JPS619283A - 在郷軍人病の検出方法及び組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は在郷軍人病及び感染宿主内におけるその作因、
即ちレジュネラ・ニューモフィラ菌（Ｌｅｇｉｏｎｅｌ
ｌａ　ｐｎｅ、ｕｍｏｐｈｉｌａ　）の検出のための方
法及び組成物に関する。より具体的には、本発明におい
て記載される方法はレジュネラ・ニューモフィラー指向
抗体の検出に対して特異的な免疫学的抗原生成物の生成
に依存するものである。これらのレジュネラ・ニューモ
フィラ抗原生成物はり、二−−−モフイラ遺伝子よりな
る組換えＤＮＡクローンバンクより得られ、Ｅ、コリ（
Ｅ、ｃｏｉｌ　）クローニング宿主中で表現される。

感染宿主中の在郷軍人病の現在の診断方法は幾分信頼性
に欠け、一般的に高度の偽陽性或いは偽陰性の検出結果
に終る。この病気の疑いをもたれたキャリア（保菌者）
に病気を確認する際の問題の一部は、宿主から作因な単
離することが不可能であったことである。殆んどの細菌
性感染症の通常の診断には作因の単離の成功が要求され
る。在郷軍人病検出の代替的な接近手法としては、／）
Ｌ、ニューモフイラ菌の染色特性及び顕微鏡的形態学、
２）この微生物の特異的抗血清を用いた直接蛍光染色、
及び３）感染宿主中の循環抗体の検出のための粗製り、
二＝−−モフィラ抗原の使用、などが挙げられる。

非特異性染色操作の使用による在郷軍人病の検出は診断
のための特に信頼できる根拠であることが証明されてい
ない。Ｌ。ニューモフィラはグラム陰性菌であるが、そ
れは通常のグラム−染色技術によっては染色性が貧弱で
ある。通常のグラム方法により染色された試料がルゴー
ル染色と対比される分乗法は異った成功の度合いをもっ
てり。

ニューモフィラ菌の確認に用いられている。その他の非
特異性染色法、例えばジエテルレ（Ｄｉｅｔｅｒｌｅ　
）銀染色法、ギームザ（Ｇｉｅｒｎｓｍ　）染色法、メ
チレンブルー染色法、及びギメネズ（Ｇｌｍｅｎｅｚ　
）染色法なども試みられているが、これらも又異った度
合いの成功を得ているに過ぎない〔一般的な説明として
、Ｇ、ラテイマ−（Ｇ。

Ｌａｔｔｉｍｅｒ　）　［在郷軍人病（Ｌｅｇｉｏｎｎ
ａｉｒｅｓ　’Ｄｉｓｅａｓｅ）　Ｊブルセルデツカ−
社（ＭＩＬｒｃｅｌ＋　　　　　　　　Ｄｅｃｋｅｒ　
Ｉｎｃ、）、ニューヨーク、ｉｑｇｉ年６り〜ざ１頁を
参照〕。これらの染色法は、Ｌ、ニーーモフィラの存在
を示唆し得るものであるが、決して決定的なものではな
い。それらはその他の細菌が存在しない場合或いは感染
した組織を直接的に検査する場合にのみ有用である。

この菌の確認への一つの接近方法は、Ｌ、ニューモフィ
ラ抗原に向けられた抗血清を用いる直接蛍光抗体染色に
より与えられる。一般的にこの方法は、超免疫ウサギ抗
血清中のレジュネラー指向抗体の生成、およびその後の
抗体のＦＩＴＣ結合を含むものである。このＦＩＴＣ−
結合抗−レジュネラウサギ抗血清を次いでスライド固定
された擬似り、ニューモフィラー含有組織、吸引液或い
は痰試料と反応させる。この技術により幾つかの有望な
結果が示されているが、しかし、注意を働かさなければ
ならない。先ず、殆んどの抗血清はマイコバクテリウム
を含有するフロインドアジュバントの助けをかりてウサ
ギ中で産生されている。従って、得られたウサギＩｇは
しばしば患者の痰或いは胸水中に存在するマイコバクテ
リウムと反応する。第二に、抗体が相当な数のバクテロ
イデスΦフラジリス（Ｂａｃ’ｔｅｒｏｉｄｅｌＩｆｒ
ａｇｉｌｉｓ　）の臨床単離物と交差反応する可能性が
ある。

従って、直接免疫蛍光試験法はり、ニーーモフィラ菌の
迅速確認のための選択方法であるが、それはなお多（の
上記欠点を有するものである。この技術は、迅速検出が
特に重要であるこの病気の早期段階においては利用可能
ではないこのバクテリアを含有する活性な痰、胸水或い
は組織試料を必要とする。更に、この直接免疫蛍光試験
法の感度は低く、従って約６０〜７５％の活性症例が検
出されるに過ぎない。

現在では、標準的方法と了解されている在郷軍人病の診
断へのもう一つの接近手法は、Ｌ、二二−モフイラ菌の
表面上に存在する抗原に応じて感染した宿主中に形成さ
れた循環抗体を検出することを含むものである。これは
先ずホルムアルデヒド或いはスチーム殺菌のいずれかに
よりり、ニーーモフィ２菌を不活性化し、且つこの固定
細菌を擬似宿主内の反応抗体の検出のための間接免疫蛍
光アッセイにおいて使用することにより達成される。こ
のアッセイは急性及び回復期の両血清試料が必要とされ
、非特異性抗体の高いバックグラウンドレベルのために
感染中の単一血清試料について行われる場合には解釈不
可能である。この診断操作における高レベルの非特異性
反応の主たる理由は、人が曝されている他の通常のバク
テリアと交差反応をするり、ニューモフイン細胞抗原の
存在であると示唆されている。特異的イムノアッセイを
行うためには従って、交差反応性り、ニューモフィラ抗
原から特異性抗原を分離することが必須であろう。

従って、現在の在郷軍人病診断−おける上記欠点に鑑み
て、迅速、高感度及び特異的な技術がこの病気の存在を
早期に検出し、それを正しく且つ再現性よく診断するた
めに必要とされている。その様な接近手法の一つは、Ｌ
、ニーーモフィラに特異性の遺伝子が使用され、臨床試
料中のし、ニューモフィラ菌の存在を核酸）・イブリッ
ド形成により特異的に検出する組換えＤＮＡ技術を利用
することであろ５゜核酸ノ・イブリッド形成に固有の特
異性により、その様な技術は例えば痰或いは胸水試料中
の極めて低量のバクテリアを検出する能力を有する。本
発明により提供される第二の可能性のある検出方法は、
Ｌ、ニューモフィラからの個々の抗原分子の単離の成功
によりもたらされるものである。その様な抗原は次いで
直接的に循環抗体を検出するために使用されるか或いは
高度に特異性の抗体或いはハイプリドーマの調製に使用
することが出来る。この様にして調製される抗原或いは
抗体は極めて特異的となるように選択することが可能で
ある。

最も広い範囲において、本発明は、個々のレジュネラ・
ニューモフィラ表面抗原を表面−表現する組換え細胞を
産生及び選択する方法を提供するものである。得られた
選択組換えクローンは、細胞−表面発現ホモ表現型蛋白
質に加えて異種レジュネラ抗原遺伝子を転写及び翻訳し
、その翻訳された抗原性生成物の少なくとも一部をそれ
らの細胞エンベロープ中に挿入する。

