JPS62190079A - コラゲナ−ゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は脊椎動物のコラゲナーゼの製造方法に関するも
のである。

動物体の総蛋白質のうち約３０％はコラゲンによって占
められている。コラゲンが体内で分解代謝される際の律
速段階はコラゲナーゼが関与する反応段階であると考え
られておυ、コラゲナーゼは種々の疾病、例えばリエウ
マチ様関節炎、歯槽膿漏、角膜潰瘍、皮膚の異常、傷、
近年では庸瘍や癌など、との関連において注目されてい
る。

従来の技術 を＆動物のコラゲナーゼは、特異性に関して両棲綱や哺
乳綱などの綱による差異はないと考えられている。コラ
ゲナーゼを得る方法には、ラット子宮、ヒト白血球、滑
液、黒色腫ａ胞などの組織・細胞から直接抽出する方法
と、ウシガエルのオタマジャクシやヒトの皮膚線維芽細
胞などの細胞培養液を原料とする方法が知られている。

コクゲナーゼの精製法は原料とするものによシ種々の方
法が採られるが、概して一般的なイオン交侠クロマトグ
ラフィーや分子篩などの方法を組み合わせて行われる。

コラゲナーゼの精製において注目すべきは、アフィニテ
ィークロマトグラフィーを応用したいくつかの例である
。その主なものは、（１）コラゲナーゼの基質であるコ
ラゲンをリガンドとして用いる方法（Ｅｉｓｅｎ＋　Ａ
、　Ｚ、　ａｔ　ａｔ、　：　ＺＦＬＭｅｔｈｏｄｓ　
Ｅｎｚｙｍｏｌ、　、　３４．４２０−４２４　（１９
７４）　）及び（２ンカリクレイン不活性化剤であるト
ラジロール（アプロチニン）をリガンドとして用いる方
法′（Ｃｂｒｉｓｔｎｅｒ、　Ｐ、　ａｔ　ａｌ、　Ｈ
ＢＬｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

２１、６００５−６０１１　（１９８２））である。

発明が解決しようとする問題点 しかし、これら研究上有用なアフィニティークロマトグ
ラフィーも製造工業においては必ずしも直接応用可能で
はない。コラゲンをリガンドに用いた場合には、コラゲ
ナーゼによるコラゲンの分解により漸次吸着体の吸着能
低下を招き、吸着体の央使用回数に制限がある。また、
トラシロールをリガンドとした場合には、トラジロール
がカリクレイン、トリプシン、キモトリプシン、トリプ
シノーゲンなどコラゲナーゼ以外にも多種類の蛋白質分
解酵素又はその前駆体を吸着するため、必ずしも精製を
うまく進めることができるとは限らない。

問題を解決するための手段 本発明者は、コラゲンの基本構造であるそグリシン−Ｌ
−プロリン−Ｘ＋ｎ　中に反復して存在するＬ−プロリ
ンに注目し、ポリ−Ｌ−プロリンをリガンドとしたアフ
ィニティークロマトグラフィーを行うことによシ、ポリ
−Ｌ−プロリンがコラゲナーゼを高純度に精製するため
に極めて有効であることを見いだした。精製は、まず、
途中までの精製を５ｔｒｉｃｋｌｉｎらの方法（５ｔｒ
ｉｃｋｌｉＨｔｔａｔ、：　　ＢｔＯＣｈｅｍｉＳｔｒ
ｙｊ　　１６７　１６０７−１６１５　　（１９７７）
〕に準拠して行った。すなわち、線維芽細胞の培養上澄
液を原料として、５！Ｌ酸アンモニウムによる分画およ
びＣＭ−セルロースクロマトクラフィーの段階までの精
製を行った。そのあと続いて臭化シアン−活性化セファ
ロース４Ｂにポリ−Ｌ−プロリンを結合して調製したボ
ＩＪ　−Ｌ−プロリン−セファロース４Ｂカラムによる
本発明の方法で更に精製を進めることによって、高純度
のコラゲナーゼを得ることができた。

本酵素精製の中途段階であるＣＭ−セルロースクロマト
グラフィーを５ｔｒｉｃｋｌｉｎ　　らの方法に従って
行うと、コラゲナーゼ活性は塩化ナトリウムの濃度が０
．１Ｍ付近の一分に溶出される。このコラゲナーゼ活性
を有する両分を、透析・脱塩等の処理をしないで、直接
ポリ−Ｌ−プロリン−セフ１０−スのカラムへ添加して
コラゲナーゼをカラムへ吸着させることができるので操
作は簡易・迅速であシ、同時に透析等に起因する吸着や
失活による損失を最小限にとどめることができ、高収率
な結果が得られるものと考えられる。また、ポリ−Ｌ−
プロリンーセ７アロースカラムニ吸着シタコラゲナーゼ
は、０．１ＭＯ塩化ナトリウムを含む緩衝液によってカ
ラムを洗浄してもカラム上に保持されるので夾雑物質を
洗い去ることができ、精製度を上けることができるもの
と考えられる。

発明の効果 本発明の特徴は、コラゲナーゼの精製にポリ−Ｌ−プロ
リンをリガンドとするアフィニティークロマトグラフィ
ーを用いることによシ、簡易・迅速・高収率にして且つ
再現性よく高純度のコラゲナーゼを得ることができ、し
かも用いたアフィニティー吸着体は繰シ返し使用が可能
な点にある。

