JPS6178392A - Ｌ−リンゴ酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、フマル酸の生物工学的反応によるＬ　−リン
ゴ酸（以下ＬＭＡと略称する）の製造方法に関する。そ
の際、所望のＬＭＡのほかに未反応のフマル酸および生
物工学的反応よりの他の非イオン性物質を含有する反応
混合物が生ずる。

ＬＭＡおよびフマル酸は、一般に塩として存在する。

本発明は、反応混合物よりのＬＭＡの分離をより経済的
に行なうことを目的とする。　ＬＭＡけ、できうる限シ
純粋な形で取得されるべきであり、そして他の反応混合
物中に含有される物質は、再使用づれうる形で得られる
べきである。

フマル酸のＬＭＡへの生物工学的反応は、公知であり、
種々の方法で実施される。細菌類（ドイツ特許公告第２
，３６３，２８５号参照）、固定化細菌類（Ｂｕｒｏｐ
、　Ｊ、ＡｐｐｌｌＭｉＣｒＯｂｌｏｌ、３（１９７６
）、ｐｐ、１６９−１８３；米国特許第５，９２２，１
９５号参照）、真菌類（ドイツ特許出願公開第３，３１
０，８４９号参照）、固定化真菌類（ドイツ特許出願公
開第２，４５０，１３７号参照）または微生物から単離
された酵素フマラーゼ（ドイツ特許公告第２．４１５，
３１０号参照）をこの生物工学的反応に利用することが
できる。ＤＭＡ塩は、反応混合物中に僅かに高い濃度ま
たは比較的高い濃度で存在する（ドイツ特許出願公開第
！、３１０，８４９号参照）。更に、真菌と細菌との連
合によるグルコースのＬＭＡへの生物工学的反応が記載
されている〔ジャーナル・オブ・ファーメンテ−ジョン
・テクノロジー（Ｊ、Ｆｅｒｍｅｎｔ、Ｔｅｃｈｎｏｌ
、）第５４巻（１９７６年）第１９７−２０４頁参照〕
。

反応混合物からＬＭＡを分離するための各種の方法が知
られている。例えば、発酵出発物質に多量のカルシウム
化合物が添加され、それによって、生成したＬＭＡがす
でに発酵の間にリンゴ酸カルシウムとして沈殿する（ド
イツ特許出願公開第１．４１７．０３３号参照）。反応
混合物は、また陽イオン交換体を用いて処理することも
でき、溶出液は、濃縮後濾過されそして蒸発乾燥される
（ドイツ特許出願公開第３．２４７９８１号参照）。更
に、反応混合物からまず未反応のフマル酸を酸性化によ
シ分離析出させその後でＬＭＡをカルシウム塩として沈
殿させることもできる。この塩は、硫酸で硫酸カルシウ
ムとＬＭＡとに変換させることができ、この後者は、溶
解している硫酸カルシウムを除去するために、イオン交
換体で処理される。

フマル酸の生物工学的反応によるＤＭＡの公知の製造方
法は、なかんずく以下の性質を有するニー未反応のフマ
ル酸の分離を目的とする反応混合物の酸性化の際Ｋ、添
加された酸と反応混合物中に含有された陽イオンとから
塩が得られ、このものは、次のＩ、ＭＡのカルシウムに
よる沈殿の後に、なる程大部分はｐ液中に残留するけれ
ども、一定の部分は、リンゴ酸カルシウムよりなるフィ
ルターケーキ中に含有畜れる。

一上記のフィルターケーキは、塩を含まずそして入念に
洗滌されなければならない。その際リンゴ酸カルシウム
の損失が生じ、それによってＬＭＡの収量が減少する。

涙液および洗滌水け、廃棄される。

一生物工学的反応の前にフマル酸の中和のために添加さ
れた苛性アルカリ液は、実際上はとんど回収され得す、
従って一回の使用の後に完全に失なわれる。

一価酸を用いてリンゴ酸カルシウムを反応せしめる際に
、硫酸カルシウム（石膏）が不可避的な副生成物として
生ずる。このものの除去は、この方法に追加的な費用を
もたらす。