本発明に従えば、断片化され次いで適当なベクターに連
結されたレジュネラ・ニューモフィラＰＮＡを使用して
適当なりローニング宿主細胞を形質転換させる。得られ
た組換え細胞は、個々のレジュネラ抗原を表現するのみ
ならず異種抗原も又細胞表面に輸送する組換えクローン
を検出するようにスクリーニングされる。好ましい実施
態様においては、レジュネ７ＤＮＡは制限酵素により断
片化され、プラスミドｐＢＲ３２２のテトラサイクリン
耐性遺伝子内でＤＮＡに連結され、得られた組換えプラ
スミドを使用してＥ、コリ細胞を形質転換させる。本発
明者の予想によれば、酵母、高等真核生物及びその他の
細菌系を含む他のクローニング系も又本発明において説
明されるｐＢＲ３２）、　／Ｅ、コリの代りに使用する
ことが可能である。

個々のレジュネラ・ニューモフィラ抗原は全レジュネラ
細胞に対して向けられた前吸着ウサギ抗血清を用いて確
認される。本発明に従えば、レジュネラＤＮＡを有する
組換えクローンはレジーネ′に′’ｔ″ｃ；ｈｌ”ｐ＋
７）１＠＊ｉ’！ｌ（ｃ！’＊ｔ’＋ｍ”０　　　　。

ローンを検出するようにレジュネラー指向抗血清を用い
てスクリーニングされる。好ましい実施態様において、
これは先ず形質転換された細胞の個々のクローンコロニ
ーを固体支持体上に個々の組換え細胞の溶解を防止する
ように堆積することＫより達成される。組換えクローン
細胞は次いで全病原体細胞により前吸着された標識抗−
レジーネ２抗体を用いてそれらの細胞表面上のレジュネ
ラ抗原の存在についてスクリーニングされる。

特に、本発明は三つの個々のレジュネラ抗原、即ちゲル
電気泳動により／９Ｋ（Ｋはキロダルトンと定義される
）、２’ｌＫ及びｂｔ、／ｂ、ｒｘに対応する位置に移
動する抗原を確認する。本発明の実施により細胞表面が
それぞれ１９Ｋ、ｕ／ｕＫ及び、２１ＩＫレジユネラ抗
原を表現する三つの個々の組換えクローンＡＴＣＣ４３
９７コダ、　　３９７１ｋ及び３９７コ６がつくられた
。

本発明は抗−レジュネラ・ニューモフィラ抗体の存在を
その様な抗体を含有する疑いをもたれた臨床試料内にお
いて検出するために全細胞ＥＬＩＳＡアッセイにおいて
選択された組換えクローンを使用することに基づくもの
である。従って、本発明は在郷軍人病の診断において、
該病気の経過中臨である。

病原性病気状態の免疫学的診断は通常、病原体自体に存
在する抗原決定基に対して特異的な抗体或いは病原体に
より特異的に表現され他の病原菌においては表現されな
い抗原のいずれかを必要とする。疑われた病原体の確認
及び種分化においては単一特異性抗体が有用であるが、
それらは疑われた病原体を含有する臨床試料がない場合
には殆んど診断の役には立たない。在郷軍人病の場合に
は通常そうであるように、その様な「活性な」臨床試料
が利用不可能である場合には、病原体により特異的に表
現される抗原を利用して感染した免疫能宿主による病原
体に対して向けられた循環抗体を検出することができる
。　゛ 循環抗体の検出はしばしば病原体−特異性抗原を利用す
るＥＬＩＳＡの使用により達成される。全病原体細胞は
直接的に全細胞ＥＬＩＳＡに導入して病原体に向けられ
た抗体を検出することが出来るが（或いはより標準的な
形態において間接蛍光アッセイにおいて）、これらの手
法は急病に際しては殆んど診断上の役に立たないことが
多い。Ｌ。

ニューモフィラ細胞の表面上の交差反応性抗原の存在に
より、反応性抗体力価のり倍の増大を検知するために各
種時間間隔において患者の血清を試験しなければならな
い。従って、現在の間接蛍光抗体アッセイ法は、優れた
即ち迅速且つ確実な病態の確認がある在郷軍人病の診断
には殆んど役に立たない。

Ｌ、ニューモフィラ細胞の細胞表面上に存在する抗原と
他の微生物の細胞表面上に存在する同様の抗原との間に
見られる交差反応性により、Ｌ。

二ニーそフイラ細胞の全細胞ＫＬＩＳＡにおける直接的
な使用は抗−レジュネラ抗体即ち在郷軍人病を確定する
ことができない。従って、本発明は交差反応性ではなく
即ちり、ニューモフィラに特異性である抗原の確認に基
づくものである。本発明の実施に際しては、例えばＥ、
コリのような異種の生物において個々のレジュネラ抗原
の表現な得る組換えＤＮＡ技術が利用される。更に、本
発明において記載される技術は、個々のレジーネラ抗原
を細胞表面に導入した組換えクローン細胞の選択を提供
するものである。これらの組換え細胞は従って対照とし
て全Ｅ。コリ細胞と組み合わせた全細胞ＥＬＩＳＡを用
いて特異性抗−レジーネラ抗体を検出することが出来、
従って各種時間間隔において対形成した血清を集める必
要がない。

本発明は具体例としてＥ、コリ宿主／ベクター系を利用
して構成されているが、本発明者等の予想ではその他の
クローニング系も又同様に機能し得るものである。例え
ば、細菌のみならず真核生物及び植物細胞宿主をも含む
Ｅ。コリ以外の数多くの宿主が組換えＤＮＡクローニン
グに首尾よく使用されている。更に、現在では各種宿主
に使用可能な数多くの適当なベクタ・−が利用可能であ
る。

例えば、細菌宿主が利用される場合には細菌プラスミド
の代りに例えばラムダファージのようなノくクテリオフ
ァージベクターが通常使用されている。

或いは又、真核生物宿主例えば培養された哺乳動物細胞
が利用される場合には５ｖ−ｔｔｏなとのウィルスベク
ターを使用することができる。

本発明の実施に際しての初期段階はレジュネラ・ニュー
モフィラＤＮＡを利用する組換えクローンバンクの構成
及びレジュネラ細胞に向けられた抗血清の調製である。

抗血清は交差反応性抗体を除去するためにクローニング
宿主に対して前吸着される。この前吸収された抗血清を
次いで利用して組換え細胞の個々のクローン上のレジュ
ネラ抗原の表現の探索を行い、この様にして在郷軍人病
の診断に有用な組換えクローンの選択を可能にする。細
胞表面がレジュネラ抗原を表現するクローンの初期同定
に引続き、これらのクローンを組換えクローン内に表現
されるレジュネラ抗原を同定及び特徴付けるために更に
特性化する。

材料　及び　方法 細菌の染色 医学博士ポール・ニーデルスタイン（ＰａｕｌＥｄｅｌ
ａｔｅｉｎ　）氏により提供されたロスアンゼルスのワ
ズワース・ベテランス・アトミニストレー’／ヨ７−＊
スピタ１１、／　（Ｗａｄｒｗｏｒｔｈ　Ｖｅｔｅｒａ
ｎｓＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ
　　ｉｎ　Ｌｏｇ　Ａｎｇｅｌｅｓ）からの臨床単離物
であるり。ニューモフイラ血清群／　（／３０ｂ　）を
全てのクローニング操作及び抗原調製に使用した。両目
的のためにり、ニューモフィラは感染されたモルモット
から単離され、緩衝化炭−酵母エキス寒天上において１
回のみ継代培養された。Ｅ、コリＫ　−／、２菌株ＨＢ
　／　０　／　（ｍｋ−１ｒｋ−１ｒｓｃ　Ａ　）及び
ＨＢ　１０／　（ｐＢＲ３２２）はテキサス大学ヘルス
サイエンスセンター医学部（テキサス州、サンアントニ
オ）　（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ
、　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｅｘａｓ　Ｈｅａ
ｌｔｈＳｃｉｅｎｃｅ　Ｃｅｎｔｅｒ、　Ｓａｎ　Ａｎ
ｔｏｎｉｏ、　Ｔｅｘａｓ　）の医学博士ジャック　ヤ
コブス（Ｊλｃｋ　Ｊａｃｏｂｓ　）から得た。

