JPS61290361A - 分析方法および試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の要約 改良分析方法および試薬につき開示する。

本発明による分析は高められた温度で行なわれるが、そ
の結果これら温度で使用される試薬の安定性を増大させ
る必要が生ずる。標識した結合体は、例えばグリセリン
のようなポリヒドロキシ化合物により安定化される。支
持体−リガンド複合体は、ポリアルキレングリコールと
の接触により安定化される。更にこの分析は、比較的親
水性かつ略中性１）　Ｉ（の表面活性剤の存在下で促進
される。

発明の屈する技術分野 本発明は、特に酵素を標識として使用する免疫分析に有
用な改良試薬および技術に関するものである。

従来技術とその問題点 ヒト血清または動物血清に存在する抗体を検出し、ある
いは抗原を検出するのに使用する免疫分析は、一般に放
射線免疫分析（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸収（ＥＬ
ＩＳＡ）技術を使用する。

一般に、これらの技術は２例えば核蛋白質（ウィルス蛋
白質）もしくは純粋蛋白質のようなリガンドとして知ら
れた所定の抗原を使用し、この抗原は例えば重合体マト
リックスまたはガラス玉のような支持体に結合される。

一般に９６穴の微小定量用のポリスチレン皿が使用され
る。抗原は支持体の表面に吸着され、かつ抗原−支持体
の複合体を試験すべき血清の試料またはその他の試料と
接触させる。あるいは、抗体を支持体に結合させること
もできる。

次いで、支持体を洗浄して過剰の血清を除去し、次いで
酵素標識した抗体（ＥＬＩＳＡ）または放射線標識した
結合体（ＲＩ　Ａ）と接触させて、抗原（抗体）／支持
体の複合体に結合した任意の抗体（もしくは抗原）との
複合体を形成する。適する培養時間の後、この系を支持
体に結合した標識結合体の存在につき分析する。一般に
、ＥＬＩＳＡ法は米国特許第３，６５４，０９０号公報
に記載されている。

上記免疫分析技術は過去数年間に亘り、比較的充分に開
発されているが、多くの点においてこれらの免疫分析法
はまだ最適化されていない。

種々異なる多くの抗原に対する分析は、低温度または室
温にて行なわれる。明らかに、低温において分析を行な
うことは、全試薬を同温度に保つ必要性が生じ、かつ冷
室などに空間を設けねばならないため不便である。室温
にて分析を行なえば比較的便利であるが、これは室温が
変化するので誤差の原因となり得る。しかしながら本発
明者等は、分析を均一温度で行なう必要があるだけでな
く、分析を最適速度で進行させるように高められた温度
で行なうべきであると信する。

発明の目的 従って、本発明の目的は、高温度においても高度の安定
性を有する免疫分析技術に有用な安定化試薬を提供する
ことである。

発明の要点 本発明の一形態において、約３５〜４８℃の範囲より、
好ましくは４０〜４５℃の範囲の温度にて行なうことを
更に含有する分析方法が提供される。

これら範囲の温度において、分析手順は一般に最適化さ
れ、かつ培養時間も相当に短縮されてより経済的な分析
法をもたらす。

分析手順に対する高められた温度の使用は、この分析に
使用する試薬につき、ある種の変更を必要とする。例え
ば、抗原−支持体複合体を作成するため、種々異なる多
くの抗原を使用することができる。しかしながらこれら
の複合体は、長時間に亘り活性を保持するには凍結を必
要とすることが常に考慮される。更にやや高温度におい
て、複合体は不安定となる危険も存在する。

更に、標識された酵素結合体がしばしば市販されている
が、これらの結合体は一般に室温にて不安定であり、か
つその活性を長時間に亘り保持するには約４℃の温度に
おける貯蔵を必要とし、特に日常の分析には最終の希釈
を必要とすると思われる。

本発明の一形態において、標識された酵素結合体は約１
０個までの炭素原子を有するポリヒドロキシ化合物の少
なくとも１０ｖ／ｖ％の存在下で安定化される。好まし
くは安定化用化合物はグリセリンである。標識結合体は
、抗体もしくは抗原と結合した酵素から構成することが
できる。この結合体を必要量のポリヒドロキシ化合物で
溶液中に希釈することができる。あるいはポリヒドロキ
シ化合物を含有する溶液を使用して、凍結乾燥された結
合体を再編成することもできる。

