SE439379B - Isoelektrisk punktmarkor - Google Patents

Description

7904225-5 10 15 20 25 30 2 jämna intervaller, extraktion av den amfotera elektro- -lyten som finns i respektive gelskiva med användning av dekarboxylerat rent vatten och därpå mätning av pH- värdet i respektive extrakt. Denna metod för pH-mätning medföremellertidsådanasvårighetervidpraktiskanvändning sonlattzdet tar längre tid att extrahera den amfotera elektro1yten dålig noggrannhet och därtill kan pH-värdena fluktuera beroende på extraktionsbetingelserna. Hittills har olika vägar prövats, såsom en metod vid vilken, för isoelektrisk separation,med hänsyn till amfotera elektrolyters färgäm- ne,genomutnyttjandet av detta som pH-indikator, elektro- fores utföres tillsammans med ett prov (A. Conway-Jacobs och L.M. 400, 1971), och en metod vid vilken,för samman ändamål, Lewin : Analytical Biochemistry vol 43, p-394- fenantrolin samt järnkomplex användes (E}T. NAKHLEH et al: Analytical Biochemistry vol 49, p 218-224, 1972). Dessa substanser har emellertid nackdelar såsom att beroende på att dessa substanser är föreningar med låg molekylvikt så sker det snabb diffusion och även beroende på att dis- sociationskonstanterna för dissociationsgrupper vid båda ändar av isoelektrisktpunktvärde är långt från varandra, varför separationsskiktet breder ut sig.

Man har nu forskat för att finna en överlägsen iso- elektrisk punktmarkör, dvs ett material som markerar isoelektrisk punkt,. för att minska svårigheterna som är förknippade med pH~mätning i en sådan gel-isoelektrisk separation, vilket resulterade i fullbordandet av före- liggande uppfinning, Föreliggande uppfinning avser en isoelektrisk punkt- markör,vilken består av kromoprotein som behandlats med organisk syraanhydrid och vilken har följande allmänna formel, som valts ur den grupp som består av 10 15 20 -25 7904225-'5 x _ P _ (NH'CO“CH3)m X - P - (NH2)n-m (NH-CO-CH2-CH2-COOH)m /(fiH2)n-m'-mt X - P v (NH-CO-CH3)m' \ (NH-CO-CH2-CH2-COOH)m" där X är cytokrom C, P är protein, NH är aminogrupp som huvudsakligen härstammar 2 från lysin, n är ett positivt heltal av l-18 och m är ett positivt heltal med relationen mån.

(Förklaring av ritningar) Fig l är ett diagram för jämförelse av pH-gradient av 5 mm skiva enligt den tidigare kända metoden och -pH-gradient genom visuell observation enligt den iso- 30 35 elektriska punktmarkören i enlighet med exempel 3 av föreliggande uppfinning, varvid a visar pH~gradienten av pI markör,() visar pH-mätningspunkten av den tidigare kända tekniken och X visar pH-mätningspunkten av den isoelektriska punktmarkören enligt föreliggande upp- finning. Fig 2 är ett diagram som visar separationen av pI-markören enligt föreliggande uppfinning i utförings- exempelElochisoenzymseparationenav pyruvatkinas, var- vid b visar pflfigradienten av pI~markör, I visar L~typ 19o4225åš 10 4 pyruvatkinas, II visar Lëtyp pyruvatkinas och III visar S-typ_pyruvatkinas. Fig 3 är ett diagram som visar pI isoenzymmönster av pyruvatkinasfrånnormalråttaochtumör- bärande råttlever med användning av pI-markören enligt föreliggande uppfinning, varvid C visar pH-gradient av PI-markör, IV visar L-typ pyruvatkinas, V visar L-typ pyruvatkinas, VI visar S-typ pyruvatkinas, heldragen linje visar normal råtta och streckad linje visar tumör- öärande råtta.

