JPS6138412B2 - - Google Patents
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- JPS6138412B2 JPS6138412B2 JP53064357A JP6435778A JPS6138412B2 JP S6138412 B2 JPS6138412 B2 JP S6138412B2 JP 53064357 A JP53064357 A JP 53064357A JP 6435778 A JP6435778 A JP 6435778A JP S6138412 B2 JPS6138412 B2 JP S6138412B2
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- isoelectric
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/416—Systems
- G01N27/447—Systems using electrophoresis
- G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor
- G01N27/44795—Isoelectric focusing
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D57/00—Separation, other than separation of solids, not fully covered by a single other group or subclass, e.g. B03C
- B01D57/02—Separation, other than separation of solids, not fully covered by a single other group or subclass, e.g. B03C by electrophoresis
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- G—PHYSICS
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/416—Systems
- G01N27/447—Systems using electrophoresis
- G01N27/44704—Details; Accessories
- G01N27/44747—Composition of gel or of carrier mixture
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Description
本発明は新規な等電点マーカーに関し、更に詳
細には、無水有機酸で処理された有色蛋白質から
なる等電点マーカーに関するものである。 最近、生化学や臨床検査の分野で蛋白質の分
離、精製及び分析の手段としてゲル等電点分離法
（ゲル等電点焦点法、ゲル等電点分画法などとも
称される）が注目を集めている。この方法は
Svenseonらによつて開発された密度勾配等電点
分離法の簡便法として考えられたものである。即
ち種々のPHに等電点をもつ特殊な両性電解質の混
合物をアクリルアミド、寒天等のゲルに封入し、
その両端に電極を置いて通電すると電極間に両性
電解質に由来するPH勾配が生じる。このような両
性電解質混合物を用いて作られたPH勾配の中では
蛋白質はその等電点の位置に集束されるという原
理に基づいている。（C.W.Wringley：Methods
in Enzymology Vol.22.p559−564、Academic
Press）この方法によれば、蛋白質をその等電点
の差によつて分離、精製することができるのは勿
論のこと、ゲル中のPH勾配を測定することにより
蛋白質の等電点を求めることも可能なので、蛋白
質の分析法としても大いに利用価値がある。 しかしこの方法の欠点として、ゲル内に形成さ
れたPH勾配を測定する為に泳動終了後直らにゲル
を取り出し均一間隔でできるだけ薄い輪切りに
し、その各々のゲル中に存在する両性電解質を脱
炭酸した純水によつて抽出した後、抽出液のPHを
測定するという繁雑な操作を行なわなければなら
ない、ことがあげられる。このPH測定の方法は両
性電解質を抽出するのに時間がかかる上、ゲルを
均一に切断することが困難で正確さに欠け、更に
抽出条件によつてPHの値が変動することがあるな
ど、実用上大きな問題がある。等電点分離法にお
けるゲル内のPHの指標として両性電解質の色素を
試料と共に泳動させたり（A.Conway−Jacobs
and L.M.Lewin：Analitical Biochemistry 43巻
394−400 ｐ、（1971））、同様の目的でフエナン
スロリン、鉄複合体を用いたり（E.T.
