JPS6193127A - ペプチドホルモンの分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野〕 本発明はペプチドホルモンをイオン交換液体クロマトグ
ラフィーを用いて分離する方法に関するものである。

〔従来の技術〕

ペプチドホルモンは人体で重要な働きをなす物質で、微
量で強い作用をもつことが知られている。

脳下垂体から分泌される甲状腺、性腺、副腎皮質などを
刺激するペプチドホルモンや成長ホルモンなど種々のペ
プチドホルモンが存在する。これらのペプチドホルモン
は医療において重要な役割りを果すことは明らかである
が、天然には微量にしか存在せず需要に対して著しく不
足している。長鎖のペプチドホルモンの場合、化学合成
は不可能で、組換えＤＮＡを用いる生産研究が行われて
いる。これまでに、この組換えＤＮＡを用いる方法によ
り、ソマトスタチン、インシュリン、セクレチンおよび
ヒト成長ホルモンなどの合成が報告されている。これら
のペプチドホルモンの内、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）
を例に最近の動向を説明する。

ｈＧＨとはヒトの下垂体中に存在するホルモンでヒトの
成長を促進する作用をもつホルモンをさす。このｈＧＨ
はアミノ戯１９１個よりなる、分子量およそ２１．５０
０の単純タンパク質のホルモンで種属特異性が非常に高
く、ヒトに対してはヒトの下垂体からＭ出したものでな
ければ効果がなく、例えば、ウシなどのもＯ〕をヒトに
注射すれば効果がないばかりか発熱や異種タンパクとし
ての反応を起こす。しかしながら、逆にヒトのものはよ
り下等なウシなどに対して効果を持っている。

現在、このヒトの脳下垂体由来のｈＧＨは下垂体性小人
症の治療薬として用いられているが、その絶対証は慢性
的に不足している。また、このｈＧＨはそのタンパク同
化作用を利用したケガやヤケドなどの治療薬、また動物
飼料添加物としての用途も可能であることか明らかとな
るなどその需要が一段と高まっている。

最近の遺伝子工学の著しい進歩により、組換えＤＮＡを
用いて大腸菌中でｈＧＨを生合成することが可能となり
、その大量生産研究が行われるようになった。この場合
に生合成されるｈＧＨは前述の１９１個のアミノ酸から
成るヒトの下垂体由来のｈＧＨのＮ末端にメチオニンが
ついた１９２個のアミノ酸から成るｈＧＨである。前述
のヒトの下垂体由来のｈＧＨを組換えＤＮＡを用いて生
合成したｈＧＨとはその生物学的効果については差異が
ないことが知られている。

一方、ｈＧＨを始めとするペプチドホルモンの分離には
、液体クロマトグラフィー法および電気泳動法が一般に
用いられてきた。

液体クロマトグラフィーによる分離、固定相の解離基の
もつ電荷と溶質のもつ電荷との間に働く静電気力を利用
したイオン交換クロマトグラフィー法、移動相と固定相
の間の溶質の濃度差に基づく拡散を利用した分°子篩り
ロマトグラフィー法および固定相中のリガンドと溶質と
の間に頷く生物学的親和性を利用したアフィニティクロ
マトグラフィ法が用いられてきた。

電気泳動法による分離の場合、不均一系電気泳動法に属
する等電点電気泳動がペプチドホルモンの分離に用いら
れてきた。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、前記の液体クロマトグラフィーの場合、
分離能に優れ、最も人混に用いられているイオン交換ク
ロマトグラフィーの場合ですら、分離能および迅速性と
いう点でさらに改良の余地があり、例えば、組換えＤＮ
Ａを用いて生産したｈＧＨを分離する際には、従来のイ
オン交換クロマトグラフィーを用いても夾雑タンパク質
を完全に除去することができなかった。

また液体クロマトグラフィによる分離ではデキストラン
ゲル、アガロースゲル等の多糖系ゲルが用いられている
。これらの親水性ゲルの細孔は、分子鎖が骨格をなして
細孔を形成するいわゆる網目構造のゲルである。これら
のゲルの耐圧性を向上させるために、デキストランゲル
、アガロースゲル等をエピクロルヒドリン、１．３−ジ
ブロムプロパノール等で架橋し、ゲル構造をハードにす
る方法がとられている。しかし、このような方法でもゲ
ルの耐圧性を充分に向上させることは困難であり、ペプ
チドホルモンの迅速で大量な分離はむずかしい。

一方、最近ビニルモノマーの架橋重合体もゲルろ過剤と
して利用されるようになってきた。

これらは、従来の軟質ゲルに比較して耐圧性に優れては
いるがやはり親水性が充分でなく、ペプチドホルモンに
対し強い疎水性相互作用を示し、分離法が複雑となり、
また回収率も十分でない。

電気泳動法による分離の場合、大量かつ迅速な分離がで
きない等の問題がある。

本発明者らは、従来のペプチドホルモンの分離法の問題
点を再検討した結果、従来用いられてきたものよりもさ
らに高分離能を有する充てん剤を用いたイオン交換液体
クロマトグラフィーを用いることにより、より高分離で
迅速かつ大量にｈＧＨを分離することに成功した。

