JPS6191129A - 抗腫瘍剤 - Google Patents

抗腫瘍剤

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JPS6191129A
JPS6191129A JP59211423A JP21142384A JPS6191129A JP S6191129 A JPS6191129 A JP S6191129A JP 59211423 A JP59211423 A JP 59211423A JP 21142384 A JP21142384 A JP 21142384A JP S6191129 A JPS6191129 A JP S6191129A
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JP
Japan
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tnf
protein
amino acid
antitumor agent
tumor
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JP59211423A
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Genichiro Soma
源一郎 杣
Namiko Kitahara
北原 浪子
Tetsuya Katanaga
潟永 哲也
Masatoshi Yamazaki
山崎 正利
Shigeru Abe
茂 安部
Denichi Mizuno
水野 伝一
Masahiro Murata
正弘 村田
Toshio Ando
安藤 俊夫
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 童ス」の利用」ピ艷 この発明は、抗腫瘍剤に関し、更に詳しくは。
腫瘍壊死因子(以下rTNFJと記す)を含有する抗腫
瘍剤に関する。
貨】欽l支権 TNFは動物正常細胞には壊死作用を示すことなく腫瘍
細胞のみを壊死又は死滅せしめる作用を有する。従って
、抗腫瘍剤として使用すべく研究されてきた。しかしな
がら従来、TNF蛋白はある程度精製はされていたが、
抗腫瘍剤として使用するに耐えられる純度のTNF蛋白
は得られていなかった。ましてや、TNFを抗腫瘍剤と
して使用する際には、その物が化学的に特定できていな
ければならないが、その物を化学的に特定できる迄には
精製されていなかった。加えて、従来、腫瘍壊死作用を
有する蛋白の存在は知られていたが、その蛋白は一種類
のみか、あるいは多種の蛋白があるのかさえも知られて
いなかった。更に加えて従来知られていたウサギ由来の
TNFは、分子量40〜50kd (Br、J、Can
cer、40゜534〜539.1979)あるいは6
8〜52kd (J、Immnol、125.1671
〜1677.1980)であり、比較的分子量の大きな
ものであった。
方朋J」騰−しようとするl。
従って本発明の目的は、物として特定でき、かつ抗腫瘍
剤として使用できるような高度に精製された71’NF
蛋白を得、これによってTNFを抗腫瘍剤として使用で
きるようにすることにある。
問題点を解決するための手段 成上の問題点を解決するため、本発明者らは鋭意研究の
結果、TNF蛋白を化学的に特定し、かつ高度に精製す
ることによって、抗腫瘍剤として使用できるTNF標品
を得ることに成功した。
即ち、この発明は以下の内容を骨子とするものである。
マウス線維芽細胞を標的細胞とした時の細胞壊死比活性
が2X107単位/mg−m白以上であり、かつ腫ff
51y、AJ死囚子蛋白が分子中に下記のアミノ酸配列
を有し、かつ分子量が18kdである腫瘍壊死蛋白を含
有する抗腫瘍剤。
Scr−His−Val−Gly−Gln−Pro−P
ro−Pro−Leu−Glu−Pro−X−Val−
Ser−Glu−Arg  Gly  Arg−)!1
s−Try−Gin 但しXはCy s H又は糖を有するアミノ酸TNFは
以下のように製造することができる。
即ち、ウサギ、サル、ヒツジ、マウス、ラット、モルモ
ット、ウシ、ヤギ、イヌ等の哺乳動物の血管内、通常は
静脈内にマクロファージ賦活剤を投与する。投与方法は
、使用するマクロファージ賦活剤により異なるが、要は
血清中のTNF活性が最も高くなるように適宜予め定め
ておけばよい。
マクロファージ賦活剤としては、生体内においてマクロ
ファージに作用してマクロファージの異物諏別作用又は
貧食作用等のマクロファージの作用が賦活されるような
ものをいう。このような賦活作用の有無は、マクロファ
ージ賦活剤を投与した哺乳動物よりマクロファージを分
離して、生体外にてマクロファージの活性を調べること
により知ることができる。
マクロファージ賦活剤の具体例としては、リポポリサッ
カライド、BCG、インターフェロンで、レンチナン、
ザイモザン、リピドA、ポリ−■。
C等がある。
このようにして感作された哺乳動物より、TNl?は、
その分子量、溶屏度、電荷、特異的吸着能等を利用して
分H,精製することができる1例えば、透析、ゲルクロ
マトグラフィー、塩析、極性有機溶媒による沈澱及び電
