、Ｃ，ウィジンガ
アルズ（Ｗｉ　ｊ　ｉ　ｎｇａａｒｄｓ）、Ｇ。

およびつｚ７Ｌ／ベルゲン（Ｗｅ　ｌ　ｂｅ　ｒｇｅｎ
）。

Ｊ、（１９８０）血栓症の研究（Ｔｈｒｏｎｂ。

Ｒｅｓ、）１８．８１５−８３０゜ ６、ペン二カ（Ｐｅｎｎｉｃａ）、Ｄ、、ホルメス（Ｈ
ｏ　１ｍｅｓ）、Ｗ、Ｅ、、コール（Ｋ。

ｈｒ）、Ｗ、Ｊ、、ハーキンス（Ｈａｒｋｉｎｓ）、Ｒ
，Ｎ、ベハール（Ｖｅｈａｒ）、Ｇ。

Ａ、１ワード（Ｗａｒｄ）、Ｃ，Ａ、、ベンネッ）　（
Ｂｅｎｎｅｔ）、Ｗ、Ｆ、、エルペルトン（Ｙｅ　１ｖ
ｅｒｔ　ｏｎ）、Ｅ−、シーバルブ（Ｓｅｅｂｕｒｇ）
、Ｐ、Ｈ，、ヘイネツカー（Ｈｅｙｎ６ｋｅｒ）、Ｈ，
Ｌ、およびゲラデル（Ｇ。

ｅｄｄｅｌ）、Ｄ、Ｖ、（１９８３）ネイチャー（Ｎａ
ｔｕｒｅ）３０↓、２１４−２２１゜７、バンヤイ（Ｂ
Ａｎｙａｉ）、Ｌ、、バラディ（Ｖ＆ｒａｄｉ）、Ａ、
およびパラティ（Ｐａｔｔｙ）、Ｌ、（１９８３）ＦＥ
ＢＳ　　レターズ（Ｌｅｔｔ、）１６３．３７−４１゜
８、パターソン（Ｐａｔｔｅｒｓｏ、ｎ）、Ｊ。

Ｅ、およびゲラ−（Ｇｅｌｌｅｒ）、Ｄ、Ｍ。

（１９７７）Ｂｉ　ｏｃｈｅｍ、Ｂｉ　ｏｐｈｙｓ　。

Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、７４．１２２０−１２２６゜９、ロ
ウｙ　（Ｌａｗｎ）、Ｒ，Ｍ、、アデルマン（Ａｄｅ　
１ｍａｎ）、Ｊ　、ポック（Ｂ　ｏ　ｃ　ｋ）、Ｓ、Ｃ
，、フラツグ（Ｆｒａｎｋｅ）、Ａ。

Ｅｌ、ホウク（Ｈｏｕｋ）、Ｃ，Ｍ、、ナジャリアｙ（
Ｎａｊａｒｉａｎ）、Ｒ，Ｃ，、シーバーブ（Ｓｅｅｂ
ｕｒｇ）、Ｐ、Ｈ，およびライオン（Ｗｉ　ｏｎ）、に
、Ｌ、（１９８１）核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａ
ｃ１ｄｓ　　Ｒｅ　ｓ　、旦、６１０３−６１１４゜ １０、セキグチ、Ｋ８、フクダ、Ｍ、およびバカモリ、
Ｓ、１．（１９８１）ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ルｅケミストリー（Ｊ、Ｂｉ。

１　、Ｃｈｅｍ、）２５６．６４５２−６４６２゜１１
、ペターセン（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ）、Ｔ。

Ｅｏ、トゲルセン（Ｔｈｏｇｅｒｓｅｎ）、Ｈ。

Ｃ，スコルステンガアド（Ｓｋｏｒｓｔｅｎｇａａｒｄ
）、パイベーペダーソン（Ｖｉｂｅ−ｒｅｄｅｒｓｅｎ
）、に、、サール（Ｓａｈｌ）、Ｐｏ、ソツトルプージ
ェンセン（Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ）、Ｌ、およ
びマグヌッソン（Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ）、Ｓ、（１９８
３）プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ
−・オブ・サイエンシス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１　、Ａ
ｃａｄ、ｓｃｉ、）ＵＳＡ　　８０．１３７−１４１゜
１２、サベイジ・ジュニア−（ＳａｖａｇｅＪｒ）、Ｃ
，Ｒ，、イナガミ（Ｉｎａｇａｍｉ）、Ｔ、および：Ｉ
−ヘン（Ｃｏｈｅｎ）、Ｓ。