本発明の好適具体例においては、約４　ｗ／ｖ％までの
ポリエチレングリコールまたはその他のポリアルキレン
グリコールを結合体溶液へ添加する。

本発明の他の形態においては５例えば高分子材料または
ガラス材料のような固体支持体に結合された酵素−免疫
分析法に有用なリガンドの製造方法が提供され、この方
法は： （ｉ）　リガンドを固体材料の存在下で、リガンドと支
持体との間に顕著な結合を生ぜしぬるのに充分な時間に
亘り培養し、かつ （ｉｉ）工程（ｉ）の生成物を０．０１〜５　ｗ／ｖ％
の濃度でポリアルキレングリコールを含有する溶液によ
り洗浄する 工程からなっている。

この方法により製造される支持体−リガンド複合体はキ
ュベツト、スライド、微小測定板または試験管に対する
被覆として供給することができ、あるいは例えば、ポリ
スチレンもしくはガラスのようなビーズの形態とするこ
ともできる。上記方法により製造された後、これを長期
貯蔵条件の下で室温にて顕著な活性の損失なしに貯蔵す
ることができる。使用する場合、この複合体は乾燥型で
あれば略中性ｐＨの緩衝液中で水和させ、次いで試験す
べき血清と接触させる。好ましくはリガンドは抗原であ
る。

更に、ポリアルキレングリコールかりガント−支持体複
合体を安定化させる能力の他に、この種の化合物は高温
度における分析にて蛋白質−蛋白質の結合を安定化させ
る傾向を示すことも見い出された。従って、本発明の他
に形態において、例えばポリエチレングリコールのよう
なポリアルキレングリコールの存在下で行なうことを更
に含有する分析方法が提供される。好ましくはポリエチ
レングリコールの濃度は、０，０１〜５　ｗ／ｖ％の範
囲である。

特に、試験すべき試料を支持体−リガンド複合体と一緒
に培養する第１培養工程と酵素標識した結合体を結合試
料と一緒に培養する第２培養工程とは、少なくとも０．
０１ｗ／ｖ％のポリアルキレングリコール（例えば６，
０００〜８，０００の分子量を有するポリエチレングリ
コール）の存在下で行なわれる。

更に本発明者等は、分析の培養時間を高温度で分析を行
なうことにより短縮し得るだけでなく、免疫化学反応を
少なくとも約２０のＨＬＢ比を有する比較的親水性の略
中性ｐＨの表面活性剤の存在下で促進させ得ることを突
き止めた。好適な表面活性剤は、アルキルベンゼンスル
ホン酸化合物、好ましくはラウリルもしくはドデシルベ
ンゼンスルホン酸のアンモニウムもしくはナトリウム塩
である。

従って本発明の他の形態においては、免疫化学反応に基
づく分析方法が提供され、この方法は免疫化学反応を少
なくとも２０のＨＬＢ比を有する比較的親水性かつ略中
性ＰＨの表面活性剤の存在下で行なうことを更に含有す
る。好ましくは、表面活性剤は、０．００５〜１ｖ／ｖ
％より好ましくは約０．０４ｖ／ｖ％の量で存在させる
。

本発明の好適形態においては、液体の試料における所定
の抗体種類の存在を検出する改良分析方法が提供され、
この方法は： （１）抗体種類との複合体を形成する抗原で被覆された
支持体を供給し； （２）この被覆された支持体を体液の試料と一緒に培養
して、複合体を抗原と抗体との間で生成させ：（３）こ
の被覆支持体を複合体の破壊なしに洗浄し；（４）前記
抗体−抗原複合体を標識免疫蛋白質（結合体）と−緒に
培養して、抗原−抗体標識された免疫蛋白質複合体を生
成させ７ （５）この被覆された支持体を洗浄して過剰の標識免疫
蛋白質を除去し； （６）前記抗原−抗体−標識免疫蛋白質複合体の存在を
定量的または定性的に測定する 工程からなり、前記工程（２）および／または（４）並
びに必要に応じ工程（６）を０．１〜５　ｔｌ／ｖ％の
ポリアルキレングリコールおよび少なくとも０．０５ｗ
／ｖ％の少なくとも２０のＨＬＢ比を有する比較的親水
性かつ略中性ｐＨの表面活性剤の存在下で行なうことを
更に含有する。好ましくは、ポリアルキレングリコール
は６，０００〜８，０００の分子量を有するポリエチレ
ングリコールである。好ましくは、表面活性剤は、アル
キルベンゼンスルホン酸のナトリウム塩またはアンモニ
ウム塩である。