酵素及び化学薬品 制限酵素及びＴダＤＮＡリガーゼはベテスダリサーチ・
ラボラトリーズ％（メアリーランド州、ペテスダ）　（
Ｂｅｔｈｅｉｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ。

Ｂｅｔｈｓｓｄａ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）　　から得ら
れた。仔ウシ直腸アルカリ性ホスファターゼ、リゾチー
ム（等級／）、蛋白質Ａ−セファロース（５ａｐｈａｒ
ｏｓｅ）、５−アミノ−サリチル酸、アンピシリン、及
びテトラサイクリンはシグマケミカル社（ミズーリー州
セントルイス）　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ
ｏ、、　Ｓｔ。

Ｌｏｕｉａ、　Ｍｉａ＠ｏｕｒｉ　）から購入した。ワ
サビダイコンペルオキシダーゼ−結合ヤギ抗−ウサギイ
ムノグロプリンはキャラペルラボラトリーズ（ペンシル
バニア州、コクランビル）　　（ｃａｐｐｅｌｌＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ　、　Ｃｏｅｈｒａｎｖｉ　Ｉ　Ｉ
ｓ　、　Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉａ）から購入した。エ
レクトロブロッティング用の発色試薬ダークロロー／−
ナフトール及びニトロセルロース紙はバイオ−ラッドラ
ボラトリーズ（カリフォルニア州、リッチモンド）　（
Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｒｉｃｈ
ｍｏｎｄ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　）から購入した。

Ｐ紙結合アッセイ（タイプＨＡ）用のニトロセルロース
円盤はミリボワ社（マサチューセッツ州ベッドフォード
）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ。

Ｂｅｄｆｏｒｄ、　Ｍａｓａａｃｈｕ＋５ｅｔｔｓ　）
から購入した。ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ　）　３　
ＭＭ　　クロマトグラフィー紙はアメリカンサイエンテ
ィフィックプロダクツ（イリノイ州マッゴウパーク）　
（ＡｍｅｒｉｃａｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｒｏｄｕ
ｃｔｓ、　ＭｃＧａｗ　Ｐａｒｋ。

１１１１ｎｏｉ１１）から得た。フルオレセイン標識多
価ウサギ抗−レジュネラ抗血清はセンター・フォ・ディ
シーズ・コントロール（ジョーシア州、アトランタ）　
（ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｄｌｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒ
ｏｌ。

６６１ａｎｔａ、　Ｇｅｏｒｇｉａ　）から得た。

免疫化用り。ニューモフィラ細胞の調製６個の緩衝化炭
−酵母エキス寒天プレートからり、ニューモフィラ細胞
を採取し、プールし、６−のＰＢＳ　（ｐＨ７，３）中
に懸濁させた。この懸濁液の３−からホルマリンを２．
０チの最終濃度まで添加し、り℃で一晩保持することに
よりホルマリン殺菌細胞を調製した。熱殺菌細胞は残り
の３−の懸濁細胞を１０ＯＣに３０分間加熱させて調製
した。

画調製物は２ｑ時間の時点において非−生育性について
チェックを行った。

抗血清の調製 ニューシーラントウサギに０，２．’Ｉ及び６週間にお
いて２−の熱殺菌（／：Ｓ稀釈）或いはホルマリン殺菌
り、ニューモフィラ（／　：１０稀釈）細胞を皮下注射
した。９匹のウサギを免疫化させ、コ匹は熱殺菌細胞を
受は取り、２匹がホルマリン殺菌細胞を受は取った。血
清は７週間後に集められ、前免疫血清と共に一７０℃に
おいて貯蔵した。

免疫血清（ｏ、ｓ−試料）をダ回Ｅ、コリＨＢ　１０／
（ｐＢＲｊλコ）で吸収させてＥ、コリ（ｐＢＲ，？、
２コ）抗原と交差反応する抗体を除去した。各吸収につ
いて、／ｑｒｍｌｊの定常期培養物からの細胞を洗浄し
、血清と混合し、７℃で１時間回転させた。血清は各吸
収後５ｏｏｏ　ｘ　ｇにおいてＳ分間遠心分離して回収
した。沢過−結合アッセイに使用した血清も又ルリアー
ベルター＝　（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ、　ＬＢ）
寒天プレートから得られた細胞及び超音波破砕されたＥ
、コリ細胞で吸収した。超音波破砕吸収については、１
０ｒＩＬｌのＰＢＳに懸濁された２００−の定常期生育
培養物から得られた細胞をブ２ンソン・ンニフ７　（Ｂ
ｒａｎｓｏｎ　５ｏｎｉｆｅｒ　）プローブ超音波破砕
器で破砕し、次いで血清とダ℃において１時間混合した
。この血清−超音波破砕混合物をベックマン（Ｂｅｃｋ
ｍｓＬｎ　）　ＳＷ　ＩＩＯローター中において１００
．０００　Ｘ　１７　　において７時間遠心分離により
透明化した。Ｅ、コリー吸収血清のｊＯμｌも又０．／
−のホルマリン殺菌及びｏ、ｔｍｌの熱殺菌し、ニュー
モフィ２細胞の混合物でコ回ダ℃において３時間吸収さ
せた。全ての血清は使用前に５６℃で３０分間加熱し、
血清−超音波破砕混合物中に形成された凝固体は１０，
０００　Ｘ　９においてＳ分間遠心分離によりペレット
化し、除去した。この時点において、血清は、比較的抗
−Ｅ。コリ抗体を含まな（なるが、しかし、Ｌ、ニュー
モフイラ抗原に対する抗体は保持する。

プローウェルマイクロタイタープレートに固定された全
り、ニューモフィラ細胞を用いて酵素−結合免疫吸着ア
ッセイ（ＥＬＩＳＡ）により血清の抗−り、ニーーモフ
ィラ活性の試験を行った。リン酸緩衝塩水（ｐＨ７０，
２）　（ＰＢＳ）で／、５のｒｓｏｎ７１１における光
学密度に較正されたホルマリン殺菌り。

二−−モフィラ細胞を次いで更にＰＢＳで／：Ｊに稀釈
した。稀釈ホルマリン殺菌細胞のｏ、／ｍｌ試料を各ウ
ェルに添加し、マイクロタイタープレートをダコ℃で一
晩乾燥させた。この様にしてホルマリン殺菌細胞がマイ
クロタイター皿のウェルに固定された。プレートを０．
０１　％ツイーン２０　（Ｔｗｅｅｎ〃）を含有するＰ
ＢＳで３回洗浄し、次いで試験血清の逐次稀釈液（０，
１−試料）を添加し、プレートをミニミックス（Ｍｉｎ
ｉｍｉｘ）攪拌器〔フイシャーサイエンティフィック社
、メアリーランド州、シルバースプリング（Ｆｉｓｈｅ
ｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃｏ。

５ｉｌｖｅｒ　Ｓｐｒｌｎｇ、　Ｍｄ、　）　］　上で
室温においてコ時間インキュベートした。ＰＢＳ　−０
，０！ｒチツイーンＪで３回洗浄後０．／−のパーオキ
シダーゼ−結合ヤギ抗−ウサギイムノグロプリン（／　
：　／ｓｏ。

稀釈）を各ウェルに添加し、プレートを再びλ時間攪拌
した。ＰＢＳ　−０，０！ｉ％ツイーン〃で３回の最終
洗浄後０．１−の発色基質溶液（ｏ、ｏｇ％５−アミン
サリチル酸及び０．００４％過酸化水素、ｐＨ６，θ）
を各ウェルに添加した。３０分間攪拌後、１１！；Ｏｎ
ｍにおける吸光度をＭＲ！ＴＩＯマイクロエリザオート
リーダー（ダイナチック社） （ＭｉｃｒｏＥＬｉｓａ　Ａｕｔｏ　Ｒｅａｄｅｒ、　
Ｄｙｎａｔｅｃｈ　）中で測定した。ｏ、ｒ以上の吸光
度が陽性と考えられた。