（１９７２）ジャーナル・オブ・バイオロジカルｅケミ
ストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）２４７．７６１
２−７６２１゜ １３、グレゴリ−（Ｇｒｅｇｏｒｙ）、Ｈ，およびブレ
ストン（Ｐｒｅｓｔｏｎ）、Ｂ、Ｍ。

（１９７７）インターナショナル・ジャーナル・オブ・
ペプチド・アンド・プロティン・リサーチ（Ｉｎｔｅｒ
ｎ、Ｊ　、Ｐｅｐ、Ｐｒｏｔ−Ｒｅｓ、）旦、１０７−
１１９゜ １４、ソツトルプージェンセン（Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅ
ｎｓｅｎ）、Ｌ、、クラエイス（Ｃ１ａｅｙｓ）、Ｈ，
、ザジェル（Ｚａｊｄｅｌ）、Ｍ、ペターセン（Ｐｅｔ
ｅｒｓｅｎ）、Ｔ、Ｅ。

およびマグヌツソン（Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ）、Ｓ、（１
９７８）、化学的フィブリツリシスおよび血栓症におけ
る進歩（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　　ｉｎＣｈｅｍｉｃａｌ　
　Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓａｎｄ　　Ｔｈｒｏｍｂｏ
ｌｙｓｉｓ）、デイビドソｙ（Ｄａｖｉｄｓｏｎ）、Ｊ
、Ｆ、、ロワン（Ｒｏｗａｎ）　、Ｒ，Ｍ、、サママ（
Ｓａｍａｍａ）　、　Ｉｊ、　Ｍ　、およびデスオイア
ーズ（Ｄｅｓｕｏｙｅｒｓ）、Ｐ、Ｃ，編［セイベン・
プｌ／ス（Ｒａｖｅｎ　　Ｐｒｅｓｓ）、　ニューヨー
ク］Ｖｏｌ、３，１９１−２０９ページ。

１５、ニー（Ｎｙ）、Ｔ、エルグ（Ｅ　ｌ　ｇ　ｈ）、
Ｆ、およびルンド（Ｌｕｎｄ）、Ｂ、（１９８４）プロ
シーディンゲス９オブΦナシヨナル・アカデミ−會オブ
・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　ｌ　、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ　、）ＵＳＡ　　８↓、５３５５−５３５９゜ １６、ズーリトル（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）、Ｒ，Ｆ、（
１９８５）生化学的科学における傾向（Ｔｒｅｎｄｓ　
　ｉｎ　　ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ）
８月号、２３３−２３７ページ。

１７、ギルバート（Ｇｉ　１　ｂｅｒｔ）、Ｗ。

（１９７８）ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）２７１．５０
１゜ １８、クレイク（Ｃｒａｉ　ｋ）、Ｃ，Ｓ　、スプリン
グ（Ｓｐｒａｎｇ）、Ｓ・・フ′ツテリク（Ｆｌｅｔｔ
ｅｒｉｃｋ）、Ｒ，およびルッター（Ｒｕｔｔｅｒ、Ｗ
−Ｊ、（１９８２）ネイチー？−（Ｎａｔ　ｕｒｅ）２
９９．１８０−１８２゜ １９、バーポイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）′、Ｈ８Ｃ０お
よびドリー（Ｄｏｌｙ）、Ｊ、（１９７９）核酸の研究
（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、７、１５１３
−１５２２゜ ２０、マニアチス（Ｍａｎｉ　ａｔ　ｉ　ｓ）、Ｔ、、
フリトラ（Ｆｒｉ　ｔ　５ｃｈ）、Ｅ、Ｆ、およびサム
ブ）Ｌ／−／り（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、Ｊ、（１９８２
）分子のクローニング：実験室のマニュアル（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ　　Ｍａｎｕａｌ）［コールド・スプリング・ハーバ
−・ラボラトリ−（Ｃ。

ｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｅｒ　　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ）、ニューヨーク１．１−５４５ページ。