リガンド−支持体の複合体を製造する方法の好適具体例
においては、例えばガラス玉またはボリスチレン、ポリ
塩化ビニルもしくはポリカーボネートのマトリックスの
ような支持体材料を所要の抗原と一緒にｐＨ５〜１０の
緩衝溶液中で培養する。

好ましくは、この緩衝液は、例えばトリス−ＨＣＱまた
は重炭酸緩衝液のような非燐酸基含有の緩衝剤である。

抗原が核蛋白質である場合、好適ｐＨは約９．６である
が、抗原を比較的純粋な蛋白質とする場合、ｐＨはそれ
より僅かに低くかつ特に好ましくは８〜９の範囲である
。好ましくは、抗原を支持体材料と一緒に約３時間に亘
り約３７℃で培養する。

次いで、支持体を洗浄して未結合の抗原を除去する。洗
浄後、この抗原が結合された支持体をポリアルキレング
リコール、好ましくはポリエチレングリコールと接触さ
せて固定する。好ましくは、疎水性の表面活性剤を使用
して支持体を洗浄する。

ポリエチレングリコールは、アミノ基を含有せずかつ約
７のｐＨを有する、例えば燐酸塩緩衝液のような緩衝液
に希釈する。ポリエチレングリコールは約６，０００〜
８，０００の分子量を有する。ポリエチレングリコール
の濃度は０．０１〜５ν／Ｖ％の範囲であり、特に好ま
しくは、約０．１５ｗ／ｖ％の濃度である。表面活性剤
は、例えばツイーン、トリトン等の略中性ｐＨを有する
表面活性剤または同様なＨＬＢ値を有する表面活性剤で
ある。ツイーン２０のＨＬＢ値は１．６．７７−あり、
トリトンｘ−１００のそれは１３．５である。表面活性
剤の濃度は、約０．００５〜ＩＶ／Ｖ％である。好まし
くはツイーンを使用する場合、濃度は０．０５ｗ／ｖ％
である。好ましくは溶液は更に約１重量％までの量のグ
リセリンを含有するが、このグリセリン成分は必須でな
い。

蛋白質−蛋白質または免疫蛋白質−蛋白質の複合体につ
いて説明すれば、これは抗原と反応した免疫グロブリン
分子に結合させるためにＲＩＡもしくはＥＬＩＳＡ技術
で使用される。使用される免疫蛋白質または抗血清は、
例えば抗ヒトもしくは抗動物免疫グロブリン、例えばＩ
ｇＧ、ＩｇＭもしくはＩｇＡの種類であり、あるいは例
えばチロキシン、コルチコステロンおよびインシュリン
のような生物学上活性な物質に対する抗体である。これ
らを分析目的の標識として作用する蛋白質と結合させる
。例えば好適な蛋白質標識は、アルカリホスファターゼ
、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ
またはβ−グルコシダーゼの如き酵素である。あるいは
工１２５−標識されたチロキシンまたはその他の放射線
標識された蛋白質も使用することができる。

免疫蛋白質もしくは蛋白質を、例えば酵素のような蛋白
質標識と所定割合で混合し、これをｐＨ６〜８の緩衝溶
液中で培養する。好ましくは、抗血清および蛋白質標識
の溶液は、約０．２ν／Ｖ％のグルタルアルデヒドを含
有する希釈溶液であり。

使用する緩衝剤は、１０ｍＭの塩化マグネシウムまたは
酵素要求に従って他の補因子を含有する０、１Ｍのトリ
スＨＣＱまたは０．１Ｍの燐酸塩緩衝剤である。１つの
公知結合方法においては、グルタルアルデヒドを培養の
間または培養後に加える。現在まで、これが蛋白質標識
を抗血清と結合させるための標準技術の１つである。