血清吸収の有効性を評価するために、生きたＥ。

コリ全細胞が上記方法によりマイクロタイタープレート
ウェルに固定された同様のＥＬＩＳＡ試験が使用された
。

ホルマリン殺菌或いは熱殺菌された細胞で免疫化された
ウサギはホルマリン殺菌（全細胞）ＥＬＩＳＡにより測
定して／　：　１２１０以上の抗体力価を発生した。抗
−り、二−−モフイラ活性はｌ：１０以上の力価におい
て如何なる前免疫血清においても検出されなかった。Ｅ
、コリによる抗血清の吸収は抗−り、ニエーモフィラ活
性を７稀釈度より多くは減少させなかったが、しかし抗
−Ｅ６コリカ価をＥ、コリ全細胞ＥＬＩＳＡにおいてｌ
：３．２０〜／：Ｑに減少させた。

例Ｉ：クローンバンク 調製 ＤＮＡは、リン酸−緩衝化塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７，２
）中において緩衝化炭−酵母エキス寒天プレートから採
取したり、ニューモフィラ細胞より抽出した。汚染細菌
から保護するために、この懸濁液の試料を緩衝化炭−酵
母エキス及びヒツジ血寒天上にプレート培養し、脳−心
臓浸出物プロスに接種した。血液寒天或いは脳−心臓浸
出物プロス上では何等の生育も見られなかった。Ｌ、ニ
一モフィラの純粋な生育は緩衝化炭−酵母エキス寒、天
上で検出され、フルオレセイン−標識多価ウサギ抗−血
清を用いた直接免疫蛍光法により確認された。Ｌ、ニュ
ーモフィ７ＤＮＡはナカムラ等〔Ｋ、ナカムラ（Ｋ、　
Ｎａｋａｍｕｒａ　）、ＲｌＭ、パードル（Ｒ，Ｍ、Ｐ
ｉｒｔｌｅ）及びＭ、イノウニ（Ｍ、　Ｉｎｏｕｙａ　
）（／ｑｑｑ年）ジエイ、バクチリオル（Ｊ、　Ｂａｃ
ｔｓｒｉｏｌ、）／、７７　：　ｒｙｓ〜ｂｏｑ　］の
方法の修正により次の様にして抽出及び精製を行った。

レジュネ７１　ｍ　；、ｚ−モア　４７　（Ｌｏｇｌｏ
ｎａｌｌｍｐｎｓｕｍｏｐｈｉｌａ　）細胞を１個の７
２時間のＢＣＹＥ寒天プレートから採取し、りｗｉの！
；ＯｒｒＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ　ｐＨざ、Ｏ中に懸濁
させ、次いで３θ００　ｒｐｍでＳＯ分間遠心分離して
細胞をベレット化した。得られた細胞ベレットを／−の
８チスクロ一スー１５ｍＭ　Ｔｒｉｍ−ＨＣＩ　ｐＨｇ
、０　　中に再懸濁し、３７°で３０分間インキュベー
トした。０．ｌＩμｌの２！；ＯｍＭＥＤＴＡ及び０．
／Ａ１ｒＬｌの１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ
）を添加し、懸濁液を激しく渦巻き攪拌した。１１ｍ１
の２Ｄ■／−プロテナーゼＫ〔シグマバイオケミカルズ
（５１ｇｍｍ　Ｂｉｏａｈｅｍｉｃａｌｉ　）　］の溶
液を添加し、混合物を３７°で２時間インキーベートし
た。この溶液を次いで、２ｍＪのＳθｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
ＣＩ　、　ｐＨｇ、０を添加して稀釈した。

得られたＤＮＡ含有溶液を等容量の７エノールで２回抽
出し、次いで等容量のクロロホルム／イソアミルアルコ
ール（２＜＜：／）で−回抽出した。

いずれの場合においても、ＤＮＡは水層に残存し、有機
層は廃棄した。ＤＮＡを次いで最終水層から１００チエ
タノールの添加及び−〃０における放置により沈澱させ
た。

−９０で３０分後、ＤＮＡを３０．θｏｏｘｇにおいて
４０分間でペレット化させた。得られたペレットを乾燥
し、２ｍｌの標準塩クエン酸溶液（０，１３Ｍ塩化ナト
リウム−０，０／！　Ｍ　　クエン酸ナトリウム）に再
懸濁させ、りμｌの２ｔ１ｍ９　／ｍｌ　Ｄ　Ｎ　ａ　
ｓ　ｅのない膵臓ＲＮａｓｅｔニジグーｖ　（Ｓｌｇｍ
ａ　）　〕の溶液を添加した。この混合物を室温で／時
間インキュベート後グμｌの〃■／−プロテナーゼに溶
液を添加した。

この混合物を５７°で更に７時間インキュベートした。

得られたＤＮＡ溶液を上記の如く再びフェノール及ヒク
ロロホルム：イソアミルアルコールで抽出し、エタノー
ル沈澱させ、ペレット化した。

再終ＤＮＡペレットは、０．！ｒｍｌの１０ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ　−ＨＣｌ、ｐＨざ、０−１ｍＭＥＤＴＡ中に再懸
濁させ、使用されるまでｌＩｏにおいて貯蔵した。

精製ＤＮＡはＳａｕ　ｌ？Ａ制限酵素で部分的に制限さ
れ、消化断片を／　Ｍ　ＮａＣ］　−２０ｍＭ　Ｔｒ　
ｉｓ　　塩酸塩−ｇ　ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ＰＨｔ、０）
中の１０ｍ１の５〜ｑｏ９ｇスクロース勾配に適用し、
１００，０００ｘｌｉにおいて２７時間遠心分離させた
。勾配画分（ｏ、５ｍ１）をアガロースゲル電気泳動に
より分析し、２．５〜り、Ｓキロベース対の制限断片を
含有する両分をプールした。

ベクターｐＢＲ，３，０はＢａｍＨＩによる完全な消化
後アルカリ性ホスファターゼによるタ′脱ホスホリル化
によりクローニング用に調製した。稜者の操作の結果、
未処理線形ｐＢＲ３２２に対比してベクターの再環化及
び連結においてコール３一対数減少が生じた。

サイズ−分画り、ニコーモフィラＳａｕ　ｊＡ制限断片
な１ＤＮＡリガーゼを用いて脱ホスホリル化ｐＢＲ３２
，２に連結し、ＣａＣｌ２により下記の如（処理して適
格にされたＥ、　ｃｂｌｉ　　菌株ＨＢ　１０／を形質
転換するために使用した。

Ｅ、ｃｏｉｌ　ＨＢ　１０／の新鮮な３−の−昼夜培養
液をガラス培養チューブ内におけるＬＢプロス中で調製
した。この−昼夜培養液の５θｄを使用して新鮮な３−
のＬＢＢａスのアリコートに接種し、細胞をＯ１５、の
０−Ｄ−５５０まで生育させ、その時点において細胞を
氷上で冷却した。この時点以降、特に断りのない限り全
ての工程は氷上或いは冷所において行われた。氷上で７
０分間のインキュベーション後細胞をペレット化し、１
．ｓｍｌの氷−冷却無菌！１０ｍＭ　ＣａＣｌ２−　！
；ＯｍＭ　Ｔｒｉ　ｔｓ　−ＨＣＩ　ｐＨｇ　、０　中
に再懸濁させ、無菌の／、！；ｒｎｌエッペンドルフ（
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｆ　）チューブに移し、氷上で１５
分間インキ−ベートした。細胞を次いで一分間エッベン
ドルフ遠心分離機でペレット化し、上澄液を吸引排出し
、廃棄した。この細胞ペレットを次いで上記塩化カルシ
ウム溶液ｏ、：ｉｍｌ中に再懸濁させ、細胞懸濁液を４
ｔｏで一昼夜貯蔵した。