NAKHLEH etal：Analitical Biochemistry 49巻
218−224P（1972））する方法も試みられてい
る。しかしながら、このような物質は、低分子で
ある為、拡散が急速に起こることや、等電点値の
両端の解離基の解離定数が互いに大きく離れてい
るために分離層が広がるなどの欠点を有してい
る。 本発明者らは、このようなゲル等電点分離法に
おけるPH測定の困難性を改善するために、すぐれ
た等電点マーカーを求めて研究したところ、本発
明を完成するに至つた。 本発明は、無水有機酸で処理された有色蛋白質
からなる等電点マーカー車であつて、次の各一般
式で示される等電点マーカーである。 (1) 一般式 （ただし、 Ｘは発色団、 Ｐは蛋白、 NH2は主としてリジンのε−アミノ基、 ｎは１〜18の正の整数、 ｍはｍ≦ｎの関係にある正の整数、 Ｒは有機酸、アセチル基、サクシニル基から
選択された少くとも一種を示す） からなる等電点マーカ。 (2) 上記(1)式においてＲがアセチル基である一般
式 からなる等電点マーカー。 (3) 上記(1)式においてＲがサクシニル基である一
般式 からなる等電点マーカー。 (4) 上記(1)式においてＲがアセチル基及びサクシ
ニル基である一般式 からなる等電点マーカー。 本発明等電点マーカーを製造する原料は有色蛋
白質であるが、これには種々の動植物または微生
物起源のチトクロームＣ類、ミオグロビン、ヘモ
グロビン、フラビン蛋白、銅蛋白等があげられ
る。これらの有色蛋白質の代表的な例が第１表に
示される。
細には、無水有機酸で処理された有色蛋白質から
なる等電点マーカーに関するものである。 最近、生化学や臨床検査の分野で蛋白質の分
離、精製及び分析の手段としてゲル等電点分離法
（ゲル等電点焦点法、ゲル等電点分画法などとも
称される）が注目を集めている。この方法は
Svenseonらによつて開発された密度勾配等電点
分離法の簡便法として考えられたものである。即
ち種々のPHに等電点をもつ特殊な両性電解質の混
合物をアクリルアミド、寒天等のゲルに封入し、
その両端に電極を置いて通電すると電極間に両性
電解質に由来するPH勾配が生じる。このような両
性電解質混合物を用いて作られたPH勾配の中では
蛋白質はその等電点の位置に集束されるという原
理に基づいている。（C.W.Wringley：Methods
in Enzymology Vol.22.p559−564、Academic
Press）この方法によれば、蛋白質をその等電点
の差によつて分離、精製することができるのは勿
論のこと、ゲル中のPH勾配を測定することにより
蛋白質の等電点を求めることも可能なので、蛋白
質の分析法としても大いに利用価値がある。 しかしこの方法の欠点として、ゲル内に形成さ
れたPH勾配を測定する為に泳動終了後直らにゲル
を取り出し均一間隔でできるだけ薄い輪切りに
し、その各々のゲル中に存在する両性電解質を脱
炭酸した純水によつて抽出した後、抽出液のPHを
測定するという繁雑な操作を行なわなければなら
ない、ことがあげられる。このPH測定の方法は両
性電解質を抽出するのに時間がかかる上、ゲルを
均一に切断することが困難で正確さに欠け、更に
抽出条件によつてPHの値が変動することがあるな
ど、実用上大きな問題がある。等電点分離法にお
けるゲル内のPHの指標として両性電解質の色素を
試料と共に泳動させたり（A.Conway−Jacobs
and L.M.Lewin：Analitical Biochemistry 43巻
394−400 ｐ、（1971））、同様の目的でフエナン
スロリン、鉄複合体を用いたり（E.T.
NAKHLEH etal：Analitical Biochemistry 49巻
218−224P（1972））する方法も試みられてい
る。しかしながら、このような物質は、低分子で
ある為、拡散が急速に起こることや、等電点値の
両端の解離基の解離定数が互いに大きく離れてい
るために分離層が広がるなどの欠点を有してい
る。 本発明者らは、このようなゲル等電点分離法に
おけるPH測定の困難性を改善するために、すぐれ
た等電点マーカーを求めて研究したところ、本発
明を完成するに至つた。 本発明は、無水有機酸で処理された有色蛋白質
からなる等電点マーカー車であつて、次の各一般
式で示される等電点マーカーである。 (1) 一般式 （ただし、 Ｘは発色団、 Ｐは蛋白、 NH2は主としてリジンのε−アミノ基、 ｎは１〜18の正の整数、 ｍはｍ≦ｎの関係にある正の整数、 Ｒは有機酸、アセチル基、サクシニル基から
選択された少くとも一種を示す） からなる等電点マーカ。 (2) 上記(1)式においてＲがアセチル基である一般