この方法の次の工程は、未結合の免疫蛋白質もしくは蛋
白質標識を結合体から除去することである。

好ましくは、分離はｐＨ７〜９の１０ｍＭのＭｇＣｌ１
２を含有する０、１ＭのトリスＨＣΩ緩衝液の存在下で
透析して行なわれる。あるいは、カラムクロマトグラフ
ィーを使用することもできる。結合体に対し、少くとも
約１０ｖ／ｖ％かつ約５０ｖ／ｖ％までのグリセリンを
添加する。好ましくは、結合体溶液におけるグリセリン
の最終濃度は約２ｏν／ν％である。好ましくは、約５
％までポリエチレングリコールをも結合体溶液中に混入
する。

本発明者等は、結合体に対するグリセリンの添加が結合
体の温度安定性を相当に増大させ、更に結合体を室温で
貯蔵しかつ使用することを可能にし、特にこの結合体を
１例えば約４５℃のような高温度にて分析に使用し得る
ことを突き止めた。

このようにして、この結合体を使用する分析は、特に抗
原−抗体複合体と一緒に前記結合体を培養するのに必要
な時間が短縮されるので最適化することができる。

分析手順については、表面活性剤を使用して免疫反応を
促進させる。

好ましくは、表面活性剤はアルキルベンゼンスルホン酸
塩１例えばナトリウム塩もしくはアンモニウム塩であり
、例えばアルブライト・アンド・ウィルソン社によりＮ
ＡＮＳＡ（登録商標）として市販されている。この表面
活性剤は０．００５〜１　ｖ／ｖ％、好ましくは約０．
０４ｖ／ｖ％の量で使用される。表面活性剤が多過ぎる
と非特異的な結合をもたらし、かつ蛋白質が支持体から
洗い出される一方、少な過ぎると効果を示さない。この
量は特定の分析に適した範囲で変化することができる。

表面活性剤のＨＬＢ比は比較的高く、この表面活性剤は
親水性表面活性剤と考えられる。好ましくは、ＨＬ　Ｂ
比は少なくとも約２０である。

表面活性剤は、支持体−リガンドと試料との間の第１培
養において、並びに支持体−リガンド結合した抗体と酵
素標識した結合体との間の第２培養において使用される
。必要に応じ、これは更にＥＬＩＳＡ技術を使用する場
合、基質と酵素標識との第３培養工程でも使用される。

更にこの分析手順は、例えばポリエチレングリコール（
Ｐ　Ｅ　Ｇ）のようなポリアルキレングリコールの存在
により、蛋白質−蛋白質結合が生ずる分析工程において
安定化される。すなわちＰＥＧは、リガンド−支持体を
試料中に存在する抗体に結合させる第１培養工程におい
て、並びに酵素標識した結合体が結合抗体に結合する第
２培養工程において使用される。必要に応じ、ＰＥＧは
更に第３培養工程でも使用されるが、この分析工程では
殆んど効果を示さない。

好ましくは、ＰＥＧは０．１〜５ｗ／ｖ％、より好まし
くは約０．１５ｗ／ｖ％の濃度で使用される。好ましく
は、ＰＥＧは１，０００〜２０，０００より好ましくは
６，０００〜８．０００の分子量を有する。

発明の実施例 以下、好適な実施例により本発明を説明するが、これら
実施例は本発明の範囲を限定するものではない。

失速」ＬＬ 以下は抗原支持体複合体の一般的製造方法、抗血清−酵
素結合体の製造方法、および本発明の分析方法である。

抗原：トキソプラズマ・ゴンジイ（Ｔ　ｏｘｏｐｌａｓ
ｍａｇｏｎｄｉｉ）抗原、 緩衝剤：０．１Ｍ重炭酸緩衝剤、ｐＨ９，６゜抗原を分
散させかつガラス注射器を通して剪断する。あるいは、
好ましくはこれを音波発生器により行なうこともできる
。抗原を、この抗原の種類および試料の純度に応じて、
重炭酸緩衝液により約４０〜２００倍に希釈する。