高純度の脊椎動物コラゲナーゼを簡易・迅速・高収率に
得る方法を確立することは、医学・薬学等の産業分野に
おける同酵素の基礎的・応用的研究、ひいては臨床応用
への利用を可能ならしめるために必須の要件であり、十
分なるａ製到達度と経済性を具備した該精製法は今後こ
れらの分野の発展に寄与することが期待される。

実施例 原料としてヒト胎盤血管壁の線維芽細胞を１０％牛脂仔
崩清を含むダルベツコのモディファイドイーグルズメデ
ィウム中で２日間培養（細胞密度＝ＩＸ１０細胞／ｊ！
／）シた培養上澄５．１１を用いて行った精製について
説明する。精製はすべて〇−４Ｃにおいて行った。

また、コラゲナーゼ活性の測定はＣａｗｓｔｏｎとＢａ
ｒｒｅｔｔの方法（Ｃａｗｓｔｏｎ、　’ｌ’、Ｅ、　
ａｎｄ　Ｂａｒｒｅｔｔ。

Ａ、Ｊ、　ＨＡｎａｔ、Ｈｉｏｃｈｔｍ、、　９９．３
４０　３４５　（１９７９）〕に従って行い、１単位（
Ｕ）のコラゲナーゼ活性は２５°Ｃで１時間に１μｙ（
９４０ｃｐｍ）の繊維状（１−Ｃ）アセチル化コラゲン
を可溶化する活性と定義した。

まず、５ｔｒｊｃｋｌｊｎ　　らの方法に従って培養上
澄に固体の硫酸アンモニウムを５５％飽和になるよう加
え、３０分間攪拌をしたのち１０．０００　Ｘ　９で２
０分間遠心分離して沈澱を捕集した。祷られた沈澱を３
６０紅の１０　ｍＭ塩化カルシウムを含む５　Ｑ　ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）　Ｋｉ解し、０
．１ｍＭ塩化カルシウムを含む１０　ｍＭ’Ｉ’　ｒ　
ｉ　ｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に対して十分に透析
した。透析後の標品を０．１ｍｋｌ塩化カルシウムを含
むＩ　Ｑ　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−塩ｒｆＲ緩衝液（ｐＨ７，
５）によって平衡化したＣＭ５２カラム（２Ｘ３２ｃｎ
１）にチャージし、カラムを１００倍容１０ｍＭ１”　
ｒ　ｉ　ｓ−塩Ｍ（ｐＨ７，５）で洗浄した。続いてカ
ラムの６倍容ずつの１ｍＭ塩化カルシウムを含む１０ｍ
ＭＴｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７，５）と１ｍＭ塩化カルシウ
ム及び３００ｍＭ塩化ナトリウムを含むｘＯｍＭＴｒｉ
ｓ−塩酸（ｐＨ７，５）　トに！ルｉｉｉ線型濃度勾配
溶出法によシコラゲナーゼ活性を溶出した。コラゲナー
ゼ活性は塩化ナトＩＪウム濃度が大体１００ｍＭの両分
に溶出された。コラゲナーゼ活性を含む画分を集め、次
に本発明のポリ−Ｌ−プロリンーセファロース４Ｂによ
る精製へと進む。用いたボＩ）−Ｌ−プロリン−セファ
ロースは、セファロース１　ａｔ当たシに２．６岬のポ
リ−Ｌ−プロリン（＋均分子童４０．００υ）を結合さ
せたものを用いた。ポ！Ｊ　−Ｌ−プロリン−セファロ
ース４Ｂカラム（１，７ｘ　８−８　ｃｍ　）をあらか
じめ１ｍＭ塩化カルシウム及び１００ｍＭ塩化ナトリウ
ムを含む１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝１（ｐＨ７，５
）によって平衡化しておき、これに上記のＣｆ１Ｊ５２
クロマトグラフイーで得られたコラゲナーゼ活性を含む
画分を直接通過せしめる。続いてカラムを３倍容の平衡
化に用いたのと同じ緩衝液により洗浄したあと、緩衝液
の塩化ナトリウム濃度を５００ｍＭに上げてコラゲナー
ゼをカラムから溶出した。

このようにして得られたポリ−トープロリン−セファロ
ースクロマトグラフィー後の精製コラゲナーゼ標品は、
同クロマトグラフィー前の標品に比較して２３０１ｍに
おける吸光度当たりの比活性が８倍上昇していた（表１
参煕）。同クロマトグラフィーでの酵素活性の回収率は
約５０％であった（表１参照）。また、この絹製標品を
５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動したあと
、銀染色によシ分析をした結果は、ポリ−Ｉ、−プロリ
ン−セファロースクロマトグラフィーにより標品中に混
在する夾雑蛋白質のａｉ類が極めて減少することを示し
た。すなわち、銀染色したゲル上で、同クロマトグラフ
ィー前の標品中に多数存在したバンドも同クロマトグラ
フ４−後の標品では分子蓋５へ０００．２７．　ＯＯＯ
及び２０．０００に相当する３本になっており、まだ完
全精製には至っていないものの、コラゲナーゼが高度に
ｎ製されたことを示した。

表　　　１ ０Ｍ５２　７８．０３１．７１４３　４．５１ポリ−Ｌ
−プロリン−１８＋０　　　　１．８２　　　６５．０
　　　　３５．７セフ１０−ス４Ｂ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ポリ−Ｌ−プロリンをリガンドとするアフィニティーク
   ロマトグラフィーを用いることを特徴とする脊椎動物の
   コラゲナーゼの製造方法。