式 からなる等電点マーカー。 (3) 上記(1)式においてＲがサクシニル基である一
般式 からなる等電点マーカー。 (4) 上記(1)式においてＲがアセチル基及びサクシ
ニル基である一般式 からなる等電点マーカー。 本発明等電点マーカーを製造する原料は有色蛋
白質であるが、これには種々の動植物または微生
物起源のチトクロームＣ類、ミオグロビン、ヘモ
グロビン、フラビン蛋白、銅蛋白等があげられ
る。これらの有色蛋白質の代表的な例が第１表に
示される。
【表】
これら有色蛋白質は無水有機酸を用いて処理さ
れる。無水有機酸の例としては、無水酢酸、無水
プロピオン酸、無水酪酸、無水コハク酸、無水マ
ロン酸などがあげられる。 反応は有色蛋白質の一定濃度水溶液に特定量の
無水有機酸を添加し、ゆるやかに撹拌しつつ行
う。反応が進行すると遊離の有機酸と水素イオン
が発生するのでカセイソーダ等のアルカリで中和
し、中性域で十分反応を行なわせる。反応は５〜
30分で終了するので、反応液をイオン交換体によ
つて精製することによつて、各種等電点を有する
等電点マーカーを得ることができる。 本発明の無水有機酸処理有色蛋白質からなる等
電点マーカーは、試料と共に従来公知の方法でゲ
ル等電点分離にかけることにより、ゲル内で各々
の個有の等電点の位置に有色のバンドを形成す
る。これらの有色バンドは、いちいち繁雑な測定
操作を経ることなく、１目でその位置が決定で
き、それぞれの等電点とその位置とから容易にゲ
ル内のPH勾配を決定できる。 このような等電点マーカーを用いる蛋白質の分
析は、次のようにして行なわれる。被検体蛋白質
の等電点があらかじめわかつている場合は、本発
明の等電点マーカーにより予め求めたゲル内のPH
勾配より、ただちに目的とする蛋白質の位置が決
定されるので、その部分を取り出し、必要な測定
を行なえばよい。又、等電点の不明な蛋白質の等
電点を測定するには等電点マーカーでゲル内のPH
勾配を求める一方、ゲルを取り出して発色剤によ
り発色させるか、あるいはゲルを一定の間隔にス
ライスし、各セクシヨンの蛋白質の活性を測定す
る等により蛋白質の位置を決定し、これを等電点
マーカーによつて求めたPH勾配にあてはめれば良
い。 また、同一組成のゲルを同一条件で等電点分離
する場合にはPH勾配はどのゲルにおいても同じよ
うに形成されると考えられるので、必ずしも等電
点マーカーを試料と一緒に流す必要はなく、別個
にゲルに等電点マーカーだけを別個に泳動させて
もよい。これは多数の試料を同時に測定しようと
する時などには特に便利である。 以上述べたように、本発明の等電点マーカーを
用いて蛋白質の等電点分離を行なえば、等電点の
測定が著しく簡略化される。このことは短時間に
多くの試料を処理できるという利点と共に、PH測
定中に蛋白質の変性が起こる可能性を減じ、より
正確な蛋白質の活性測定ができることにもなり、
ゲル等電点分離法の一層の普及にもつながるもの
である。 製造例 １ 馬心臓由来のチトクロームＣを2mM濃度の水
溶液とし、これに対して最終濃度2mM乃至
360mMになるように無水酢酸をそれぞれ添加し
た。2m、10mM、41mM、81mM、204mM、
360mMのそれぞれの無水酢酸添加量の反応液を
15分間室温で、ゆるやかに撹拌しつつ反応せしめ
た。反応中1N NaOHで中和しつつ中性域で反応
せしめた。 （ただしＸ−ＰはチトクロームＣを示す） 上記の反応式で反応は進行する。 一分子のチトクロームＣは18ケのリジンNH2基
を有しており、これらが無水酢酸と反応しうる。
反応では無水酢酸の濃度に応じてリジンNH2基と
の反応がはじまり、無水酢酸の濃度が360mMに
なるとリジンNH2基全部がアセチル化する。各無
水酢酸濃度によつてアセチル化の数は異なり、か
つ同一濃度によつてもアセチル化数の異なつたチ
トクロームＣの数種が得られる。 例えば2mMチトクロームＣに対し、最終濃度
2mM無水酢酸の添加ではリジンのアミノ基の１
ケがアセチル化したチトクロームＣ、２ケがアセ
チル化したチトクロームＣ、３ケがアセチル化し
たチトクロームＣがそれぞれ生成し、360mM無
水酢酸添加では６ケ、７ケ、12ケのリジンのアミ
ノ基がアセチル化した。 各反応液をイオン交換クロマトグラフイとシヨ
糖密度勾配等電点分離法によつて精製し、等電点
が3.9、4.1、4.9、5.6、6.5、8.1、9.1、9.5、10.2
である９種類のアセチルチトクロームＣを得た。 製造例 ２ 馬心臓由来のチトクロームＣを2mM濃度の水
溶液とし、これに対して最終濃度2mM乃至
360mMになるように無水コハク酸をそれぞれ添