形質転換に使用される組換えプラスミドＤＮＡは１０ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｍ　−ＨＣＩ　、　ｐＨｇ、θ−／　ｍＭ　
ＥＤＴＡ中において１００μノまで稀釈し、上記Ｅ、ｃ
ｏｌｔ細胞に添加し、おだやかに渦巻き攪拌し、氷上に
置いた。３０分後、細胞なダ２°に４分装置いて衝撃処
理し、その後ｘｍｙ／ｍｌのアンピシリンを含有するｌ
−のＬＢＢａスを添加した。３７°で１時間インキュベ
ーション後細胞をψμ９７ｍ１　　アンピシリンを含有
するＬＢ寒天プレート上に置いた。形質転換体はアンピ
シリン（ダＯμＩ／ｍｌ）を含有するルリアーベルター
、＝−（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ　）寒天上で選択
した。ｑｏ個のアンピシリン−耐性（Ａｐｒ）形質転換
体をテトラサイクリン（ｔｈμＩＩ／ｍ／）を含有する
ルリアーペルター二培地上においてテトラサイクリン感
受性（Ｔｃ’　）についてスクリーニングを行った。

Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０／はベクターＤＮＡの７１ｇ
当り１０５形質転換体の効率で上記操作を用いて形質転
換した。ｙｏ個のＡｐｒ形質転換体の試料をテトラサイ
クリンを含有する培地に移した。ｌＩｏ個の全てはＴｃ
’であった。

抗原表現のためのクローンバンクのスクリーニング ＡＰ　ｒ形質転換体を次いで一般的しジュネラ抗原表現
を示す組換えクローンの検出を行うためにスクリー・ニ
ングを行った。使用した技術は細胞溶解工程であり、従
って個々のレジーネラ抗原の細胞表面表現を示す組換え
クローンに対して特異的なものではなかった。Ａｐ　ｒ
形質転換体を無菌の妻楊子で寒天プレート上にスポット
付けしくプレート当り約３８コロニー）え晩生前させ、
次いで乾燥ニトロセルロースフィルター円盤上に吸い取
うせた。／−，２μ４のホルマリン殺菌り、ニューモフ
ィラも又陽性対照として各フィルター上にスポット付け
した。コロニーは下記の如くマイヤー等［Ｍｅｙｅｒ　
、　Ｔ、　Ｆ、　、　Ｍｌａｖｅｒ　、　Ｎ、　、及び
Ｓｏ、Ｍ。

（／りｇ２年）　Ｃｅ１ｌ、　３０　：　桔〜見）の方
法によりそのままの位置（ｉｎ　ａｉｔｕ　）　　で溶
解した。

フィルター円盤を、それぞれ夕分間（ｉ）Ｏ，／ＮＮａ
ＯＨ，（ｊｊ）　／、！ｒ　Ｍ　Ｔｒｉｍ−塩酸塩（ｐ
Ｈ７，１１）、（山）　３００　ｍＭ　ＮａＣ１−３０
ｍＭ　　クエン酸ナトリウム及び（ｉｖ）　’７０　％
エタノールで飽和させた一連の夕個のベトリ皿中のワッ
ト−ｒ　７　（ＮＴｈａｔｍａｎｎ　）　３　ＭＭ紙上
にコロニー側を上にして逐装置いた。各フィルターを次
いで真空で６０℃にてコ時間乾燥させた。

抗原−保有コロニーはエンザイムイムノアッセイにより
次のようにして検出した。乾燥フィルターを３チゼラチ
ンを含有するＴｒｉｇ−緩衝塩水（ＳＯｍＭＴｒｌｓ−
塩酸塩、／！ＯｍＭ　ＮａＣ１ｐＨ７，５）に入れて非
特異性蛋白質結合部位をブロックした。

室温でユ時間おだやかに回転後、フィルターを上記の如
く調製されたＥ、　ｃｏｌｔ−吸収され、プールされた
抗血清の溶液（／、１％ゼラチン−ＴＢＳ　　中／　：
　ｇｏｏの稀釈度）Ｋ移し、室温で２晩インキユベート
した。次の朝、フィルターを蒸留水で濯ぎ、ＴＢＳ中に
おいて７回洗浄し、ペルオキシダーゼ−結合ヤギ抗−ウ
サギイムノグロプリンの溶液（／　：　３００の中にお
いてコ時間インキュベートした。

最終濯ぎ及びＴＢＳ中における一連のり回の洗浄後にフ
ィルターをＴＢＳ−メタノールのＳ：ｌ溶液中のＯ、Ｏ
Ｓ％のダークロロー／−ナフトール及び０．０／！ｒ％
過酸化水素よりなる発色溶液中に浸漬した。

発色を示す全てのコロニーはアルカリ性溶解及び中和工
程（即ち飽和ワットマン３ＭＭ紙上）が除去された修正
フィルター結合イムノアッセイにより再分析され、新た
に吸い取られたコロニーを直接的に真空オープン中に入
れた。

上記操作を用いて２５５９個のＡｐ　ｒ形質転換体をス
クリーニングした。これらのクローンのうち７７個（，
７，０％）は検出可能な青色を生成した。これらのうち
３７個（／、：１０％）は反応性が強いものと考えられ
、瘍個Ｃ／、ｇ’ｌｒ）は反応性が弱いものと考えられ
た。７７個の全ての反応性クローンを単一ニトロセルロ
ース円盤に移し、化学的溶解工程を排除した修正フィル
ター−結合イムノアッセイにより分析した。このアッセ
イにおいて、　７１個のクローンは検出可能な色を生成
した。を個は陽性が強く（クローンｌ／、１３、グ０．
　’Ｉ／、件及び７０）、及び５個は陽性が弱かった（
クローン３３、ダ７．６１．６タ及びり３）。これらの
７７個のクローンのうち７０個は又フィルターー結合イ
ムノアッセイにおいて細胞溶解との反応性が強いもので
あったのに対し、クローンｑ７は両アッセイにおいて反
応性が弱いものであった。フィルター−結合イムノアッ
セイ操作における化学的溶解工程の省略は、Ｅ、ｃｏｌ
ｉクローン細胞の細胞エンベロープ中に個々のり、二−
−モフィラ抗原を実際に取りこんだ幾つかのＥ。

ｃｏｌｔ　クローンの検出を可能にする。Ｌ、ニューモ
フィラ抗原の表面表現を示すその他のクローンは以下の
具体例において用いたその他の技術により検出された。

蛋白質イムノエレクトロブロッティング（ｉｍｍｕｎｏ
ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔｔｉｎｇ　）を用いてフィルタ
ー−結合イムノアッセイ操作により確認された陽性クロ
ーンの強い反応の原因である個々のし、ニューモフィラ
抗原を分析した。より具体的には、レジュネラー特異性
抗原の分子量を決定し、及び積極的に同定するためにコ
テ個の最も強い反応性のクローンを以下に説明するドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動及び蛋白質プロッティングにより分析した。

各クローンをアンピシリｙ　（ｇｏμｔｉ　７ｍｌ　）
を含有する３、ｏｍｌ、のルリアーベラーニ（ＬＢ）プ
ロス中において定常期まで生育させた。培養物は２度Ｐ
ＢＳで洗浄し、エラペンドル７　（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ
　）チュ−プに移し、ｏ、３ｎｒｒｔｌ　　の試料緩衝
液（７！ｒ　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−塩酸塩、タチコーメルカ
ブトエタノールえ一５ＤＳ１７０チグリセロール、ｏ、
ｏｏコチ　ブロモフェノールブルー、ｐＨＡＪ）中に懸
濁し、７００℃に、２コ分間加熱した。５ＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動は下記の如くレンムリの方法
（Ｌａａｍｍｌｉ　、　　Ｕ、に、（／り７０）Ｎａｔ
ｕｒｅ　　（Ｌｏｎｄｏｎ　）／／７　：　４ＩＯ−Ａ
ｇり）により弊屋スラブゲル電気泳動タンク〔ヘンファ
ーサイエンティフィック　ィンスツルメント（カリフォ
ルニア州、サンフランシスコ）　（Ｈａｅｆｅｒ　５ｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃ　ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＳａｎ　Ｆ
ｒａｎｃｉｓｃｏ、　Ｃａ１ｉｆ、）　］内において行
った。