Ett råmaterial för framställning av den isoelek- triska punktmarkören enligt föreliggande uppfinning är en kromoprotein, nämligen cytokrom C, som härstammar från olika djur och grönsaker eller mikroorganismer.

-Tabell l visar representativa exempel på dessa kromoproteiner, ' .. nu b 10 15 20 ,25 7904225-5 5 TABELL l Slag, typ av protein Ursprung Isoelektrisk punkt vid O-2°C Cytokrom c av Häst 10,6 oxiderad typ Cytokrom cz av Rhodopseudomonas 10,0 reducerad typ palustris Cytokrom G2 av reducerad typ Rhodospirillum 6,2 rubrum Cytokrom cz av Rhodopseudomonas 5,8 reducerad typ spheroides Cytokrom c' av Rhodospirillum 5,6 oxiderad typ rubrum Cytokrom c' av Rhodopseudomonas 5,0 oxiderad typ spheroides Cytokrom c-551 Pseudomonas 4,7 av oxidarad typ aeruginosa "fšš cm Qxsfixzifi 790422š-5 6D .Dessa kromoproteiner behandlas med användning av organisk syraanhydrid. Exempel pà organisk syraan- hydrid är ättiksyraanhydrid, bärnstenssyraanhydrid etc. 5 .Reaktionen initieras av tillsättning av en viss mängd organisk syraanhydrid till en vattenhaltig lös- * ning av en viss koncentration av kromoproteinet och varsam omröring av lösningen. Allt eftersom reaktionen fortskrider utvecklas fri organisk syra och vätejoner 10 och därför neutraliseras lösningen med ett alka1i,såsom natriumhydroxid osv, och sålunda utföres reaktionen under tämligen neutrala betingelser. Efter det att reak- tionen fullbordats efter 5 till 30 min,renas lösningen, 'som erhållits från den ovan erhållna reaktion,medelst 15 en jonbytare, varigenom isoelektriska punktmarkörer [ med olika isoelektriska punkter erhålles. _ Den isoelektriska punktmarkören,som består av ett med organisk syraanhydrid behandlat kromoprotein enligt föreliggande uppfinning,bildar ett färgat band vid 20 var och en av de specifika isoelektriska punktposi- ' tionerna i gelen,när den underkastas en gel-isoelektrisk separation tillsammans med ett prov i enlighet med en tidigare känd metod. Dessa färgade bands positioner kan bestämmas visuellt utan att man utför komplicerade 25 operationer och sålunda är det möjligt att lätt bestämma en pH-gradient i gel från både ifrågavarande isoelek- -triska punkt och dess position.

Analysen av protein med användning av en sådan isoelektrisk_punktmarkör utföres på följande sätt. I 30 det fall när ett testproteins isoelektriska punkt är känd kan det avsedda proteinets position omedelbart bestämmas från pH-gradienten i gelen, vilken tidigare er- hållits med användning av en isoelektrisk punktmarkör _ enligt föreliggande uppfinning, och därför uttages en 35 andel av positionen och en nödvändig mätning utföres på nämnda andel. Även i fråga om mätning av ett proteins isoelektriska punkt, varvid .den isoelektriska punkten är okänd, 10 15 2Q 25 30 35 7904225-5 7 erhålles en pH-gradient av gel genom användning av en isoelektrisk punktmarkör, och å andra sidan uttages W gelen och en färg bildas med användning en färgalstrare eller gelen skärs i skivor vid vissa intervaller och aktiviteten av protein i varje utskuren sektion mätes osv, varigenom proteinets position bestämmes, och sålunda bestämd position tillämpas på pH-gradienten som erhållits medenisoelektrisk punktmarkör. Även i det fall när geler med samma sammansättning underkastas isoelektrisk separation under samma betingelser, eftersom man anser att pH-gradienten alstras på samma sätt i alla gelerna, är det inte alltid nödvändigt att flöda den isoelektriska punktmarkören tillsammans med ett prov, och det kan även till- låtasattendastdenisoelektriskapunktmarkörenseparat får iunderkastas elektrofores i en identisk gel. Detta är sär- skilt lämpligt när ett antal prover önskas bli mätta samtidigt.