−ＬＭＡを所望の高い純度においてしかも同時に高い収
量をもって得ることがしばしば困難である。

上記のことによって、ＬＭＡを高純度でしかも大きた収
骨で経済的な条件下にお込てＬＭＡを得るために、反応
混合物よりのＬＭＡの分離を改善するという課題が生ず
る。

この課題は、本発明によれば、フマル酸塩がらＬＭＡ塩
への生物工学的反応の際に得られる実際上細胞集団を含
オないかまたは予めそれを取除いてある反応混合物から
ＬＭＡを製造する方法において、以下の特徴、すなわち
ニ ー少くとも３個の小室を有する公知の電気透析単位（Ｉ
ＤＥ　）内において反応混合物を、ＬＭＡおよびフマル
酸を含有する酸濃縮物と苛性アルカリ液濃縮物と反応混
合物の非イオン性成分およびフマル酸塩およびＬ　＋　
ＩＪンゴ酸塩の残部を含有する希釈液（Ｄｌｌｕａｔ）
　ｋ連続的に分離し、 一公知の方法に従って酸濃縮物を処理して純粋なＬＭＡ
を得、そして苛性アルカリ液濃縮物をその再使用のため
に回収する、 ことを特徴とする前記ＬＭＡの製造方法によって解決さ
れる。

苛性アルカリ液濃縮物は、周期系の第１族のよりなる。

この苛性アルカリ液濃縮物は、フマル酸のＬＭＡへの生
物工学的反応に再循環されそしてそこで再びフマル酸の
中和に利用される。

酸濃縮物および苛性アルカリ液濃縮物は。

ＥＤＫから連続的に取出される。酸の循環、苛性アルカ
リ液の循環および塩−／希釈液の循環のしかも好ましく
は、生物工学的反応の開始前にフマル酸の中和のために
も利用はれた苛性アルカリ液を含有する。

本方法は、少くとも１つの双極性膜を有する１１ＤＢに
おいて反応混合物を分離する場合に特に経済的とがる。

この膜で電気透析的解離によって水素イオンおよびヒド
ロキシルイオンが生成し、これらはそのまま直接に酸−
および苛性アルカリ液の残部の中和に利用されうる。こ
の過程においては、実際上水素ガスも酸素ガスも生じな
い。

電気透析に関するその他の詳細は、例えばヘミー−イン
ジエヌールーテヒニーク（Ｏｈｅｍ、−Ｉｎｇ。

−Ｔｅｃｈｎ、　）第５６巻（１９８４）、第２１４−
２２０頁およびカーク−オスマー（Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍ
ｅｒ）編エンサイクロペディア・オブ・ケミカル・テク
ノロジー（ＫＪ、Ｏｈｅｍ、Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）第
３版第８巻（１９７９）第７２６−７３８頁、に記載こ
れている。

酸−および苛性アルカリ液循濃において所望の濃度に調
整てれると直ちに、酸および苛性アルカリ液の部分流が
それぞれの循環から取出でれる。取出された液体量は、
連続的に水ど混合される。酸および苛性アルカリの搬出
量は、ＩＨ）Ｂの膜を通過する酸および苛性アルカリ液
の流量とちょうど同じ量である。

酸濃縮物中でフマル酸は、一般にすでに大部分沈殿し、
それは酸循環においてフィルター上に保留はれそしてこ
の循環から取出づれる。このフマル酸は、バイオリアク
ター内で再びＬＭＡへの生物工学的反応にもたらされる
。