ｏ、ｏｑｍｌの試料を５％ポリアクリルアミド堆積ゲル
（ＰＨ４，Ａ’）を通してＢｍＡ定電流において運転し
、１５％ポリアクリルアミド分離ゲル（ｐＨｆｏ、？）
を通してｋＯｍｋで運転した。ニトロセルロースへの蛋
白質の電気移動は０，０コ、ｔＭＴｒｉｓベース、０、
／９１　Ｍ　　グリシン、及び−一メタノールを含有す
る緩衝液（ｐＨｆ、３）を用いてトランスープロットセ
１１、／　ＣＴｒａｎｓ　−Ｂｌｏｔ　Ｃｅ１ｌ　（Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ　）　］内において３０ｍＶで７２時間行
った。ニトロセルロース上で正常状態に戻された蛋白質
をエンザイムー結合イムノアッセイで可視化した。先ず
、ニトロセルロースシートをＴＢＳのブロッキングｉｉ
中においてｏ、ｏタチのツイーン２０　（Ｔｗｓ　ｅ　
ｎ　：ｌｌ）　）で前インキュベートし、次いで／　：
　７に０のウサギ抗−レジュネラ抗血清を含有する同様
の溶液に一昼夜で移した。０．０！ｒ％のツイーン、２
６−ＴＢＳでダ回洗浄後シートをｏ、ｏｓチツィーン、
２６−　ＴＢＳ中の／　：　３０００の稀釈率のペルオ
キシダーゼ−結合ヤギ抗−ウサギイムノグロプリン中で
／時間インキエベートした。蒸留水中における濯ぎ及び
更にダ回のｏ、ｏタチツィーン、ｗ−ＴＢＢ洗浄後にシ
ートを発色試薬（！ｒ：／のＴＢＳ　：　　メタノール
溶液中のｏ、ｏｒｔｌｑ−クロロ−ｌ−ナフトール及び
０．０ｌ１％過酸化水素）に曝した。個々のバンクの分
子量は、その移動係数を同一のゲル上で運転され、クー
マシ−（ｃｏｏｍａｓｓ＋ｉｅ）青色染色により可視化
された蛋白質標準の移動に対する対数プロットと対比す
ることにより推定した。

蛋白質イムノプロッティング技術により分析された２９
個の反応性の強いクローンのうち（ａ２個のクローンは
不安定であり、抗生物質含有培地内において維持するこ
とができなかった）ｔｔｒ個はＥ。

ｃｏｌｔ−吸収ウサギ抗血清を用いた蛋白質プロッティ
ングにより検出されるがしかし前免疫血清を用いた蛋白
質プロッティングによっては検出されない蛋白質バンド
を有していた（下記表Ｉ参照）。

化学的溶解の有無を問わずフィルター−結合エンザイム
イムノアッセイにより強い信号を与えたクローン／／、
１３、％、ｌＩ／、件及びりＯは全て同一の抗原性蛋白
質を表現した。これらの抗原は／９Ｋ　−，２！にの範
囲においてバンドの集合として表われる。

全てのＥ、　ｃｏｌｔ菌株のイムノプロットに弱い反応
性の／９に−ＪＫのバンドが見られたので、本発明者ら
はクローン化された抗原のバックグラウンドバンドから
の別々の同定を確認するために追加の技術により代表的
なりローン（Ａ／／）を分析した。

未吸収抗血清でプローブされた蛋白質イムノプロットは
／９に抗原が受容体Ｅ、　ｃｏｌｔ菌株及びり、　二一
一モフィラの両者に存在することを確認した。

Ｅ、　ｃｏｌｔクローン屋ｌ／は両方の反応性を表わす
。

更に、クローンＡ／／の吸収抗血清を用いた放射性免疫
沈澱による分析はＥ、　ｃｏｌｔのバックグラウンド抗
原とは区別された／９に、ＩＫ、　　コ３．！；　Ｋ、
　　及び２１１にのグつのバンドを分割した。又、この
分析において／？にと〃にの間のに、　ｃｏｌｔ抗原が
沈澱した。イムノプロッティングにより同定されたその
他のいずれのクローン化された抗原バンドもバックグラ
ウンド抗原バンドと一致しなかった。下記表Ｉはその細
胞表面が個々のり、ニューモフィラ抗原を表現する選ば
れたＥ、　ｃｏｌｔクローンの前記イムノプロットスク
リーニングにより得られたデータをまとめて示すもので
ある。

表■　クローン化されたり、ニューモフィラ抗原の特性
化 Ｅ、ｃｏｉｌ形質転換体　　　りｑ−ン化抗原の（単離
物番号）　　　　分　子　質　量３０　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　４ｇＫＡ３　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　４／　ＫＡ／、
に ／コ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
Ａ／に６Ｋ ｇＫ ／／、１３、ｔｉｏＳ弘／、ｌＩダ、７０　　　　　／
９Ｋ　−４７に’コ／、３／、３ユ、ダ３．４０．　？
／　　　　　　　評にグク、　ｇ／、　ｇコ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　／７Ｋ
ａ　放射線免疫沈澱は／９に、ｍＫＳ２７Ｋ及びコ、　
　　　　　　　　　　Ｋの個々のバンドを分割した。

蛋白質イムノプロッティング技術の結果により、同定さ
れた７ｇ個の反応性クローンのうち３つのクラスの個々
のり、ニューモフィラ抗原が特性付けられた。即ち、ゲ
ル電気泳動により／？Ｋに対応する位置に移動したもの
（クローンｌ／）、コ＋にのもの（クローン２／）及び
６６〜ＡｇＫのもの（クローン／コ）である。ＡＴＣＣ
の寄託条件を遵守して、これらのクローンはそれぞれＥ
、　ｃｏｉｌ　（ｐｓＭＪ　／／　）　（ＡＴＣＣ≠３
ｔｑ２ｑ　）、（ｐｓＭＪ　２／　）　（ＡＴＣＣ＋３
ｑｔ２ｔ、　）、及び（ｐｓＭＪ　／２　）　（ＡＴＣ
ＣＪ／Ｐ　３９７コＳ）の名称が与えられた。これらの
り、ニーーモフィ２−指向抗体に最も反応性の高い３つ
のクローンは上記の蛋白質イムノプロッティング技術に
より多数回再分析された。

これらの組換え細胞がり、＝ユーモフィラ抗原をそれら
の細胞表面上に表現したか否かを決定するために、これ
らの３種の代表的な菌株が全抗血清から同種のクローン
化された抗原に対して特異的免疫学的活性を選択的に吸
収する能力を試験した。いずれの場合においても、吸収
は、吸収に使用された特異性菌株に含有された特異的ク
ローン化抗原に対するイムノプロッテインクによって評
価された抗体活性を減少させた。これらの知見を下記の
表■に示す。