Sammanfattningsvis kan sägas att om den isoelek- triska separationen av protein utföres med användning av den isoelektriska punktmarkören enligt föreliggande uppfinning förenklas mätningen av den isoelektriska punkten avsevärt. Detta leder till den fördelen att många prover kan behandlas under en kort tidsperiod och att den eventuellt uppträdande denatureringen av protein under pil-mätningen minskar så att proteinakti- viteten kan mätas med större noggrannhet, vilket leder till ytterligare spridning av gel-isoelektrisk separa- tionsteknik till flera områden.

*Utföringsexempel l En 2mM vattenhaltig lösning av cytokrom c, som här- stammar från ett hästhjärta,framställdes,och till den sålunda erhållna lösningen sattes ättiksyraanhydrid så att dess slutliga koncentration var från 2mM till 360mM.

Varje reaktionsmedium som innehöll 2mM, lOmM, 4lmM, 8lmM,~ 204mM och 360 mM ättiksyraanhydrid fick separat reagera vid rumstemperatur i 15 min under sakta omröring. Reak- tionerna utfördes under neutrala betingelser, ty medi- erna neutraliserades med ln NaOH under reaktionen. p 'POOR QUALIW 10 15 20 25 30 35 7904225f5 CH3C x - P - NH2 + o-ë>R-NH~co-cH3 icH3c /\/\ O +cH3cooH+H+ i vilken X-P betecknar cytokrom c.

Reaktionen fortskrider enligt ovan beskrivna schema.

:En molekyl cytokrom c har 18 lysin NH2-grupper som kan reagera med ättiksyraanhydrid. I reaktionen initi- eras reaktionen med lysin NH2-grupper i enlighet med ättiksyraanhydridens koncentration, och när ättiksyra anhydridens koncentration blir 360 mM, är alla lysin NH2-grupper acetylerade; Acetyleringstalet skiljer sig i enlighet med varje koncentration av ättiksyraanhydrid, och även vid användning av identiska koncentrationer kan flera typer av cytokrom c med olika acetylerings- tal erhållas. _ _ Exempelvis i det fall när man använde 2mM cyto- krom c och tillsatte ättiksyraanhydrid med en slutlig koncentration av 2mM alstrades cytokrom c .där en av aminogrupperna från lysin hade acetylerats, cyto- krom c .där 2 aminogrufiper från lysin hade acetyle- rats och cytokrom c där_3 aminogrupper från lysin hade acetylerats, och i det fall när man tillsatte ,360mM ättiksyraanhydrid hade 6, 7 resp 12 aminogrupper *av lysin acetylerats.

Varje reaktionsmedium renades genom jonbytar- kromatografi och sackarosdensitetsgradient-isoelek- trisk separation, och därigenom erhölls 9 typer av acetylerad cytokrom c som hade respektive isoelektrisk punkt av 3,9; 4,1; 4,9; 5,6; 6,5; 8,1; 9,1; 9,5 och 10,2.

Utföringsexemgel 2 En 2mM vattenhaltig lösning av cytokrom c,som här- stammade från ett hästhjärta,framställdes, och till den sålunda erhållna lösningen sattes bärnstenssyraanhydrid sä att dess slutliga koncentration var 2mM till 360mM.

Jo» n. .__> i io 15 20 25 30 35 57904225-5 9 Varje reaktionsmedium innehöll 2mM, 90mM, l80lW,' 270mM och 360mM bärnstenssyraanhydrid och fick separat reagera vid rumstemperatur i 15 min under sakta omröring.