電気透析の開始時に、塩−／希釈液循環にフマル酸塩の
Ｉ、　＋　ＩＪンゴ酸塩への生物工学的反応よシの反応
混合物が供給される。電気透析の進捗と共に、反応混合
物は、フマル酸塩およびＬ−リンゴ酸塩が乏しＣ〕、遂
にはそれはこれらの塩の残りのみを含有しそして希釈液
として存在するようになる。その時、電気透析および希
釈液の循環は中断きれ、全部の希釈液が取出される。場
合によっては、この循環流は、水で洗滌される。この洗
滌水にアンモニアまたは殺真菌剤／殺細菌剤が添加され
、それによって循環中に（例えば膜に）停滞している微
生物が死滅する。

次に、塩−／希釈液循環に新鮮な反応混合物が満たされ
電気透析が再び開始される。

酸濃縮物は、第１の濃縮過程において６０℃以下の温度
において７０ないし７５重量％のＬＭＡの濃度とされ、
そして周囲温度まで冷却される。その際晶出する、少量
のみＬＭＡを含有するフマル酸は、分離される。残存す
るＬＭＡ溶液は、第２の濃縮過程において６０℃以下の
温度で８０重ｆ％以上のＬＭＡ濃度までもたらされ、そ
して周囲温度着で冷却される。その際晶出する、残りの
フマル酸の大部分を含有するＬＭＡは、分離はれる。更
に高い純度への要求がある場合には、この第２の濃縮過
程を繰返すことができる。第２の濃縮過程の後に残った
ＬＭＡ溶液は−好ましくは減圧下で一最後の濃縮におい
て液体の量が最初の量の約１０にのみとなるまで段階的
に濃縮される。

第１の濃縮過程の後の冷却に際して晶出する、少量のみ
ＬＭＡを含有するフマル酸は、生物工学的反応によるＬ
ＭＡの取得のためにバイオリアクターに再循環される。

第２の濃縮過程の後の冷却に際して晶出するフマル酸含
有ＩＩＭＡは、第１の濃縮過程のために定められた酸濃
縮物に再循環される。

最後の濃縮過程において残留する液体は、飽和ＬＭＡ溶
液であり、実際上全部のＬ−リンゴ酸塩および溶解され
た形のフマル酸塩を含有する。

この液体は、好ましくは、リンゴ酸塩とフマル酸塩とを
分離する目的で強酸性の陽イオン交換体にもたら式れる
。その後で液体は、酸濃縮物に再び添加される。

ＬＭＡの純度に対する要求がよシ低い場合には、場合に
よっては前記の処理過程の１つオたは２つを省略するこ
とができる。

本発明による方法Ｆｉ、下記の利点を有するニーＬＭＡ
およびフマル酸が沈殿反応なしに直接に分離ばれること
。

一夾際上フマル酸の損失がないこと。

−価値ある物質が注意深く回収されること。

−反応混合物がＥＤＢにおいて連続的に所望の酸濃縮物
および苛性アルカリ濃縮物へと連続的に処理されうろこ
と。

本発明による方法に適した反応混合物は、例えば下記の
ようにして製造される。公知のバイオリアクターにおい
て滅菌条件下で培養された細胞集団〔例えば真菌アスペ
ルギルス・ウエンテイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｗｅ
ｎｔｉｉ）のそれ〕が培養液から分離され、そして接種
物として、フマル酸塩（アンモニウム）溶液を装入され
た簡単に構成された容器に供給でれる。この溶液は、撹
拌されそして真菌の維持呼吸のために必要な少量の酸素
量と混合はれる。生物工学的反応は、フマル酸塩の約８
５重量％がＬ−リンゴ酸塩としく１３） て存在するようになると直ちに停止でれる。

この反応混合物から公知の方法に従って細胞集団が分離
される。反応混合物は一場合によっては活性炭上で濾過
された後に−ＫＤＫ中で分けられる。この酸濃縮物は、
第１図に概略的に図示されているように処理される。苛
性アルカリ濃縮物は、バイオリアクターに再循環され、
冥際上塩を含ま々い希釈液は、廃棄づれる。

第１図において、（１）は、フマル酸塩のＬ−リンゴ酸
塩への生物工学的反応用の反応器を示す。反応混合物は
、上記反応器から取出され、そして分離器（２）によっ
て細胞集団（３）が分離される。反応混合物は、場合に
よっては活性炭フィルター（４）を経てｇＤｇ（ｓ）に
装入される。