被覆溶液における２５０μＱの抗原を１例えばギルドフ
ォード・ポリスチレンキュベツトまたは微小測定板のよ
うな重合体マトリックスへ施す。

各試験につき２つの穴部またはキュベツトを使用する。

比較穴部を緩衝液のみで被覆する一方、試験穴部を緩衝
溶液における試験抗原で被覆する。

プレートを３７℃にて２〜４時間培養する。

次いで被覆したプレートを０．０５％のツイーン２０と
１０ｍＭのＭｇＣ０．とを含有する燐酸緩衝塩の溶液中
で固定する。次いで、これらプレートを３７℃にて２時
間培養する。培養が完了した後、これらプレートを室温
にて排液乾燥させる。

抗血清−酵素結合体の作成 酵素：アルカリホスファターゼ（シグマ・ラボラドリー
ス社）、 抗血清：羊抗ヒトＩｇＧ（シレヌレ・ラボラドリース社
）。

粗製のアルカリホスファターゼ粉末をクロマ１〜グラフ
イーにより精製する。貯蔵したアルカリホ入ファターゼ
フラクション約３０〜４０ｗＱを、６〜１０ｍＱの抗ヒ
トＩｇＧと混合し、かつトリス−Ｈ（Ｑ（０，１Ｍ　ｐ
Ｈ８，６＋１０＋＋＋Ｍ　ＭｇＣＱ。

＋０．１５Ｍ　ＮａＣＱ）または１０　ｍＭ　ＭｇＣＱ
　２を有する燐酸塩緩衝液（ｐＨ６〜８）において１晩
透析する。

次いで、混合物を透析袋あるいは必要に応じアミコン濃
縮装置におけるポリエチレングリコールフレークで濃縮
させる。透析した濃縮混合物へ０．４％までのグルタル
アルデヒド（最終濃度）を加える。この混合物を、約３
０分撹拌する。次いで混合物をトリス−Ｈ（１（０，１
Ｍ　ｐＨ８，６＋１０ｍＭ　ＭｇＣＭ、＋０．１５Ｍ　
ＮａＣＱ）において第１透析にて１晩透析する。非結合
物質の除去が必要であれば、結合体と免疫蛋白質とアル
カリホスファターゼとを、次いでセファデックスＧ−２
００もしくはＧ−１５０またはセファクリル５３００の
カラムにて分離することができる。

精製すると結合体は溶液中で安定化されて、次のような
最終濃度を与える： ２０％のグリセリンと、０．１５％のポリエチレングリ
コールと、１０ｍＭのＭｇＣＱ□と、０．１５ＭのＮａ
ＣＱとを含有するトリス−ＨＣＱ（０，１Ｍ　ｐＨ７，
４）緩衝液。

分析 トキソプラズマ・ゴンジイ特異性のＩｇＧ分析Ｘ】−： （１）トキソプラズマ抗原で被覆されたキュベツト／プ
レート、 （２）安定剤溶液中に希釈されて分析用には更に３０倍
まで便利に希釈し得るアルカリホスファターゼに結合さ
れた抗ヒトＩｇＧ、 （３）ＰＨ９，９，０，ＬＭ（７）２−７ミノ、２−メ
チル、１−プロパツール緩衝液に溶解され、５ｆｆＩ０
．づつ凍結貯蔵された濃度３ｍＭの燐酸バラニトロフェ
ニル、（４）次のように構成された血清および結合体希
釈物： 燐酸緩衝塩（２０倍濃縮）５０ＩＩＱ ポリエチレングリコール（１５％溶液）　　１０ｍＱ塩
化マグネシウム　０．５Ｍ　　　　　　　１６ｍＱＮＡ
ＮＳＡ（１０％溶液）　　　　　　　　２．５ｍＱ水（
蒸留水）　　　　　　　　　　　　９２１．５ｍ０．（
５）洗浄溶液：０．０５％のツイーン２０と５ｍＭの塩
化マグネシウムとを含有する燐酸緩衝塩の溶液、 （６）基質希釈剤２−アミノ、２−メチル、１−プロパ
ツール（０，１Ｍ）。