加した。2mM、90mM、180mM、270mM、
360mMのそれぞれの無水コハク酸添加量の反応
液を15分間室温で、ゆるやかに撹拌しつつ反応さ
せしめた。反応中1N NaOHで中和しつつ、中性
域で反応せしめた。 （ただしＸ−ＰはチトクロームＣを示す） 上記の反応式で反応は進行する。 一分子のチトクロームＣは18ケのリジンNH2基
を有しており、無水コハク酸との反応では無水コ
ハク酸の濃度に応じてリジンNH2基との反応がは
じまり、無水コハク酸の濃度が360mMになると
リジンNH2基の18ケ全部がサクシニル化する。各
無水コハク酸濃度によつてサクシニル化の数は異
なり、かつ同一濃度によつても異なつた数のサク
シニル化チトクロームＣが得られる。 例えば2mMチトクロームＣに対し、最終濃度
2mMコハク酸の添加では等電点10.2，9.4のもの
が得られ、6mMコハク酸添加では等電点10.2，
9.4，7.5のものが得られ、18mMコハク酸添加で
は等電点10.2，9.4，7.5のものが得られ、30mM
コハク酸添加では等電点9.4，7.5，6.6のものが得
られ、64mMコハク酸添加では等電点9.4，7.5，
6.6，5.4のものが得られ、360mMコハク酸添加で
は等電点5.4，4.1のものが得られた。 各反応液をイオン交換クロマトグラフイとシヨ
糖密度勾配等電点分離法によつて精製し、等電点
が3.9，4.2，4.5，5.0.5.6，6.0，7.8，9.5，10.2で
ある９種類のサクシニルチトクロームＣを得た。 実施例 １ アクリルアミド1.2ｇ、Ｎ，N′−メチレンビス
アクルアミド60mg、リボフラビン0.012mg、
NNN′N′−テトラメチルエチレンジアミン0.135
ml、過硫酸アンモニウム５mg、40％Ampholine
（PH3.5−10）（スウエーデンLKB社製商品名）溶
液1.2mlを純水に溶解し24mlとした。これをフラ
スコ中で充分混合し、吸引デシケーターで脱気し
た後ガラスカラム（５×100mm）に約70mmの高さ
まで充填し、光重合を行なわせ、等電点分離用ゲ
ルを調製した。 一方、等電点マーカーとして、製造例１で得た
等電点が4.9，5.6，6.5，8.1，9.5の各アセチルチ
トクロームＣの５種の組合せを用意した。 ラツトの肝臓にEDTA、メルカプトエタノー
ル、PH7.5のトリス−塩酸緩衝液を加え、磨砕
し、105，000xgで遠心分離した上澄液14μ
（肝臓７mgに相当）を試料液とし、これに上記等
電点マーカーアセチルチトクロームＣ各20μｇを
含む溶液10μ、およびAmpholine（PH3.5−
10）の60％グリセリン溶液（Ampholine濃度４
％）24μを加え、上記ゲル上に静かに注入し、
試料層とした。試料層の上に15％グリセリン、２
％Ampholine（PH３−６）からなる保護層50μ
を重ねた。 かくして得られた試料ゲルの下端を1Mの
NaOH水溶液からなる陰極液に浸し、上端を
0.02Mのリン酸水溶液からなる陽極液に浸して定
電圧200Vで５時間通電した。通電中は冷却水に
よりカラムの温度を０〜１℃に保つた。 通電停止後、ゲルをカラムから取り出し、肉眼
で等電点マーカーの位置を検出し、一方、ゲルを
５mmに切断し、0.5mlの水でアンホラインを抽出
し、それぞれPHを測定し、各々の位置と等電点と
からPH勾配図を作成した。 その結果は第１図に示されるが、従来法による
５mmの切断によるPH勾配と本発明等電点マーカー
による肉眼観察のPH勾配がよく一致しているのが
分る。 更に、ここで５mmの間隔で14等分に輪切りにし
た各々の切片に10mM EDTAと20mMβ−メルカ
プトエタノールを含む0.1Mトリス−塩酸緩衝液
0.6mlを加えて、ホモゲナイズした。このホモゲ
ナイズ液を3000xgで15分間遠心分離し、上澄液
のパイルベート・カイネース活性を測定した。 その結果は第２図に見られるようにラツト肝臓
のパイルベート・カイネースは３つの等電点アイ
ソザイムに分離し、その各々の活性ピークを示す
位置から等電点を求めると、等電点（pI）の低い
方からそれぞれ１（pI＝4.9）、２（pI＝6.2）、３
（pI＝7.8）という値が得られた。 実施例 ２ 実施例１と全く同様に、正常ラツトと担ガンラ
ツト（ローダミン・サルコーマ移殖）のパイルベ
ート・カイネースのpIアイソザイムパターンを調
べた。測定時の切断はpIマーカーから求めたPH勾
配からPH4.9＝Ｌ型、PH6.2＝Ｌ型、pI7.8＝Ｓ型の
位置を中心に大まかに切断して測定した。 結果は第３図に示される。ＣはpIマーカーのPH
勾配、はＬ型パイルベート・カイネース、は