〔問題点を解決するための手段〕

即ち、本発明は、ペプチドホルモンを水吸水度が３〜５
　ｍｔ　／　９−乾燥ゲル、排除限界分子量が標準ポリ
エチレンオキサイド換算で１０ｓ以上の巨大細孔径を有
する球状半硬質の架橋重合体粒子にイオン交換基を導入
したイオン交換クロマトグラフィー用充てん剤を用いた
液体クロマトグラフィーによる分離方法にあり、以下そ
の詳細を説明する。

〔作用及び発明の効果〕

本発明が適用できるペプチドホルモンとしては、下垂体
関連ホルモン、例えばソマトメジン、甲状腺刺激ホルモ
ン、消化管ホルモンとして、例えばセレクチン、その他
のホルモンとしてインシュリンおよびカルシトニン等の
分子量の比較的大きいものであり、特にｈＧＨを試料と
して用いた場合について更に説明する。

ｈＧＨにはヒトの脳下垂体から抽出したものと、遺伝子
組換え法により得ら★６伝子組換え法による場合、組換
えＤＮＡの合成の仕方により３つの方法がある。一つは
、ヒトの脳下垂体由来のｍＲＮＡを調製することにより
ｈＧＨに対応する組換えＤＮＡを作製する方法である。

しかしなから、この方法では発現するｈＧＨはＮ末端に
余分の２６個のアミノ酸がついたプレｈＧＨとなり、ｈ
ＧＨ本来の生物学的有効性が得られず、実用的ではない
。他はｈＧＨの１〜２４番目までに対応するＤＮＡ部分
は化学的に合成し、残りの１９１番目まではｍＲＮＡよ
り調製し、両者を酵素的に結合する半合成法およびｈＧ
Ｈ対応のＤＮＡをすべて化学的に合成する全合成法であ
る。

全合成法の場合、ｍＲＮＡの読み取りが効率よく行える
ように１）ＮＡが合成されるので発現効率が高いことが
予想される。また、半合成法および全合成法の場合は、
前記のＮ末端にメチオニンがついた１９２個のアミノ酸
より成るｈＧＨが発現するが、その生物学的有効性につ
いては何んら問題はない。

また、本発明に使用する液体クロマトグラフィーの充て
ん剤としては平均粒子径数ミクロンから数１００ミクロ
ンの球状粒子で、水溶媒中での平径を有する半硬質の多
孔性親水性樹脂に一級、二級、三級及び／又は四級アミ
ン類を導入した陰イオン交換クロマトグラフィー用充て
ん剤が用いられる。

このうち、好ましい基体ゲルとしての球状多孔性架橋ポ
リメタクリレートゲルは、アルコール残基がポリオール
エーテルあるいはポリオールポリエーテルの残基であり
、極めて優れた親水性を有することを特徴とするもので
ある。

このようなゲルの製法としては、例えば特願昭５８−１
６３２７４号により架橋重合反応する方法や、得られた
ゲルを更にグリシドール、エピクロルヒドリン、ポリオ
ールグリシジルエーテルなどのオキシラン化合物を反応
させて、必要により残存エポキシ基の水和反応を行うこ
とにより製造することができる。

また、２−ヒドロキシエチルメタクリレートやグリシジ
ルメタクリレートの架橋重合体からの製法としては、例
えば特開昭５４−１６０３００号に開示されているよう
に、オキシラン化合物あるいはポリオール、ポリエーテ
ルなどを反応させ、更に必要に応じてエポキシ基の水和
反応を行う方法によっても製造することもできる。

即ち、本発明の充てん剤に用いる基体ゲルとしては水吸
水度が３〜５ｄ／９−乾燥ゲル、排除限界分子量が標準
ポリエチレンオキシド換算で１０５以上の巨大細孔を有
し、かつ３１ｃ９／ｃｒ／を以上の耐圧性を有するアル
コール残基が少なくとも１個の水酸基と少なくとも１個
のエーテル結合を有する脂肪族ポリオールからなる多孔
性ポリメタクリレート粒子であり、その細孔表面に多く
のエーテル結合および水酸基をもつ親水性の半硬質球状
多孔性ゲルを基体ゲルとして、−級、二級、三級及び／
又は四級アミン類を導入した陰イオン交換液体クロマト
グラフィー用充てん剤である。

これらイオン交換基の導入割合は、目的とするペプチド
ホルモンにより異なるが、通常、膨潤ゲル１ｃｃあたり
、約１００〜２００μモル／Ｉｌｌ／ゲル前後が適当で
ある。

また、このイオン交換液体クロマトグラフィーに使用す
る溶離液としては、ｐＨ７〜９のトリス塩酸緩衝液及び
／又はグリシン緩衝液中ＯＭから３Ｍの塩濃度範囲内で
、このイオン交換液体クロマトグラフィーに使用可能な
無機塩類、塩化ナトリウム（Ｎａａｌ）　、硫酸ナトリ
ウム（ＮａｚＳＱ＊）、酢酸ナトリウム（ｏＨｓａｏｏ
ｓａ）　を塩化カリウＡ　（ＫＯＩ）の直線的濃度勾配
溶出法により分離を行う。無ｉ塩類の溶出時間はその濃
度に応じて１０分がら３時間の範囲内で行う。