ＮＡＮＳＡ、　　０．０４５％、 塩化マグネシウム　５ｍＭ ｐＨ１０，２５゜ 分析法： 被覆されたプレート／キュベツトを洗浄溶液中で３回洗
浄することにより水和させる。最後の洗浄を３分間維持
した後、更に３分間で排液させる。

次いで１０μＱの血清を各試料につき比較キュベツトと
試験キュベツトとの両者に加える。

血清希釈物を全ての穴部にピペットで入れ、そしてプレ
ート／キュベツトを４５℃にて３０分間培養する。培養
が終わったら、プレート／キュベツトをツイーン２０を
含有する燐酸緩衝塩で洗浄する。

次いで、プレートまたはキュベツトに再び３０倍希釈さ
れた結合体を満たす。これらのプレート／キュベツトに
蓋をして、４５℃にて１５分間培養する。

プレートまたはキュベツトを燐酸緩衝塩で４回洗浄する
。

凍結した燐酸バラニトロフェニルを基質希釈剤で１：４
に希釈する。プレート／キュベツトに蓋をし、そして４
５℃にて２０〜３０分間培養する。

全ての溶液を４５℃にて予備培養した後、キュベツト／
プレート中へ分配する。

４０５ｎｍにおけるパラニトロフェノールの測定により
アルカリホスファターゼの活性を、分光光度法により検
出する。示した結果は二連の試験の平均である。これら
の二連の試験間に顕著な隔りが生じた場合は、分析を反
復する。

太凰舅又 以下の実施例は、抗原支持体複合体の作成後にこの複合
体を１例えばｐＨ９，６の牛血清アルブミンのような蛋
白質溶液で洗浄すれば、非特異的結合を減少させ得るこ
とを示している。

使用した試験手順は、実施例１に記載したトキソプラズ
マ・ゴンジイ分析とした。トキソプラズマ補体結合抗原
をポリスチレン微小測定皿と共に２時間培養した。２時
間の培養後、比較穴部と試験穴部との両者を排液しかつ
２５０μΩづつの次の物質を満たした： （ａ）重炭酸緩衝液における２１）５％牛血清アルブミ
ン：ｐＨ９，６にて０．１Ｍ （ｂ）トリス−ＨＣＱ緩衝液における２１）５％牛血清
アルブミン：ｐＨ７，４にて０．１Ｍおよび（ｃ）　ｐ
Ｈ９、６の２．５％燐酸緩衝塩。

３０分間後、これらプレートを５ｍＭの塩化マグネシウ
ムと０．０５％のツイーン２０とを含有する燐酸緩衝塩
で洗浄した。

これらの結果を第１表に示す。

第」二人 ポリスチレン／抗原における非特異性結合部位の除去 カーボ　　ＨＣＬ　　　ＢＳＡ　　　な　し２　　０．
０９　　０．２７　　０．２１　　０．３４３　　０．
１７　　０．２５　　０．１．８　　０．３０４　　０
．１１　　０．２１　　０．１７　　０．３１５　　０
．１２　　０，２３　　０．１６　　０．２４６　　０
．１２　　０．２２　　０．１７　　０．２８７　　０
．１１　　０．２．４　　０．２４　　０．２８８　　
０．２１　　０，３０　　０．２６　　０．３０９　　
０．２４　　０．２４　　０，３１　　０．３２１０　
０．２１　　０，２１　　０，２９　　０．３１１１　
０．１７　　０．２０　　０．２７　　０．２９１２　
　０．２０　　０．２６　　０．２９　　０．２６１３
　　０．１７　　０，１８　　０．２７　　０．２７１
４　　０．２９　　０．２３　　０．２９　　０．３０
１５　　０．２５　　０．１８　　０．３４　　０．３
４１６　　０．３０　　０．３０　　０．３３　　０．
３２非特異性結合部位を除去するための最良の後被覆溶
液は、牛血清アルブミンの燐酸緩衝塩溶液である。実際
にプラスの特異性ＩｇＧを有する血清試料は、この方法
により減退しないであろう。