気泳動、アフィニティークロマ!−グラフィー等を適宜
組み合せることによりf17製する。より具体的には次
のような方法がある。
n1li乳動物から得られた血清を100%飽和度の硫
安溶液を最終的に60%となるように血清中に添加して
T N Fを沈澱させる。この沈澱をリン酸iυ!’7
 teiで7容解し、D IミAEセファデックスの陰
イオン交換プロマトグラフィーにかけ、低塩;負度がら
、:゛6塩濃度のり衝液でTNFを溶71−させる。こ
れ1?Iの111出液のうちT N r−”の活性のあ
る部分をセフアリルS−200のゲル濾過にかける。こ
のゲル濾過操作を2回(り返し、もう一度、陰イオン交
換クロマ1−グラフィーにかける。このようにして得ら
扛だサンプルからブルーセファロース−63の特異的ク
ロマトグラフィーによりアルブミンをとり除き精製”1
’ N Fとする。
得られたTNF蛋白の化学的及び生物学的性質は以下の
とおりである。
(,1)得られたTNF蛋白標品は、5DS−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動法(pH8,3)により18k
dであるが、「セファクリル3−200Jによるゲル濾
過法では34kdである。
(b)N−末端部分のアミノ酸配列は以下のとおりであ
る。
(Ilis)−3er”His−Val  Gly−G
ln−Pro−Pro−Pro−Leu  Glu−P
ro−X−Va l−5er−Glu−Arg−Qly
−Argl−5er−Glu−Ar但しXはCy g 
H又は糖を有するアミノ酸である。又N−末端のHis
は確認していない。
(c)i”NFはr−−9292411胞を特異的に壊
死せしめる。またM H134腫疫細胞を腹部皮内に移
植されたC 3 H/ Heマウスに対し、延命効果を
示す。
(f)熱安定イ′l : 56°C,30分安定、70
℃、20′lr、50%失活、100°C,2分、10
0%失I舌、 (e、)ノ・rラミニダーゼ、ヒアルダーゼ及びトリプ
シンに対して安定。
1’ N Fけ以下のように定性及び定歌分析できる。
即ち、標的細胞であるL−929KM胞(Proc。
N;+ t 1.Acad、Sc i、U、S、A、7
2゜3666−3670)をイーグルミニマムエソセン
ンヤルh′r地(以下M TE Mと記す)に5%仔牛
脂児血清を加え育成し、8XIOa!胞が100−1の
同上培地に含まれる様にし、96六の平底プレートに育
種する。育種条件は37℃、2時間5%C02100%
ト■20で通常細胞培養に用いられる方法でよい。その
後アクチノマイシンDを培地中に終濃度1.−g/ml
となる様に加え、培養液の液量を150、−1とする。
即座にh−TN Fを含むと考えられる検体を適当にM
EM培地で稀釈したものを50Pl加える。この際稀釈
率を適宜7B製し、ED50を求める事ができる。更に
最終液量200 、、 lとなったL929剛胞を上記
条件で18hr培養を継続する。細胞壊死活性は、まず
全培地を除去し、ここに0.2%クリスタルバイオレッ
トを含む2%メチルアルコール溶液を加え固定染色する
。クリスタルバイオレットは全有核細胞を染色するので
、h −TN Fにより特異的に細胞壊死を生じた結果
フラスコ底面より遊歴した細胞は染色されないのでh−
TN F活性を直接に測定できる。この染色度を○D5
90nmの吸収でill!l定し、対照群に対する染色
度と比112する事でh −T N Fを測定する。活
性の定義は次の様に行う。L929細胞が50%生存で
きる検体原液の稀釈率をXとした時、その稀釈率の逆数
に10−3を乗じた値を原液の1mlあたりの活性とす
る。即ち原液の1000分の1稀釈でED50を与える
検体の活性は1単位/ m lである。
鼓盤 (])TNFの単離、精製 日本白色家兎(体重2.5ないし3.0kg)10羽に
18mg/羽のBCG (日本BCG(株)、凍結乾燥
品〕を静脈投与し、2週間後80オ、 g 7羽のE、
coli0127のりポボリサツカライド(Difco
  Lab、Detroit、B8)を静脈投与し、2
時間後、全血を採取した。得ら第1た400m1の全血
清に600m1の硫安飽和溶液を添加し、pH7,0,
4℃にて一夜ゆっくり撹拌した。生じた沈澱を120 
m M N a Clを含む50mMリン酸ft FW
液(p H7、0)  20 mlにけん濁し、4℃に
て一夜120 m M N a C1を含む50mMリ
ン酸緩衝液に対し透析を行った。
透析内液を予め120mMNaC1を含む50mMリン
酸緩衝液(pH7,0)にて平衡にしたrDEΔ1号セ
ファデックス」に負荷して、蛋白画分を吸着せしめ、1
20〜400mMNaC1にて濃度勾配溶出を行い、2
50〜350mMのNa CIにて溶出された両分を採
取した。溶出液を限外濾過膜〔東洋化学(株)、セルロ
ースフィルター、MW1万以下通過〕を用いてlom1
程度に迄濃縮し、濃縮液を120mM  NaC1を含
む50mMリン酸緩衝液にて平衡にした[セファクリル
S−200J  (Pharmacia、NJ)カラム
に負荷し、分子量30〜40.kdの両分を採取した。
溶出液を限外濾過〔濾過膜、東洋化学(株)、セルロー