ＥＤＥを通る循環流は、図示されていない。ＫＤＦｉか
ら酸濃縮物（６）および苛性アルカリ濃縮物（力が連続
的に取出される。上記の両濃縮物は、まず図示されてい
ない容器に集められ、次いで苛性アルカリ液濃縮物は、
反応器（１）に、そして酸濃縮物は処理にもたらされる
。

塩−／希釈液循環中の塩濃度が前記の値まで低下すると
直ちに、希釈物（８）ハ、循環液から完全に除去される
。この循環流は、水で洗滌はれ、次いでｖＩｒたな量の
反応混合物と共に供給される。

酸濃縮物（，５）　ｉｔ、析出したフマル酸を分離する
ために５分離器（９）に通でれる。フマル酸は、飽和濃
度を超えた場合には、酸濃縮物中ですでに晶出すること
がある。選択的にこの分離器は、また酸循環流中に配置
されてもよい。フマル酸（１０）は−場合によっては中
間的な貯蔵の後に一生物工学的反応のため圧反応器に再
循環される。酸濃縮物（１１）　Ｖｉ、第１の濃縮工程
において（真空）蒸発器（１２）において濃縮はれ、そ
の除水（１３）が除去される。冷却された酸濃縮物（１
４）から、分離器（１５）内で更にフマル酸（１６）が
分離され、そして同様に一場今によっては中間的貯蔵の
後に一反応器（１）に再循環される。

酸濃縮物（１７）は、第２の濃縮工程におりて予備晶出
器（１８）　（例えば蒸発晶出器）内で濃縮され、その
際更に水（１９）が除去される。冷却された酸濃縮物（
２０）から、分離器（２１）内でフマル酸含有ＬＭＡ　
（２２）が分離はれ、そして蒸発器（１２）の前に再循
環きれる。濃縮されたＬＭＡ溶液（２３）は、蒸発晶出
器および分離器（２４）において例えば予め装入された
液体の残り（２５）となる壕で段階的に濃縮される。

晶出したＬＭＡ　（２６）は、分離されそして装置から
取出される。残りの液体（２５）は、分離され々かった
リンゴ酸およびフマル酸の反応後に−好ましくは陽イオ
ン交換体（２７）を経て一蒸発器（１２）の前で酸濃縮
物（１１）に混合はれる。

高込純度が要求される場合には、ＬＭＡ溶液（２３）は
、場合によってはもう１度予備晶出器（１８）および分
離器（２１）に通され、その際、更に水（１９）および
フマル酸含有ＬＭＡ　（２２）が分離される。

第２図は、３つの小室よりなるＥＤＥを使用する循環系
を概略的に図示する。陽極（３１）と陰極（３２）との
間に、陽イオン交換膜（３６）および陰イオ／交換膜（
３４）が配置されてい゛る。酸循環（３５）が陽極の前
に位置する小室を貫流し、苛性アルカリ循ｆｆｌ　（３
６）が陰極の前に位置する小室を貫流する。塩−／希釈
液循環（５７）は、陽極側を陰イオン交換膜でそして陰
極側を陽イオン交換膜で限定されている中間の小室を貫
流する。液体は、それぞれポンプ（３８）によって循環
される。それぞれの循環系は、それぞれポンプ受器（３
９）を有する。ＥｉＤＥのためのその他の補助装置およ
び流れ供給手段は、図示されていない。

第３図は、３つの双極性膜（４１）を有するＢＤＩＩＣ
を通る循環系を概略的に図示する。この循環系は、第２
図に類似する。更に、このＥｉＤＥは、陽極洗滌循環（
４２）を有する。各循環系のための導入口および排出口
は、図示されていない。