大意■ｌ 実施例１に記載した分析の幾つかの面につき。

試験して、この分析における変数を最適化させた。

４５℃の温度にて、培養時間を最適化させた。

第１培養期間、すなわち血清と抗原−支持体複合体との
培養期間は、３０分間で最適化された。

第２培養期間、すなわち抗ＩｇＧ結合体／アルカリホス
ファターゼと支持体との培養は、１５分間で最適化され
た。第３培養期間、すなわち基質と結合標識酵素結合体
との培養は、３０分間で最適化された。

この最適化法は更に最適温度の試験をも含んだ。

使用した分析法は、実施例１に記載したと同様であり、
かつ培養時間も上記と同様であった。分析および全ての
培養は次の温度にて行なった：２１℃、３０℃、３７℃
、４０’Ｃ，４５℃。

５０℃および５５℃。

下記の第２表は、上記温度における８個の別々の血清試
料の光学濃度を示している。分析および培養に対する最
適温度は、約４０〜４５℃であることが判るであろう。

剃左聚 ２　０．１３　０，２３　０，２２　０，３３　０，３
１　０，２５　０．０３３　０．１．７　０．２０　０
．２４　０，３２　０．２８　０，１８　０．０８４　
０．１６　０，２６　０，２８　０，３３　０．３６　
０．１９　０．０７５　０．１４　０，２４　０，２６
　０．３１　０．３３　０．２３　０．０６６　０、Ｌ
６　０．２５　０．２７　０．３４　０．３３　０．１
９　０．０４７　０．１７　０，２６　０，２６　０．
３０　０．３４　０．１４　０．０５２０ｖ／ｖ％グリ
セリンの存在下における室温での酵素標識された結合体
の長期貯蔵につき検査した。

結合体を用いる分析を０日、６日、９日、１２日、１５
日および１４０日の期間で行なった。この結合体を３種
の市販製品Ａ、ＢおよびＣと比較し、これらの結果を第
３表に光学濃度として示す。

第３表 グリセリンを用いた室温における結合体の長期貯蔵 日　　　　　　数 希釈　１　６　９　１２１５１４０ ＭＡＮＬＡＤ　ＩｇＧ ＋２（５）グリセリン　１　１：２０　０．６８　０，
７９　０，７７　０．８０　０，７８　０．８４ＭＡＮ
ＬＡＢ　ＩｇＧ グリセリンなし　１　１：２０　０．７８　０．８７　
０．８７　０，８５　０．８３　０．４４ＭＡＮＬＡＢ
　ＩｇＧ ＋２０％グリセリン　２　１：２０　０．３８　０，４
９　０，４２　０．４３　０．４６０．４２ＭＡＮＬＡ
Ｂ　ＩｇＧ グリセリンなし　２　１：２０　０．３１　０．３６　
０．３３　０，３２　０，３１　０．１９Ａ　　　　　
　　　　　　　１＝１０　０．４１　０．８２　０，６
７　０．７９　０，６４　１．１６Ｂ　　　　　　　　
　　　１□１５　０．８１　０．９５　０．８５　０．
８６　０．８３　１．１８註：全ての結合体は、事前に
試験から１日目に適当な読みを得るように希釈した。

上記の結果は、生成物をグリセリンの不存在下で貯蔵し
た場合、室温における長期貯蔵の後に室温において顕著
な変化を示している。グリセリンの存在下では、室温に
おける長期貯蔵の後の結果に顕著な変化が存在しない。

夫立鮭ｉ ヒトＩｇＧ−Ｆｃ断片をギルフォード・キュベツトへ０
．１ナトリウム重炭酸−炭酸緩衝液における２００μｇ
／ｍＱにて３７℃で２時間被覆した。これらキュベツト
を、５ｍＭの塩化マグネシウムを含むＰＢＳツイーン０
．００５％で洗浄した。

抗ヒト−ＩｇＧの結合体を０．１５Ｍの塩化ナトリウム
と１０ｍＭの塩化マグネシウムとを含有するトリス−Ｈ
Ｃ悲（０，１Ｍ、ｐＨ７，４）で希釈した。

希釈物へ種々の濃度のグリセリンを添加して、グリセリ
ンの最終濃度をＯ〜４０ｖ／ｖ％にした。−面において
、結合体溶液は更にＮＡＮＳＡを約０．０４ｗ／ｖ％の
量で含有した。