Ｌ型パイルベート・カイネース、はＳ型パイル
ベート カイネースの各検出量を示している。実
線は正常ラツトのもの、破線は担ガンラツトのも
のを示している。 この図から、本発明pIマーカーを使用すること
によつて担ガンラツトにおいてＳ型パイルベー
ト・カイネースが異常に増加する事実を容易に検
出することができることが明らかである。
れる。無水有機酸の例としては、無水酢酸、無水
プロピオン酸、無水酪酸、無水コハク酸、無水マ
ロン酸などがあげられる。 反応は有色蛋白質の一定濃度水溶液に特定量の
無水有機酸を添加し、ゆるやかに撹拌しつつ行
う。反応が進行すると遊離の有機酸と水素イオン
が発生するのでカセイソーダ等のアルカリで中和
し、中性域で十分反応を行なわせる。反応は５〜
30分で終了するので、反応液をイオン交換体によ
つて精製することによつて、各種等電点を有する
等電点マーカーを得ることができる。 本発明の無水有機酸処理有色蛋白質からなる等
電点マーカーは、試料と共に従来公知の方法でゲ
ル等電点分離にかけることにより、ゲル内で各々
の個有の等電点の位置に有色のバンドを形成す
る。これらの有色バンドは、いちいち繁雑な測定
操作を経ることなく、１目でその位置が決定で
き、それぞれの等電点とその位置とから容易にゲ
ル内のPH勾配を決定できる。 このような等電点マーカーを用いる蛋白質の分
析は、次のようにして行なわれる。被検体蛋白質
の等電点があらかじめわかつている場合は、本発
明の等電点マーカーにより予め求めたゲル内のPH
勾配より、ただちに目的とする蛋白質の位置が決
定されるので、その部分を取り出し、必要な測定
を行なえばよい。又、等電点の不明な蛋白質の等
電点を測定するには等電点マーカーでゲル内のPH
勾配を求める一方、ゲルを取り出して発色剤によ
り発色させるか、あるいはゲルを一定の間隔にス
ライスし、各セクシヨンの蛋白質の活性を測定す
る等により蛋白質の位置を決定し、これを等電点
マーカーによつて求めたPH勾配にあてはめれば良
い。 また、同一組成のゲルを同一条件で等電点分離
する場合にはPH勾配はどのゲルにおいても同じよ
うに形成されると考えられるので、必ずしも等電
点マーカーを試料と一緒に流す必要はなく、別個
にゲルに等電点マーカーだけを別個に泳動させて
もよい。これは多数の試料を同時に測定しようと
する時などには特に便利である。 以上述べたように、本発明の等電点マーカーを
用いて蛋白質の等電点分離を行なえば、等電点の
測定が著しく簡略化される。このことは短時間に
多くの試料を処理できるという利点と共に、PH測
定中に蛋白質の変性が起こる可能性を減じ、より
正確な蛋白質の活性測定ができることにもなり、
ゲル等電点分離法の一層の普及にもつながるもの
である。 製造例 １ 馬心臓由来のチトクロームＣを2mM濃度の水
溶液とし、これに対して最終濃度2mM乃至
360mMになるように無水酢酸をそれぞれ添加し
た。2m、10mM、41mM、81mM、204mM、
360mMのそれぞれの無水酢酸添加量の反応液を
15分間室温で、ゆるやかに撹拌しつつ反応せしめ
た。反応中1N NaOHで中和しつつ中性域で反応
せしめた。 （ただしＸ−ＰはチトクロームＣを示す） 上記の反応式で反応は進行する。 一分子のチトクロームＣは18ケのリジンNH2基
を有しており、これらが無水酢酸と反応しうる。
反応では無水酢酸の濃度に応じてリジンNH2基と
の反応がはじまり、無水酢酸の濃度が360mMに
なるとリジンNH2基全部がアセチル化する。各無
水酢酸濃度によつてアセチル化の数は異なり、か
つ同一濃度によつてもアセチル化数の異なつたチ
トクロームＣの数種が得られる。 例えば2mMチトクロームＣに対し、最終濃度
2mM無水酢酸の添加ではリジンのアミノ基の１
ケがアセチル化したチトクロームＣ、２ケがアセ
チル化したチトクロームＣ、３ケがアセチル化し
たチトクロームＣがそれぞれ生成し、360mM無
水酢酸添加では６ケ、７ケ、12ケのリジンのアミ
ノ基がアセチル化した。 各反応液をイオン交換クロマトグラフイとシヨ
糖密度勾配等電点分離法によつて精製し、等電点
が3.9、4.1、4.9、5.6、6.5、8.1、9.1、9.5、10.2
である９種類のアセチルチトクロームＣを得た。 製造例 ２ 馬心臓由来のチトクロームＣを2mM濃度の水
溶液とし、これに対して最終濃度2mM乃至
360mMになるように無水コハク酸をそれぞれ添
加した。2mM、90mM、180mM、270mM、
360mMのそれぞれの無水コハク酸添加量の反応
液を15分間室温で、ゆるやかに撹拌しつつ反応さ
せしめた。反応中1N NaOHで中和しつつ、中性