本発明による方法を以下の例の参照の下に更に詳細に説
明するが、これに限定されるものではない。

りし ＫＤＩ！！け、６つの小室からなり、陰イオン交換膜お
よび陽イオン交換膜を有し、これらは、第２図と同様に
配置されている。市販の膜は、例えば網状ポリスチレン
よりなる。陽イオン交換膜は、スルホン化により導入さ
れたＳＯｓ″−基を有し、そして陰イオン交換膜け、第
四アンモニウム基（ＮＨｊ＋）を有する。

それぞれの膜は、１４８ｃｍ’の活性面を有する。

膜の相互の距離および電極からの距離は、それぞれ約１
．４ＣＩＩＬである。

電気透析の開始前、各循環系は、下記の溶液を含有する
ニ ー塩−／希釈液循ｇ！＝リンゴ酸アンモニウム１４４．
１ｇ（約４１．２ｉｔ％）およびフマル酸アンモニクム
＋　６．３　ｊ；／　（約４．７ｆｉＪ１％）を含有す
る水溶液５５０ｊｊ。

一酸循項；蒸留水中Ｉ、ＭＡ　４０　ｇの溶液４００ｇ
、−苛性アルカリ循環：伝導度を高めるための少量のＮ
Ｈ，を含有する飲用水５ｏｎｙ。

電気透析の間、ＫＤＥには約１．５Ａの直流が流れる。

直流電圧は、電気透析の開始時には約１０■で、終り頃
には約６ｖであり、ＥＤＫに一定の４流が流れるように
調節される。

陰極において発生するＮＨ，ガスは、逆洗滌される。循
環ポンプは、それぞれ毎時的＋０２を供給する。小室は
持続的に完全に液体で満たされている。この例において
け、液体は循環から地山され寸だそれに供給もされなか
った。

６６時間の運転の後に、以下の結果が得られた： フマル酸け、酸濃縮物中では大部分結晶した形で存在し
た。酸潰縮物から結晶体８．２１が分離され、これは実
際上全部フマル酸からなっていた。

酸濃縮物は、５０℃および約５０ミリバール（絶対圧）
の圧力において最初にＬＭＡ　７３重量％の含量まで濃
縮され、そして２３℃に冷却された。結晶体４．７ｇが
分離され、このものは、ＬＭＡ１．２ｇおよびフマル酸
３．５ｙよりなるものであった。

残存した酸濃縮物は、約５０℃および約５０ミリバール
（絶対圧）の圧力において２変目にＬＭＡ　８５重量％
の含ｔまで濃縮されそして２３℃まで冷却された。湿潤
した結晶体５６．２１１が分離され、このものは、ＬＭ
Ａ　５５．Ｏｉおよびフマルｍｏ、５ｇよりなるもので
あった。

残存した酸濃縮物は、約５０℃および約４０ミリバール
（＠対圧）の圧力において残りの液体ｔＫなるまで段階
的に濃縮された。結晶体１０８．３１！および液体ＩＬ
６ｇが得られた。

上記の結晶体は、下記のものさらなるものであった： ＬＭＡ　　　　　　　　　　　　　　９７．７重量％フ
マル酸　　　　　　　　０．１重量％水　　　　　　　
　　　　　　　１．９重量％硫酸塩灰　　　　　　　＜
　ｏ、＋　＠ｔｈ％結晶体は、１％以下の水含量まで乾
燥された。