〔実施例〕

以下、実施例によつて本発明を説明するが、本発明はこ
れら実施例のみに限定されるものではない。

実施例１ ｈＧＨ対応の全合成りＮＡを組み込んだ大腸菌（ｐＢＲ
３２２）を培養後、その菌体をα０３ＭＮａＧ１を含む
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７Ｏ）に溶解し、０℃から
４℃に冷却しながら超音波処理により菌体破砕を行った
。ポリエチレンイミンを添加後、１５．　ＯＯＯｒｐｍ
で３０分間遠心分離を行い、得られた上滑に６０％（Ｉ
ＪＩ（ＩＮ２Ｏ３を添加し、遠心分離後、沈殿物として
得られる０％から６０％画分に、α０２Ｍ１ｌス塩酸緩
衝液（ｐＨ７，０）を力ａえ、この溶液をろ過後、この
ろ液を試料液とする。

次に、液体りｐマドグラフ装置として「ＨＴＪ〇−ｇｇ
ｓｎＪ　（東洋曹達工業株式会社製商品名）またグラジ
ェンターとしては「ａ冨−４Ｊ　（東洋曹達工業株式会
社製商品名）を用いた。カラムは陰イオン交換基を導入
した高速イオン交換クロマトグラフィー用カラム［Ｔｓ
Ｋｇｅｌ　ＤＢＡＩ−５ｐｗＪ　（東洋曹達工業株式会
社製商品名）を用い、（１０２Ｍ）リス−塩酸緩衝液（
ｐＨＥＬ５）中のＮ＆０１の濃度をＯＭから１．０Ｍま
での１２０分間直線的濃皮製配溶出を行った。なお、流
速は１．０ａｔ１分に調整して常温にて分離を行った。

ｈＧＨのピークは保持時間２０分付近に出現し、ｈＧＨ
を分離することができた。

実施例２ 市販のヒトの下垂体から抽出したｈＧＨを試料として用
い、実施例１に記載の方法に従って分離を行った。その
結果、保持時間２０分付近にｈＧＨのピークが出現した
。

実施例３ 実施例１に記載の方法に従りて調製した試料液を、疎水
性液体クロマトグラフィーにてｈＧＨ部分を分画後、（
ＬＯ３Ｍ）！Ｊスス−酸緩衝液（ｐＨ７，５）中、Ｍａ
ｉｌの濃度をＯＭから（Ｌ３Ｍまで以下に記載の方法で
濃度勾配溶出を行った。

流速は１．０ｍ１１分に調整して常温にて努離を行った
０ ｈＧＨのピークは、保持時間１３分付近に出現し、ｈＧ
Ｈを高分離に分離することができた。

濃度勾配溶出法 ム：１０３Ｍトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）Ｂ：Ａ
＋［Ｌ３Ｍ　　Ｍａｉｌ 実施例４ 市販のｈＧＨを試料として用い、実施例３に従って分離
を行りた。ｈＧＨのピークは保持時間１３分付近に出現
した。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の実施例１、第２図は実施例２、第３図
は実施例３、また第４図は実施例４のそれぞれ得られた
クロマトグラムを示す。 特許出願人　東洋曹達工業株式会社 第２図 第３図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ペプチドホルモンをイオン交換液体クロマトグラ
   フィーを用いて分離する方法においてイオン交換液体ク
   ロマトグラフィーに用いられる充てん剤が、水吸水度が
   ３〜５ｍｌ／ｇ−乾燥ゲルで排除限界分子量が標準ポリ
   エチレンオキシド換算で１０＾５以上の巨大細孔径を有
   する球状半硬質の架橋重合体粒子にイオン交換基を導入
   したイオン交換液体クロマトグラフィー用充てん剤を用
   いることを特徴とするペプチドホルモンの分離方法。 （２）ペプチドホルモンがヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）
   である特許請求の範囲第１項記載の方法。 （３）ｈＧＨが組換えＤＮＡを用いて生産したものであ
   る特許請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。 （４）ｈＧＨがヒトの脳下垂体由来のものである特許請
   求の範囲第１項又は第２項記載の方法。 （６）イオン交換液体クロマトグラフィーに用いられる
   溶離液が、緩衝液中で０〜３Ｍの塩濃度の範囲で使用可
   能な無機塩類の直線的濃度勾配溶出法によって分離を行
   う特許請求の範囲第１〜４項記載の方法。 （６）緩衝液としてｐＨ範囲が７〜９のトリス塩酸緩衝
   液及び／又はグリシン緩衝液を用いる特許請求の範囲第
   ５項記載の方法。 （７）無機塩類として０〜３Ｍの塩濃度の範囲で使用可
   能な塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、酢酸ナトリウム
   又は塩化カリウムの少なくとも１種を用いる特許請求の
   範囲第５項記載の方法。