２１、マクサム（Ｍａｘａｍ）、Ａ、Ｍ、およびギルバ
ート（Ｇｉ　１　ｂｅｒｔ）、Ｗ、（１９８０）酵素学
における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎＥｎｚｙｍｏ　
１０ｇり６５，４９９−５６０゜ ２２、ムリガｙ　（Ｍｕ　１１　ｉ　ｇａｎ）　、　Ｒ
。

Ｃ０およびバーブ（Ｂｅ　ｒｇ）、Ｐ、（１９８１）プ
ロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オ
プ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１　、Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ　、）ＵＳＡ　　７８．２０７２−２０７６゜ ２３、ロパタ（Ｌｏｐａｔａ）、Ｍ、Ａ、、クリーブラ
ンド（Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ）、Ｄ、Ｗ。

およびソルナーーウェップ（Ｓｏｌｌｎｅｒ−Ｗｅｂｂ
）、Ｂ、（１９８４）核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　
Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｇ、１２．５７０７−５７１７゜ ２４、ヘウッセｙ（Ｈｅｕｓｓｅｎ）、Ｃ，およびドウ
ドル（Ｄｏｗｄｌｅ）、Ｅ、Ｂ、（１９８０）アナリテ
ィ力ル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ　、Ｂｉ　ｏｃ
ｈｅｍ、）１旦ヱ、１９６−２０２゜ ２５、マクブレゴール（ＭｃＧ　ｒ　ｅ　ｇ　ｏ　ｒ）
、１、Ｒ，、ミクレム（ＭＬ　ｃｋ　１　ｅｍ）　、　
Ｌ　。

Ｒ・・ジエイムス（Ｊ　ａｍｅ　ｓ）　、　Ｋおよびペ
ラパー（Ｐｅｐｐｅｒ）、Ｄ、Ｓ、（１９８５）血栓症
および止血（Ｔｈｏｒｏｍｂｓ、Ｈａｅｍ。

５ｔａｓ、）、５３．４５−５０゜ ２６、リトル（Ｌｉｔｔｌｅ）、Ｓ、Ｐ、、バング（Ｂ
ａｎｇ）、Ｎ、Ｕ、、ハームス（Ｈａｒｍｓ）、Ｃ，Ｓ
、、マークス（Ｍａｒｌｇ）。

Ｃ，Ａ、およびマツトラ−（Ｍａｔ　ｔ　ｌ　ｅ　ｒ）
、Ｌ、Ｅ、（１９８４）バイオケミストリー（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉ　ｓｔ　ｒｙ）２３．６１９１−６１９５゜ ２７．７ｚルヘイジエン（Ｖｅｒｈｅｉｊｅｎ）、Ｊ、
Ｈ，ムラアート（Ｍｕｌｌａａｒｔ）、Ｅ、チヤツプ（
Ｃｈａｎｇ）Ｇ、Ｔ、Ｇ、、クラフト（Ｋｌｕｆｔ）、
Ｃ，およびウィジンガアズ（Ｗｉ　ｊ　ｉ　ｎｇａａｒ
ｄｓ）、Ｇ、（１９８２）血栓症および止血（Ｔｈｏｒ
ｏｍｂｓ、Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、）、４８．２６６−２
６９゜２８、リジケン（Ｒｉ　ｊｋｅｎ）、Ｄ、Ｃ，お
よびコレン（Ｃｏｌｌｅｎ）、Ｄ、（１９８２）ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ　、Ｂ
　ｉ　ｏ　１　、Ｃｈｅｍ、）２旦互、７０３５−７０
４１゜ ２９、ロスクトｙフ（Ｌｏｓｋｕｔｏｆｆ）、Ｄ、Ｊ、
およびムッソニ（Ｍｕｓｇｏｎｉ）、Ｌ、（１９８３）
血液（Ｂ　１　ｏ　ｏ　ｄ）−灸！１．６２−６８゜ ３０、ロスクト−ｙ７　（Ｌｏ　ｓｋｕ　ｔ　ｏ　ｆ　
ｆ）　。