域で反応せしめた。 （ただしＸ−ＰはチトクロームＣを示す） 上記の反応式で反応は進行する。 一分子のチトクロームＣは18ケのリジンNH2基
を有しており、無水コハク酸との反応では無水コ
ハク酸の濃度に応じてリジンNH2基との反応がは
じまり、無水コハク酸の濃度が360mMになると
リジンNH2基の18ケ全部がサクシニル化する。各
無水コハク酸濃度によつてサクシニル化の数は異
なり、かつ同一濃度によつても異なつた数のサク
シニル化チトクロームＣが得られる。 例えば2mMチトクロームＣに対し、最終濃度
2mMコハク酸の添加では等電点10.2，9.4のもの
が得られ、6mMコハク酸添加では等電点10.2，
9.4，7.5のものが得られ、18mMコハク酸添加で
は等電点10.2，9.4，7.5のものが得られ、30mM
コハク酸添加では等電点9.4，7.5，6.6のものが得
られ、64mMコハク酸添加では等電点9.4，7.5，
6.6，5.4のものが得られ、360mMコハク酸添加で
は等電点5.4，4.1のものが得られた。 各反応液をイオン交換クロマトグラフイとシヨ
糖密度勾配等電点分離法によつて精製し、等電点
が3.9，4.2，4.5，5.0.5.6，6.0，7.8，9.5，10.2で
ある９種類のサクシニルチトクロームＣを得た。 実施例 １ アクリルアミド1.2ｇ、Ｎ，N′−メチレンビス
アクルアミド60mg、リボフラビン0.012mg、
NNN′N′−テトラメチルエチレンジアミン0.135
ml、過硫酸アンモニウム５mg、40％Ampholine
（PH3.5−10）（スウエーデンLKB社製商品名）溶
液1.2mlを純水に溶解し24mlとした。これをフラ
スコ中で充分混合し、吸引デシケーターで脱気し
た後ガラスカラム（５×100mm）に約70mmの高さ
まで充填し、光重合を行なわせ、等電点分離用ゲ
ルを調製した。 一方、等電点マーカーとして、製造例１で得た
等電点が4.9，5.6，6.5，8.1，9.5の各アセチルチ
トクロームＣの５種の組合せを用意した。 ラツトの肝臓にEDTA、メルカプトエタノー
ル、PH7.5のトリス−塩酸緩衝液を加え、磨砕
し、105，000xgで遠心分離した上澄液14μ
（肝臓７mgに相当）を試料液とし、これに上記等
電点マーカーアセチルチトクロームＣ各20μｇを
含む溶液10μ、およびAmpholine（PH3.5−
10）の60％グリセリン溶液（Ampholine濃度４
％）24μを加え、上記ゲル上に静かに注入し、
試料層とした。試料層の上に15％グリセリン、２
％Ampholine（PH３−６）からなる保護層50μ
を重ねた。 かくして得られた試料ゲルの下端を1Mの
NaOH水溶液からなる陰極液に浸し、上端を
0.02Mのリン酸水溶液からなる陽極液に浸して定
電圧200Vで５時間通電した。通電中は冷却水に
よりカラムの温度を０〜１℃に保つた。 通電停止後、ゲルをカラムから取り出し、肉眼
で等電点マーカーの位置を検出し、一方、ゲルを
５mmに切断し、0.5mlの水でアンホラインを抽出
し、それぞれPHを測定し、各々の位置と等電点と
からPH勾配図を作成した。 その結果は第１図に示されるが、従来法による
５mmの切断によるPH勾配と本発明等電点マーカー
による肉眼観察のPH勾配がよく一致しているのが
分る。 更に、ここで５mmの間隔で14等分に輪切りにし
た各々の切片に10mM EDTAと20mMβ−メルカ
プトエタノールを含む0.1Mトリス−塩酸緩衝液
0.6mlを加えて、ホモゲナイズした。このホモゲ
ナイズ液を3000xgで15分間遠心分離し、上澄液
のパイルベート・カイネース活性を測定した。 その結果は第２図に見られるようにラツト肝臓
のパイルベート・カイネースは３つの等電点アイ
ソザイムに分離し、その各々の活性ピークを示す
位置から等電点を求めると、等電点（pI）の低い
方からそれぞれ１（pI＝4.9）、２（pI＝6.2）、３
（pI＝7.8）という値が得られた。 実施例 ２ 実施例１と全く同様に、正常ラツトと担ガンラ
ツト（ローダミン・サルコーマ移殖）のパイルベ
ート・カイネースのpIアイソザイムパターンを調
べた。測定時の切断はpIマーカーから求めたPH勾
配からPH4.9＝Ｌ型、PH6.2＝Ｌ型、pI7.8＝Ｓ型の
位置を中心に大まかに切断して測定した。 結果は第３図に示される。ＣはpIマーカーのPH
勾配、はＬ型パイルベート・カイネース、は
Ｌ型パイルベート・カイネース、はＳ型パイル
ベート カイネースの各検出量を示している。実
線は正常ラツトのもの、破線は担ガンラツトのも
のを示している。 この図から、本発明pIマーカーを使用すること
によつて担ガンラツトにおいてＳ型パイルベー