ここに記載した方法は、連続的にも実施されうる。

【図面の簡単な説明】 第１図は、本発明による方法を概略的に説明する工程系
統図である。 第２図は、３つの小室を有するｇＤＢを流れる循環系を
概略的に示す図である。 第３図は、３つの双極性膜を有するＥ！ｉを流れる循環
系を概略的に示す図である。 上記各図において、参照数字は、下記のものを示す： １・・・・・反応器 ２・・・・・分離器 ３・・・・・細胞集団 ４・・・・・活性炭フィルター ５　・・・・・　ＩＤＥ ６・・・・・酸濃縮物 ７・・・・・雇註アルカリ液濃縮物 ８・・・・・希釈液 ９・・・・・分離器 １０・・・・・フマル酸 １１・・・・・酸濃縮物 １２・・・・・（真空）蒸発器 １６・・・・・水 １４・・・・・酸濃縮物 １５・・・・・分離器 １６・・・・・フマル酸 １７・・・・・改濃縮物 １８・・・・・前結晶器 １９・・・・・水 ２０・・・・・酸濃縮物 ２１・・・・・分離器 ２２・・・自フマル酸含有ＬＭＡ ２３・−・・・・ＬＭＡ溶液 ２４・・・・・分離器 ２５・・・・・残部液体 ２６・・・・・晶出ＬＭＡ ２７・・・・・陽イオン交換体 ３１・・・・・陽極 ３２・・・・・陰極 ３３・・・・・陽イオン交換膜 ６４・・・・・陰イオン交換膜 ３５・・・・・酸循項系 ３６・・・・・苛性アルカリ循環系 ３７・・・・・塩／希釈液循環系 ３８・・・・・ポンプ ３９・・・・　ポンプ受器 ４１・・・・・双極性膜 ４２・・・・・陽極洗滌循環系

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、フマル酸塩からＬ−リンゴ酸塩への生物工学的反応
   の際に得られる実際上細胞集団を含まないかまたは予め
   それを取除いてある反応混合物からＬ−リンゴ酸を製造
   する方法において、少くとも３つの小室を有する公知の
   電気透析単位内で上記反応混合物を、Ｌ−リンゴ酸およ
   びフマル酸を含有する酸濃縮物と上記反応混合物の非イ
   オン性成分およびフマル酸塩およびＬ−リンゴ酸塩の残
   部およびその他の塩類を含有する希釈液とに連続的に分
   離し、上記酸濃縮物を公知の方法に従つて純粋なＬ−リ
   ンゴ酸へと処理し、そして苛性アルカリ液濃縮物をその
   再使用のために回収することを特徴とする上記Ｌ−リン
   ゴ酸の製造方法。 ２、フマル酸のＬ−リンゴ酸への生物工学反応に苛性ア
   ルカリ液濃縮物を再循環させる特許請求の範囲第１項記
   載の方法。 ３、酸の残りないし塩基の残りを中和するために必要と
   される水素イオンおよびヒドロキシルイオンが、主とし
   て電気透析単位内で少くとも１つの双極性膜上で生成さ
   れる上記電気透析単位において反応混合物を連続的に分
   離する、特許請求の範囲第１項または第２項に記載の方
   法。 ４、酸濃縮物の下記の処理工程、すなわち、酸濃縮物を
   ６０℃以下の温度において７０ないし７５重量％のＬ−
   リンゴ酸の濃度まで第１の濃縮にかけ、周囲温度まで冷
   却しそしてＬ−リンゴ酸を少量のみ含有する析出したフ
   マル酸を分離し、 残存するＬ−リンゴ酸溶液を６０℃以下の温度において
   ８０重量％以上のＬ−リンゴ酸の濃度まで第２の濃縮に
   かけ、周囲温度まで冷却しそしてフマル酸の残りを含有
   する析出したＬ−リンゴ酸を分離し、 Ｌ−リンゴ酸溶液を（好ましくは減圧において）この工
   程に予め装入された液体の量の約１０％まで蒸発濃縮し
   、そして 析出した純粋なＬ−リンゴ酸を分離する、 上記各工程を包含する特許請求の範囲第１項〜第３項の
   いずれかに記載の方法。 ５、第１の濃縮の後の冷却の際に晶出した、少量のみＬ
   −リンゴ酸を含有するフマル酸を、Ｌ−リンゴ酸への生
   物工学的反応のためにバイオリアクターに再循環させる
   特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６、第２の濃縮の後の冷却の際に晶出した、フマル酸含
   有Ｌ−リンゴ酸を、第１の濃縮に予定された酸濃縮物に
   再循環させる特許請求の範囲第４項または第５項に記載
   の方法。