Ｄ、Ｊ、、７７７　ｅ　％ウリク（Ｍｏ　ｕ　ｒ　ｉ　
ｋ）、Ｊ、Ａ、、エリクソン（Ｅｒｆｃｋｓｏｎ）。

Ｌ、Ａ、およびローレンス（Ｌａｗｒｅｎｃｅ）、Ｄ、
（１９８３）プロシーディンゲス・オプ・ナシ璽ナル・
アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ　　８０．２９５６−２
９６０゜３１、チミエレウスカ（Ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋ
ａ）、Ｊ、、ランビイ（Ｒａｎｂｙ）、Ｍ、およびライ
マン（Ｗｉｍａｎ）、Ｂ、（１９８３）血栓症および止
血（Ｔｈｏｒｏｍｂｓ、Ｈａｅｍ。

５ｔａｓ、）、５０．１９３゜ ３２、コーニンガ（Ｋｏｒｎｉｎｇｅｒ）、Ｃ９、スタ
ッセｙ（Ｓｔａｓｓｅｎ）、Ｃ，Ｍ。

およびコレン（Ｃｏｌｌｅｎ）、Ｄ、（１９８１）血栓
症および止血（Ｔｈｏｒｏｍｂｓ、Ｈａｅｍｏｓｔａｓ
、）、４旦、６５８−６６１゜３３、フクス（Ｆｕｃｈ
ｓ）、Ｈ，Ｅ、、バーガー・ジュニア−（Ｂｅｒｇｅｒ
　　Ｊｒ）、Ｈ。