ト・カイネースが異常に増加する事実を容易に検
出することができることが明らかである。
第１図は、実施例１における従来法による５mm
切断によるPH勾配と本発明等電点マーカーによる
肉眼観察によるPH勾配の比較図である。ａ……pI
マーカーのPH勾配、〇は従来法のPH測定点、×は
本発明等電点マーカーのPH測定点。 第２図は、実施例１における、本発明pIマーカ
ーとパイルベート・カイネースのアイソザイム分
離の比較を示す図である。ｂ……pIマーカーのPH
勾配、Ｉ……Ｌ型パイルベート・カイネース、
……Ｌ型パイルベート・カイネース、……Ｓ型
パイルベート・カイネースを示す。 第３図は本発明pIマーカーを用いて、正常ラツ
トと担ガンラツトのパイルベート・カイネースの
pIアイソザイムパターンを示す図である。Ｃ……
pIマーカーのPH勾配、……Ｌ型パイルベート・
カイネース、……Ｌ型パイルベート、カイネー
ス、……Ｓ型パイルベート・カイネース、実線
は正常ラツト、破線は担ガンラツトを示す。
切断によるPH勾配と本発明等電点マーカーによる
肉眼観察によるPH勾配の比較図である。ａ……pI
マーカーのPH勾配、〇は従来法のPH測定点、×は
本発明等電点マーカーのPH測定点。 第２図は、実施例１における、本発明pIマーカ
ーとパイルベート・カイネースのアイソザイム分
離の比較を示す図である。ｂ……pIマーカーのPH
勾配、Ｉ……Ｌ型パイルベート・カイネース、
……Ｌ型パイルベート・カイネース、……Ｓ型
パイルベート・カイネースを示す。 第３図は本発明pIマーカーを用いて、正常ラツ
トと担ガンラツトのパイルベート・カイネースの
pIアイソザイムパターンを示す図である。Ｃ……
pIマーカーのPH勾配、……Ｌ型パイルベート・
カイネース、……Ｌ型パイルベート、カイネー
ス、……Ｓ型パイルベート・カイネース、実線
は正常ラツト、破線は担ガンラツトを示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 一般式 （ただし、 Ｘは発色団、 Ｐは蛋白、 NH2は主としてリジンのε−アミノ基、 ｎは１〜18の正の整数、 ｍはｍ≦ｎの関係にある正の整数、 Ｒは有機酸、アセチル基、サクシニル基から 選択された少くとも一種を示す。） からなる等電点マーカー。 ２ 特許請求の範囲第１項(1)式においてＲがアセ
チル基である 一般式 からなる等電点マーカー。 ３ 特許請求の範囲第１項(1)式においてＲがサク
シニル基である 一般式 からなる等電点マーカー。 ４ 特許請求の範囲第１項(1)式においてＲがアセ
チル基及びサクシニル基である 一般式 からなる等電点マーカー。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6435778A JPS54156385A (en) | 1978-05-31 | 1978-05-31 | Isoelectric point marker |
| SE7904225A SE439379B (sv) | 1978-05-31 | 1979-05-15 | Isoelektrisk punktmarkor |
| US06/217,917 US4356072A (en) | 1978-05-31 | 1980-12-18 | Isoelectric point marker |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6435778A JPS54156385A (en) | 1978-05-31 | 1978-05-31 | Isoelectric point marker |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS54156385A JPS54156385A (en) | 1979-12-10 |
| JPS6138412B2 true JPS6138412B2 (ja) | 1986-08-29 |
Family
ID=13255910
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6435778A Granted JPS54156385A (en) | 1978-05-31 | 1978-05-31 | Isoelectric point marker |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4356072A (ja) |
| JP (1) | JPS54156385A (ja) |