Reaktionerna utfördes under neutrala betingelser,ty medierna neutraliserades med ln NaOH under reaktionen. 0 CH -Cøáá X ~ P - N82 + O -èR-NH-CO-CHZ HOOC- H2 0 + H+ (i vilken X-P betecknar cytokrom c.) Reaktionen fortskred i enlighet med ovan angivna schema. I En molekyl cytokrom c har 18 lysin NH2-grupper och i reaktionen med bärnstenssyraanhydrid initieras reak- tionen med lysin NH2-grupper i enlighet med bärnstens- syraanhydridens koncentration, och när bärnstenssyra- anhydridkoncentrationen blir 360 mM är alla 18 lysin NH2-grupper fullständigt succinylerade. Succinylerings- talet skiljer sig enligt varje koncentration av bärn- stenssyraanhydrid,och även vid användning av en identisk »koncentration kan flera typer av succinylerad cytokrom c med olika succinyleringstal erhållas.

Exempelvis i det fall när man till 2mM cytokrom c satte bärnstenssyraanhydrid till en slutlig koncentration av 2mM erhölls sådana med isoelektrisk punkt av 10,2 resp 9,4, och i det fall när man tillsatte 6mM bärnstenssyra- anhydrid erhölls sådana med isoelektrisk punkt av 10,2, 9,4 resp 7,5, och i det fall när man tillsatte 18 mM bärnstenssyraanhydrid erhölls sådana med isoelektrisk punkt av 10,2, 9,4 resp 7,5, och i det fall när man till- satte 30mM bärnstenssyraanhydrid erhölls sådana med iso- elektrisk punkt av 9,4, 7,5 resp 6,6, och i det fall när man tillsatte 64mM bärnstenssyraanhydrid erhölls sådana med isoelektrisk punkt av 9,4, 7,5, 6,6 resp 5,4,och i det fall när man tillsatte 360mM bärnstenssyraanhydrid §w«~~ man Onani-filip 10 15 20 25 30 35 7904225-5 10 erhölls sådana med isoelektrisk punkt av 5,4 resp .4,l.

Varje reaktionsmedium renades genom jonbytarkromato- grafi och sackarosdensitetsgradient-isoelektrisk sepa- ration och därigenom erhölls nio typer av succininyl cytokrom c som hade respektive isoelektrisk punkt av 3,9, 4,2, 4,5, 5,0, 5,6, 6,0, 7,8, 9,5 och 10,2.

Exempel 3 1,2 g akrylamid, 60 mg N,N'-metylenbisakrylamid, 0,012 mg riboflavin, 0,135 ml N,N,N',N'-tetrametyletylen- diamin, 5 mg ammoniumpersulfat och 1,2 ml 40 % Ampholine (pH 3,5-10) (handelsnamn, tillverkat av LKB Co., Sverige) löstes i rent vatten och bringades till 24 ml. Denna lös- ning sammanblandades tillräckligt i en kolv och efter avluftning därav i en vakuumexsickator satsades den i en glaskolonn (5 x 100 mm) upp till ca 70 mm och foto- polymerisation utfördes, och sålunda framställdes gelen för isoelektrisk separation.

Som isoelektriska punktmarkörer tillhandahölls 5 typer av kombinationer av varje acetylerad cytokrom c 5,6, 6,5, 8,1 och 9,5 som erhållits genom utföringsexempel 1. 5 EDTA, merkaptoetylalkohol och Tris-HCl-buffert av pH 7,5 sattes till en råttlever och blandningen maldes samt centrifugerades vid 105 000 x g,varigenom en över- med isoelektriska punkter av 4,9, 'liggande vätska erhölls. 14 pl av nämnda överliggande vätska (som motsvarade 7 mg av levern) användes som ett prov, till vilket sattes 10 pl av lösning som var och en innehöll 20 pg av varje nämnd isoelektrisk punktmarkör-acetylerad cytokrom“c och 24 pl av 60 % qlyCerinlÖSning (Ampholinekoncentration 4 %)avëmpholine (pH 3,5-10), och den resulterande blandningen hälldes' försiktigt på nämnda gel,varigenom ett provskikt bildades. På detta provskikt lades 50 pl av ett skydds- skikt som bestod av 15 % glycerin och 2 % Ampholine (pH 3-6) . ' Den lägre änden av den sålunda erhållna provgelen neddoppades i en katolyt som bestod av l M NaOH vatten- haltig lösning, och den övre änden därav doppades i en 10 15 20 25 30 35 7904225-5 'll anolyt som bestod av 0,02M fosforsyra-vattenlösning, och elektricitet matades mellan den lägre och den övre änden vid en konstant spänning av 200 V under 5 h.