およびピップ（Ｐｉｚｚｏ）、Ｓ、Ｖ、（１９８５）血
液（Ｂ　ｌ　ｏ　ｏ　ｄ）見上、５３９−５４４゜

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ｈ−鎖　ｔ−ＰＡ　　ｃＤＮＡ−欠失突然変
異体の概略的表示である。 第２図は、臭化シアン−消化フィブリノゲンの存在下お
よび不存在下にｒｔ−ＰＡおよびｒｔ−ＰＡ突然変異体
の蛋白質の活性のデータを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、少なくとも１つのクリングル領域Ｋ２または少なく
   とも１つのフィンガー領域（Ｆ）、あるいはこれらの両
   者からなり、フィブリンに向う同等または改良された結
   合強さ、結合選択性、あるいはこれらの両者を有する修
   飾された形態を含み、そして天然分子の少なくとも一部
   を欠くかあるいは少なくとも２つのＫ２領域および／ま
   たはＦ領域を含有し、あるいは少なくとも１つの修飾さ
   れたＫ２領域および／またはＦ領域を含有し、フィブリ
   ンに向う改良された結合強さ、結合選択性、あるいはこ
   れらの両者を有することを特徴とする組織型プラスミノ
   ゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）突然変異体。 ２、信号ペプチド（Ｓ）、少なくとも１つのＫ２領域、
   および軽鎖（Ｌ）からなり、そしてプロペプチド（Ｐ）
   、表皮成長因子領域（Ｅ）、クリングル領域Ｋ１および
   Ｆ領域の少なくとも一部を欠く特許請求の範囲第１項記
   載のｔ−ＰＡ突然変異体。 ３、Ｓ、少なくとも１つのＦ領域およびＬからなり、そ
   してＰ、Ｅ、Ｋ１およびＫ２の少なくとも一部を欠く特
   許請求の範囲第１項記載のｔ−ＰＡ突然変異体。 ４、Ｓ、少なくとも１つのＫ２領域、少なくとも１つの
   Ｆ領域およびＬからなり、そしてＰ、ＥおよびＫ１の少
   なくとも一部を欠く特許請求の範囲第１項記載のｔ−Ｐ
   Ａ突然変異体。 ５、Ｓ、Ｐ、Ｌおよび少なくとも１つのＫ２領域または
   少なくとも１つのＦ領域、あるいはこれらの両者からな
   り、そしてＥおよびＫ１の少なくとも一部を欠く特許請
   求の範囲第１項記載のｔ−ＰＡ突然変異体。 ６、Ｓ、Ｐ、Ｌ、Ｅおよび少なくとも１つのＫ２領域ま
   たは少なくとも１つのＦ領域、あるいはこれらの両者か
   らなり、そしてＫ１の少なくとも一部を欠く特許請求の
   範囲第１項記載のｔ−ＰＡ突然変異体。 ７、Ｓ、Ｐ、Ｌ、Ｋ１および少なくとも１つのＫ２領域
   または少なくとも１つのＦ領域、あるいはこれらの両者
   からなり、そしてＥの少なくとも一部を欠く特許請求の
   範囲第１項記載のｔ−ＰＡ突然変異体。 ８、Ｓ、Ｌ、Ｋ１またはＥあるいはこれらの両者、およ
   び少なくとも１つのＫ２領域または少なくとも１つのＦ
   領域あるいはこれらの両者からなり、そしてＰの少なく
   とも一部を欠く特許請求の範囲第１項記載のｔ−ＰＡ突
   然変異体。 ９、Ｓ、Ｐ、Ｅ、Ｆ、Ｋ１およびＬおよび２またはそれ
   以上のＫ２領域からなる特許請求の範囲第１項記載のｔ
   −ＰＡ突然変異体。 １０、Ｓ、Ｐ、Ｅ、Ｋ１、Ｋ２およびＬおよび２または
   それ以上のＦ領域からなる特許請求の範囲第１項記載の
   ｔ−ＰＡ突然変異体。 １１、少なくとも１つの修飾されたＫ２領域、Ｆ領域、
   あるいはこれらの両者からなり、フィブリンに向かう改
   良された結合強さ、結合選択性、あるいはこれらの両者
   を有する特許請求の範囲第１項記載のｔ−ＰＡ突然変異
   体。 １２、特許請求の範囲第１項記載のｔ−ＰＡ突然変異体
   の遺伝情報を指定するＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡまたは二本
   鎖ＤＮＡの形態の組み換え遺伝情報。 １３、特許請求の範囲第１２項記載の組み換え遺伝情報
   を内部に挿入して有する適当なクローニングおよび／ま
   たは発現ベヒクルからなることを特徴とする組み換えク
   ローニングおよび／または発現ベクター、例えば、プラ
   スミド。 １４、特許請求の範囲第１３項記載の組み換え発現ベク
   ターにより形質転換された適当な宿主微生物または細胞
   培養物を成長させ、そしてその中で生産されたｔ−ＰＡ
   突然変異体を単離することを特徴とする特許請求の範囲
   第１項記載のｔ−ＰＡ突然変異体の調製方法。 １５、特許請求の範囲第１３項記載の組み換えベクター
   により形質転換されかつ特許請求の範囲第１２項記載の
   組み換え遺伝情報をクローニングおよび／または発現す
   ることのできる微生物。 １６、特許請求の範囲第１３項記載の組み換えベクター
   により形質転換されかつ特許請求の範囲第１２項記載の
   組み換え遺伝情報をクローニングおよび／または発現す
   ることのできる細胞培養物。 １７、静脈血栓症、動脈血栓症、心筋梗塞、肺のまくれ
   こみ、およびフィブリン血餅停止血液循環の他の状態の
   治療における特許請求の範囲第１項記載のＬ−含有ｔ−
   ＰＡ突然変異体の使用。 １８、フィブリンの血餅、例えば、血栓を局在化するた
   めの像形成における、検出可能な標識、例えば、放射性
   同位元素を具有する特許請求の範囲第１項記載のｔ−Ｐ
   Ａ突然変異体の使用。 １９、特許請求の範囲第１項記載のＬ−含有ｔ−ＰＡ突
   然変異体および少なくとも１種の薬理学的に許容しうる
   担体、希釈剤または賦形剤からなることを特徴とする静
   脈血栓症、動脈血栓症、心筋梗塞、肺のまくれこみ、お
   よびフィブリン血餅停止血液循環の他の状態の治療にお
   いて使用するための製薬学的組成物。 ２０、静脈内、動脈内または冠状動脈内の投与に適する
   特許請求の範囲第１項記載のＬ−含有ｔ−ＰＡ突然変異
   体の水溶液からなる特許請求の範囲第１９項記載の製薬
   学的組成物。 ２１、特許請求の範囲第１項記載の適当に標識されたｔ
   −ＰＡ突然変異体および少なくとも１種の薬理学的に許
   容しうる担体、希釈剤または賦形剤からなることを特徴
   とするフィブリンの血餅、例えば、血栓を局在化するた
   めの像形成において使用するための製薬学的組成物。 ２２、静脈内、動脈内または冠状動脈内の投与に適する
   特許請求の範囲第１項記載の適当に標識されたｔ−ＰＡ
   突然変異体の水溶液からなる特許請求の範囲第２１項記
   載の製薬学的組成物。