| SE (1) | SE439379B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63197821A (ja) * | 1987-02-13 | 1988-08-16 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 調理器 |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4507233A (en) * | 1981-04-22 | 1985-03-26 | Oriental Yeast Co., Ltd. | Colored molecular weight marker |
| US4666855A (en) * | 1985-07-31 | 1987-05-19 | Massachusetts Institute Of Technology | Rapid method for determining the isoelectric point for amphoteric molecules |
| WO1994012691A1 (en) * | 1992-12-02 | 1994-06-09 | Labintelligence, Inc. | USE OF FLUORESCENT pH-MARKERS IN MOVING BOUNDARY GEL ELECTROPHORESIS SYSTEMS |
| JP2828426B2 (ja) * | 1995-03-31 | 1998-11-25 | 株式会社分子バイオホトニクス研究所 | 蛍光検出等電点電気泳動用マーカー |
| DE19729248C1 (de) * | 1997-07-09 | 1998-07-09 | Jochen Uhlenkueken | Standardprotein |
| GB0714202D0 (en) * | 2007-07-20 | 2007-08-29 | Ge Healthcare Bio Sciences Ab | Isoelectric point markers |
| JP5387118B2 (ja) | 2008-06-10 | 2014-01-15 | 東ソー株式会社 | 円筒形スパッタリングターゲット及びその製造方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1284409A (en) * | 1968-12-31 | 1972-08-09 | Unilever Ltd | Oil emulsions containing acylated protein emulsifiers |
| US3764711A (en) * | 1971-03-29 | 1973-10-09 | Carnation Co | Acylated protein for coffee whitener formulations |
| JPS5292590A (en) * | 1976-01-30 | 1977-08-04 | Oriental Yeast Co Ltd | Isoelectric point marker for separation of isoelectric points of gel |
-
1978
- 1978-05-31 JP JP6435778A patent/JPS54156385A/ja active Granted
-
1979
- 1979-05-15 SE SE7904225A patent/SE439379B/sv not_active IP Right Cessation
-
1980
- 1980-12-18 US US06/217,917 patent/US4356072A/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63197821A (ja) * | 1987-02-13 | 1988-08-16 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 調理器 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4356072A (en) | 1982-10-26 |
| SE7904225L (sv) | 1979-12-01 |
| JPS54156385A (en) | 1979-12-10 |
| SE439379B (sv) | 1985-06-10 |
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