スフィルター、MW1万以下通過〕にて濃縮し、濃縮液
を「セファクリルS−200」を用いて、ゲル濾過を行
った。溶出液を更にDEAE−セファデックスカラムを
用い、200〜350mMNaC1にて濃度勾配溶出を
行った。溶出液(250〜350mM)よりアルブミン
を除くため、゛予め100mM  KCIを含む5” 
 OmM Tr i 5−HCI  (pH7,0)に
て平衡化した「セファロース−6BJカラムによるプロ
マトグラフィーを行い、溶出液を乾燥して、比活性2X
IO7単位/mgのTNF蛋白450.。
gを得た。
精製の間のTNF蛋白の比活性及び回収率を第1表に示
す。
第  1  表 *:103単位/ m g−蛋白 (2)TNF$i’J製蛋白の性質 得られたTNF蛋白は「セファクリルS−200」によ
るゲル濾過により34kdであり、また5DS−ポリア
クリルゲル電気泳動による分子量は18kdであった。
”I’ N F蛋白のアミノ酸配列を決定するために6
・−gのTNFをプロティン・セクエンサー(Appl
ied  Biosystem  Co、。
Ca1f、Model  470A)に導入した。
アミノ酸配列の決定方法は J、Biol、Cham、
 、 193.265 275 (1951)に記載さ
れ、ている方法により行なった。
実施例2 (1)TNFの単独使用による生理作用C3H/ l−
1eマウス腹部皮肉にMH134111瘍細胞を2X1
0’細胞数移植し、移植後4日で腫瘍が一定の大きさに
生着したものを無差別に部分けし、4,7.10日の日
程で、実施例1において得られた精製きれたTNFを1
10単位ずつ腫瘍内に投与した。2〜3日おきに腫瘍の
大きさを測定した。腫瘍の大きさは、腫瘍の最大長mと
最小長nの対数平均で表わした。又、対照群には、TN
Fと同様な日程で生理食塩液を投与した。
Ml1134腫fM細胞:C3H/Heマウス由来1]
F癌で腹水増殖可能にした腫瘍で、6〜8日の間隔で継
代したものを用いた。
C3H/llcマウス:通交系マウスで8週令のものを
用いた。
TNF:部分精製して比活性が300〜2000倍上昇
したサンプルを用いた。
その結果、対照群においては、腫瘍移植日から22日に
至るまで腫瘍が増殖をつづけ、22日目における腫瘍の
大きさは18mmに達し、最終的には全て死亡した。一
方、TNF投与群においては腫瘍移植後7日から10日
にかけて著明な腫瘍の退縮が見られ、最終的には完全治
癒マウスも出た。このことより、大量の110単位のT
NFは単独でも強い抗腫瘍効果を持つことが示された。
ちなみにr、ps(リポポリサッカライド)の単独での
最大効果は、この実験系において18日目で腫瘍径にし
て10mm前後であった。
(2)TNFの併用効果 シイタケ由来の多糖、レンチナン(Lentinan)
と併用制癌効果を持つが、検討を行なった。
M H134flifIIill胞を2X105細胞数
、C31−1/ Heマウス腹部皮肉に移植後、(1)
と同様に4.7.10日目にTNFを2.5単位ずつ腫
瘍内に投与した。レンチナンは6.25mg/kgを腹
腔内に12日、14日目に投与した。抗腫瘍効果の判定
は(1)と同様に22日における腫瘍径と延命日数によ
った。
又、Ml(134と異なる腫瘍であるルイス肺癌(3L
 L)に対する効果も調べた。C57BL/6マウス腹
部皮内に3’LLを3X105細胞数移植して、TNF
を5単位ずつ4,7,10.12゜141」に投与した
。レンチナンは6.25mg/kgを腹腔内に6.8,
10,12.14日目に投与した。抗III!瘍効果は
MH134と同様な方法で判定した。
MHI34111!瘍細胞= (1)と同様。
ルイス肺癌(3LL):マウス肺癌で2週問おきに継代
して用いた。
C3H/ Heマウス: (1)と同様。
C3H/ Heマウス:通交系マウスで8週令のものを
用いた。
レンチナン:シイタケ由来のβl−3結合を主鎖とする
グルカンである。味の素株式 会社より供与された。
結果は第2表に示すように、レンチナン単独投与群やT
NF単独投与群においては、22日において対照群との
間に差は認められなかった。一方、TNFとレンチナン
の併用群においては、腫瘍移植後22日1において、対
照群のみならず、TNF甲、独群やレンチナン単独群と
の間でも、腫瘍の大きさにおいて有意な差が認められ、
TNFとレンチナンの併用が、有効な制癌効果を持つこ
とが示された。
第2表において、腫瘍大きさは腫瘍移植後22日におけ
るものであり、延命日数増加率は対照群の生存日数を1
00としたときの治療群の延命日数を%で示したもので
ある。
第  2  表

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)マウス線維芽細胞を標的細胞とした時の細胞壊死
    比活性が2×10^7単位/mg−蛋白以上であり、か
    つ腫瘍壊死因子蛋白が分子中に下記のアミノ酸配列を有
    し、かつ分子量が18kdである腫瘍壊死蛋白を含有す
    る抗腫瘍剤。 【アミノ酸配列があります】 但しXはCysH又は糖を有するアミノ酸
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