表■、抗原−表現クローンの粗製 抗−レジュネラ抗血清から特異的抗体を除去する能力 抗血清の吸収に　　　　　　吸収後の抗体反応性使用さ
れた菌株　　　　／９にユｌ　６／、、／Ａ□Ｅ、ｃｏ
ｌｔ　　（ｐＢＲ，７，Ｌ２）　　　　　　　＋　　　
　　十　　　十Ｅ、ｃｏｌｔ　（ｐｓＭＪ　／／　）　
　　　　−＋　　　＋Ｅ、ｃｏｌｔ　　（ｐｓＭＪ　／
２　）　　　　　　　十　　　　十　　　−Ｅ、ｃａｌ
ｌ　　（ｐｓＭＪ！／　）　　　　　　　十　　　　−
＋苦減少したが全ては除去されなかった 更に本発明者らは酸溶出により洗浄細胞から特異性抗体
を回収することにより抗体への抗原の表面接近性を証明
した。これらのり日−ンがその表面上においてり、　ニ
ューモフィラ抗原を表現するという事実は液相エンザイ
ムイムノアッセイを利用して確認した。簡単に述べると
、この技術は、ｌ）プールされたウサギ抗血清の完全Ｅ
、ｃｏｌｔクローン細胞への選択的吸収、コ）完全クロ
ーン細胞からの抗体の溶出、及び３）溶出抗体の液相に
おけるり、　ニューモンイラ細胞との反応、を含むもの
である。こり液相イムノアッセイは例■において詳細に
説明する。

プールされたウサギ抗−り、ニューモフィラ抗血清の別
々のアリコートを個々にＥ、ｃｏｌｔ　（ｐＢＲ３２２
）及びり、ニューモフィラ抗原−産生組換え菌株（表Ｉ
）で吸収させた。ＰＨ３中においてｌ：１０に稀釈され
たプールされたウサギ抗血清のｏ、ｔｓｒｒｔｌずつの
アリコートを洗浄された完全細胞でダ回ｇ　’ｃにおい
て１時間吸収させた（各吸収当り／　Ｊ　、ｔ　Ｒ１の
定常期培養物）。血清をｓ’ｏｏｏ　ｘ　、）７の低温
遠心分離により逐次行われた吸収の間において回収した
。第を回目の吸収後に血清上澄液を集め、Ｏｏ、２．２
　ミクロンミリボワ（Ｍｉ　１ｌｉｐｏｒｅ　）　　フ
ィルターを通過させた。

完全細胞からの抗体の溶出 ｏ）ｍｌずつのウサギ抗血清のアリコートを洗浄細胞（
Ａ；ｍｌのＪ　ｃｇｌｉの定常期の培養物、或いは等容
量の寒天プレートから収穫されたり、二一一モフィラ）
と混合し、ダ℃で一晩回転させた。血清上澄液を廃棄し
、細胞ベレットをＰＢＳ中で３回洗浄した。最終洗浄後
ベレットをｉ、ｏｙｎｌ溶出緩衝液（０，１Ｍ塩化ナト
リウム、０，１Ｍグリシン、ｐＨＪＪ）中に再懸濁させ
、室温でＪθ分間回転させた。細胞を次いで再ペレット
化し、上澄液を除去ｔ、、０．２ａμｍ　ミリポワフィ
ルターを通過させ１．２ＭＴｒｉｓでｐＨ７，！；に徐
々に滴定した。これらの方法を用いて抗血清のアリコー
トをり、二一一モフィラ、Ｅ、　ｃｏｌｔ　ＨＢ　１０
／　（ｐＢＲ３２コ）及び３１　　　　　　　つの抗原
−表現組換えクローン（表■参照）の各々の表面に吸収
させ、それから溶出させた。

Ｌ、ニューモフィラ及びＥ、　ｃｏｌｔ細胞から溶出し
た抗体を各々反対種の細胞上の表面成分と反応する抗体
について分析を行った。Ｅ、　ｃｏｌｔ　（ｐＢＲ３コ
ニ）及びＥ、　ｃｏｌｔ　（ｐｓＭＪ　／／　）の定常
期細胞を洗浄し、ＰＢＳでＯｏＤ　　　　Ｏ，９に調整
した。

・５５０ ｏ、１１ｍ１の細胞懸濁液をベレット化し１、Ｌ。二−
−モフィラ溶出液中に再懸濁させ、＋’ｃでダ時間回転
させた。ＰＢＳ中で３回洗浄後細胞をペルオキシダーゼ
−結合ヤギ抗−ウサギＩｇＧ（／：／りＯθ稀釈度）中
に再懸濁させ、冷所中において更にλ時間インキエベー
トした。ＰＢＳ中で３回最終洗浄後最終細胞スラリーを
ｇつの等しいアリコートに分割し、色−生成基質（ｏ、
ｏｒ％ターアミノサリチル酸、ｏ、ｏｏｂチ過酸化水素
、ｐＨＡ、Ｏ）を含有するマイクロタイタープレートに
添加した。

１Ｉ−３０ｎｍにおける吸光度をＭＲ！；ＩＩマイクロ
エリザオートリーダー［ＭｌｃｒｏＥｌｉａａ　Ａｕｔ
ｏ　Ｒｅａｄｅｒ（ダイナチック　Ｄｙｎａｔｅｃｈ　
）　］において３０分間攪拌抜読み取った。逆の実験（
即ち、Ｅ、　ｃｏｌｔ（ｐＢＲ３２２）及びＥ、　ｃａ
ｌ　ｉ　（ｐｓＭＪ　／／　）からの溶出液と完全り、
ニシーモフイラ細胞との反応）も又同一方法を用いて行
った。

との液相アッセイの結果を下記の表■に示す。

例■：組換えクローンＥＬＩＳＡによる細胞なＯｏＤ　
　　　Ｏ，９まで再懸濁し、マイクロ・ＳりＯ タイターウェルに分配前にＳｍＭリン酸緩衝液中でｌ：
８に稀釈した以外は上記と同様にして、完全細胞のＥＬ
ＩＳＡを行った。抗力清の逐次稀釈はＥ、　ｃａｌｆ　
（ｐＢＲ３Ｊ、２　）或いはＥ、ｅｏｌ　ｉ　（ｐＳＭ
Ｊ　／／）のいずれかの細胞を含有する隣接する列のウ
ェルにおいて試験を行った。ウサギ免疫血清の逐次稀釈
液を完全細胞のＥＬＩＳＡにより試験したところ、ハイ
ブリッドプラスミド、Ｅ、ｃｏｌ　ｉ　（ｐｓＭＪ　／
／　）を含有する細胞に対する反応性は／　：　！ｊ；
００を越える稀釈率において対照菌株Ｅ、ｃｏｌｉ（ｐ
ＢＲｊユ２）に対するよりも比較的太きかった。これに
対して、これらのλつの全細胞抗原に対する反応性は前
免疫つサギ抗血清或いはウサギ抗−Ｅ、　ｃｏｌｌ免疫
血清のいずれの稀釈液においても同様であった。各血清
の反応性の差を血清稀釈率の函数としてプロットしたと
ころ、抗−り、ニエーモンイ２血清は２つの他の対象血
清から明確に区別された。これらの結果は、従って、Ｅ
、ｃｏｌｔ　（ｐｓＭＪ　／／　）を用いて非−特異性
抗体混合物中におけるレジュネラー指向抗体の存在の検
出を首尾よく行うことが出来ることを示している。

更に、細胞表面がそれぞれ個々のｌ、Ａ　Ｋ　１１、、
ｇ　Ｋ及び２’ｌＫレジユネラ・ニューモフィラ抗原を
表現するＥ、　ｃｏｌｉ　（ｐｓＭＪ　／、２　）及び
（ｐｓＭＪ　２／　）を利用した同様の研究は、又、こ
れらのクローンを非−特異性抗体混合物中のレジュネラ
ー指向抗体の存在の検出に使用することが出来ることを
示している。例えば、プールされたウサギ抗血清（／　
：　！；００に稀釈）を全細胞ＥＬＩＳＡ忙おいてＥ、
ｃｏｌｉ（ｐｓＭＪ　２／　）に対する免疫活性につい
て試験を行った。Ｅ、ｃｏｌｔ　（ｐＢＲｊコ２）を使
用する対照例はｔＩ５０　ｎｍにおいてθ、ｌＩ以下の
平均吸光度を示した。