Under strömmatningen hölls kolonnens temperatur vid en temperatur av O-l°C medelst kylvatten.

Efter det matningen av elektricitet avslutats togs gelen ut ur kolonnen och den isoelektriska punkt- markörens position bestämdes med blotta ögat, varefter gelen styckades för_att erhålla en 5 mm bred skiva och Ampholine extraherades med användning av 0,5 ml vatten, varpå respektive pH-värde utmättes och ett pH-gradientdiagram uppgjordes från varje nämnda posi- tion och isoelektrisk punkt.

Resultaten härav visas i fig l, varur det fram- går att en pH-gradient som bildats med användning av en tidigare känd metod med 5 mm skiva och en pH-gradient som bildats genom visuell observation med användning av den isoelektriska punktmarkören enligt föreliggande uppfinning överensstämmer väl.

Därtill sattes till varje stycke,som utskurits till likadana 14 stycken vid intervaller av 5 mm, 0,6 ml av 0,lM Tris-HCl-buffert,som innehöll lOmM EDTA och 20mM S-merkaptoetylalkohol,varefter man homogenise- rade. Den homogeniserade vätskan centrifugerades vid 3000 x g under 15 min, och den resulterande överliggande vätskans pyruvatkinas-aktivitet uppmättes.

Såsom visas i fig 2,som visar resultatet, separe- rades råttleverpyruvatkinasen i 3 isoelektriska punkt- isoenzymer och de isoelektriska punkterna erhölls från positioner som uppvisar varje aktiv topp, med resul- tatet att respektive värde av l (pI=4,9), 2 (pI=6,2) och 3 (pI=7,81, placerade i ordning från den lägre änden, erhölls.

Exempel 4 Helt lika som i exempel 3 undersöktes pI-isoenzym- mönster av pyruvatkinasznrnormal råtta och tumörbärande råtta (inokulerad med Rhodamine-sarcoma). Skärningen vid tidpunkten för mätning utfördes grovt centrerat kring POOR QUÄLITÉ? g79o4225-sg - 12 positionerna pH 4,9=L-typ, pH 6,2=L-typ, pI 7,8=S-typ 'enligt pH-gradienten som erhållits från pI-markören, e_och sålunda utfördes mätningen._ 10 Resultaten visas í fig 3, där C anger pH-gradient _ av pï-markör, IV anger den påvisade mängden av L~typ pyruvatkinas, V anger den. av L-typ pyruvatkinas och .VI anger den av S-typ pyruvatkinas. De heldragna lin- jerna visar de av normal råtta och de streckade lin- jerna visar de av tumörbärande råtta.

Från denna figur framgår det att med användning av pI-markören enligt föreliggande uppfinning är det möjligt att lätt upptäcka det faktum att ifråga om den tumör- bärande råttan så ökar S-typ pyruvatkinas abnormt.

Claims (1)

1. 7904225-5 13 PATENTRRAV' Isoelektrisk punktmarkör, k ä n n e t e c~k n a d därav, att den är en förening med en allmän formel som valts ur den grupp som består av X - P - (NH2)n-m (NH-CO-CH3)m, X ~ P - (NH2)n~m (NH-CO~CH2-CH.-COOH)m och 2 (NH2)n-m'-m" X - P - (NH-CO-CH3)m' \(NH-co~cH2-c1a2~coon>m" där X är cytokrom c, P är protein, NH2 är -aminogrupp som huvudsakligen härstammar från lysin, n är ett positivt heltal av l-18 och m är ett positivt heltal med relationen m§n. 'fñæmflzswfaaiiff