同一の抗血清をＥ、　ｃｏｌｔ　（ｐ８ＭＪコ／）Ｋつ
いて試験したところ、／：３２の抗原稀釈度におゆる／
、０から、ｌ：ｌ或いは／　：　１２ｇの抗原稀釈度に
おける約θ、りまでの吸光度が得られた。Ｅ、　ｃｏｌ
ｔ　（ｐｓＭＪ！／）細胞で前吸収された血清を試験し
たところ、ＥＬＩＳＡ免疫反応性は対照例のレベルに戻
った。

在郷軍人病の動物モデルがナショナル・インスチチュー
ト１オブ・ヘルス（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉ−ｔ
ｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　）　　のジム拳つィリア
ムズ博士（Ｄｒ、　Ｊｉｍ　Ｗｉｌｌｉａｍａ　）によ
りモルモットにおいて開発された。このモデルにおいて
は、メイル拳ハートレー（Ｍａｌｅ　Ｈａｒｔｌｅｙ）
系のモルモットが血清群ｌのり、ニーーモフィラの臨床
単離物で感染される。対照血清及びモルモット感染後ｌ
Ｏ日日及び３３日目に得られた血清はウィリアムズ博士
から提供され、本発明の有用性を示した。この研究には
、Ｌ、ニューモフィラ血清群ｌのフィラデルフィア（Ｐ
ｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ）　−８株で感染されたモルモ
ットからの血清が含まれている。

血清をＥ、ｃａｌ　ｌ　（ｐｓＭＪ　／／　）を用いて
上記全細胞ＥＬＩＳＡアッセイに付した。対照モルそッ
トから得られた血清は何等の評価できる免疫反応性も示
さなかった。反対に、フィラデルフィアー８株□による
感染後７０日目の動物からの血清は／　：　３２０まで
の血清稀釈度において相当な免疫反応性を示した。同様
に、フィラデルフィアーＳ感染後３３日日のモルモット
から得られた血清は／：８０までの血清稀釈度において
相当な免疫反応性を示した。

上記本発明は、本発明者らによって用いられている標準
的実験室技術によりやや詳細に例示的に説明したもので
ある。当業者には、本発明の趣旨及び範囲から離れるこ
となく、これらの操作の変更及び修正を行うことが可能
であることが明らかであろう。例えば、クローニングに
使用したレジュネラＤＮＡは制限酵素Ｓａｕ　ＪＡを用
いたＤＮＡの部分的消化により断片化されたがその他の
制限酵素を用いた或いは機械的剪断による部分的消化も
又同様に良好に機能し得るものである。或いは又標準的
なＥＬＩＳＡ方法が説明されたが通常固相抗体検出アッ
セイにおける他の検出方法と共にこの一般的方法を使用
することは同等に（或いはより良く）適したものとはな
らないのではないかと疑う理由は何もない。その様なア
ッセイはＩｇＭ−特異性結合抗体が現在使用されている
第二の抗体の代りに用いられる場合には最も有用なもの
となるであろう。更に、その様な修正及び変更も本発明
の特許請求の範囲内にあることは当業者には明らかであ
ろう。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）宿主細胞をレジュネラ・ニューモフィラ（Ｌ
   ｅｇｉｏｎｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）ＤＮＡ
   で形質転換させ、 （ｂ）形質転換された組換え細胞のクローンのコロニー
   をスクリーニングして細胞表面が レジュネラ・ニューモフィラ特異性性抗原 を表現する細胞を同定する ことを特徴とする、細胞表面がレジュネラ・ニューモフ
   ィラ特異性抗原を表現する組換え細胞の製造方法。 ２、宿主細胞が細菌細胞である、特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 ３、細菌宿主細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏ１ｉ）細胞である
   、特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、宿主細胞の形質転換が、 （ａ）レジュネラ・ニューモフィラＤＮＡを断片化し、 （ｂ）断片化されたＤＮＡを適当なクローニングビヒク
   ルに連結し、及び （ｃ）宿主細胞を組換えクローニングビヒクルにより形
   質転換する ことよりなる、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５、適当なクローニングビヒクルが制限酵素ＢａｍＨＩ
   で前消化されたプラスミドｐＢＲ３２２である、特許請
   求の範囲第４項記載の方法。 ６、ＤＮＡの断片化が （ａ）制限酵素Ｓａｕ３Ａを用いて部分制限酵素消化を
   行い、 （ｂ）部分的に制限されたＤＮＡを分子質量に従って分
   画し、及び （ｃ）２．５〜７．５キロベース対の断片長に対応する
   分子質量を示すＤＮＡ断片をプールする ことよりなる、特許請求の範囲第４項記載の方法。 ７、形質転換された細胞のクローンのコロニーのスクリ
   ーニングを行って、細胞表面がレジュネラ・ニューモフ
   ィラ特異性抗原を表現する細胞を同定することが、 （ａ）形質転換された組換え細胞の個々のクローンのコ
   ロニーを固体支持体上に個々の組換え細胞の溶解を防止
   するようにして堆積させ、（ｂ）レジュネラ・ニューモ
   フィラ抗原に対して特異性の標識された抗体を免疫複合
   体形成を可能にするように固体支持体と接触させて置き
   、及び （ｃ）細胞表面がレジュネラ・ニューモフィラ特異性抗
   原を表現するクローンのコロニーを検出する ことよりなる、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ８、細胞表面表現レジュネラ・ニューモフィラ特異性抗
   原が１９Ｋ、２４Ｋ、或いは６６／６８Ｋ抗原である、
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ９、細胞表面がレジュネラ・ニューモフィラ特異性抗原
   を表現する組換え細胞。 １０、抗原が、クローニングベクターに連結されたレジ
   ュネラ・ニューモフィラＤＮＡ断片を含んでなる組換え
   クローニングベクターによってコード化されている、特
   許請求の範囲第９項記載の組換え細胞。 １１、レジュネラ・ニューモフィラＤＮＡ断片が制限酵
   素Ｓａｕ３Ａによるレジュネラ・ニューモフィラＤＮＡ
   の制限酵素消化により得られる、特許請求の範囲第１０
   項記載の組換え細胞。 １２、クローニングベクターがｐＢＲ３２２であり、細
   胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である、特許請求の範
   囲第１０項記載の組換え細胞。 １３、細胞表面表現化レジュネラ・ニューモフィラ特異
   性抗原が１９Ｋ、２４Ｋ、或いは６６／６８Ｋ抗原であ
   る、特許請求の範囲第１項記載の組換え細胞。 １４、細胞表面が１９Ｋレジュネラ・ニューモフィラ特
   異性抗原を表現する組換え細胞大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）
   （ｐＳＭＪ１１）（ＡＴＣＣ＃３９７２４）。 １５、細胞表面が２４Ｋレジュネラ・ニューモフィラ特
   異性抗原を表現する組換え細胞大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）
   （ｐＳＭＪ２１）（ＡＴＣＣ＃３９７２６）。 １６、細胞表面が６６／６８にレジュネラ・ニューモフ
   ィラ特異性抗原を表現する組換え細胞大腸菌（Ｅ．ｃｏ
   ｌｉ）（ｐＳＭＪ１２）（ＡＴＣＣ＃３９７２５）。 １７、抗体を含有することが疑われている臨床試料にお
   いて、抗−レジュネラ・ニューモフィラ抗体の存在を検
   出する方法であって、細胞表面がレジュネラ・ニューモ
   フィラ特異性抗原を表現する組換え細胞の任意の一つ以
   上を用いて該臨床試料について全細胞ＥＬＩＳＡを行う
   ことを特徴とする方法。