上記のように希釈した結合体をＩｇＧで被覆されたキュ
ベツトと共に４５℃にて１５分間培養し、キュベツトを
洗浄し、基質を加え、そして４５℃にて３０分間培養し
た。

下記第４表はその結果を示している。

第４表 グリセリンによる結合体の安定化 グリセリン濃度　ＮＡＮＳＡ　　　　ＮＡＮＳＡ２　　
　５％　　　　　　０．２５　　　　　０．３１３　　
］、Ｏ％　　　　　０．２６０．３０４　１５％　　　
　　０．２５０．３４５　２０％　　　　　０．２９０
．３２６　　３０％　　　　　０．３２０．３５７　４
０％　　　　　　　−− 結合体に対するグリセリンの添加は、結合体の免疫化学
反応を向上させず、あるいは顕著に影響するとは思われ
なかった。グリセリンは単に室温における生成物の貯蔵
の安定化剤として作用するのみである。結合体は製造直
後に凍結乾燥することができ、かつ凍結乾燥物を水和し
た後にグリセリンを添加することができる。

ＮＡＮＳＡの添加は、短期間に亘り結合体の活性に影響
するとは思われない。

失に五且 前記実施例につき使用した試験手順を用いて、分子ｉ６
，０００〜８，０００のポリエチレングリコールを種々
異なる量で混入する効果を検討した。

分析法は同じ試料を使用したが、ポリエチレングリコー
ルの濃度を結合体の希釈においてＯ〜６ｗ／ｖ％の範囲
で変化させた。得られた結果を下記第５表に示す。従っ
てポリエチレングリコールは抗原−抗体複合体の形成に
対し殆んど向上作用を示茅擾−及 ２　　　　　　　　　　　０．２　　　　　　　０．１
９３　　　　　　　　　　　０．４　　　　　　　０．
１９４　　　　　　　　　　０゜６　　　　　　　０．
１６５　　　　　　　　　　　１．０　　　　　　　０
．１８６　　　　　　　　　　　　２．０　　　　　　
　　０．１８７　　　　　　　　　　　４．０　　　　
　　　０．１６リガンド支持体複合体を安定化させるた
めのポリエチングリコールの使用をこの実施例で示す。

ポリエチレン板ＡおよびＢをトキソプラズマ抗原と共に
２時間培養し、０．１５ｗ／ｖ％のＰＥＧを含有するＰ
ＢＳ−ツイーン２０（０，０５％）およびＭｇＣＱ　、
　（５ｍＭ）において洗浄した。

これらプレートを室温にて０８．２日、１０日、１７日
および３３日間貯蔵した後、実施例２に従って分析を行
ない、その結果を下記第６表に示す。

３３日間に亘る被覆プレートの活性の実質的ロスは認め
られなかった。

第６表 時間　０　日　２　日　１０日　１７日　３３日正常２
　．１８．１５．１３．１１．１０．１２．０９．１５
．１６．１９．１６３　．１５．１４．１０．１１．１
９．０８．１？、１３．ｉ６．１９．１５４　．１４．
１２　、］、４．１３．１２．１１．１３．１２．１８
．１９．１４５　．２０．１６，１５．１３．１１．０
８．１２．２０．１７．１６．１８６　．１７．１４．
１ｇ、２５．１９．２４．２１．２２．２１．２４．２
５７　　、Ｌ６．１３．１５．２６．２４．２６．２２
，２８．１７．２２．２９この実施例は、濃度の増°大
に伴う抗原−抗体反応に対する効果を示している。

この実施例においては、実施例１の分析手順を８個の異
なる試料につき使用した。ポリエチレングリコールの濃
度を抗原−酵素ｍ識の溶液においてＯ〜０　、２　Ｖ／
Ｖ％の範囲で変化させた。得られた結果を下記第７表に
示す。

１二し表 ２０．２５　０．２６　０．２６　０．２ｇ　　０．２
２　０．２５　０，２２　０．２５　０．２４　０．２
２３０．２４　０．２９　０．２８　０．２８　０．２
５　０．２７　０．２３　０．２７　０．２８　０．２
６４０．１．６　０．１５　０．１５　０．１９　０．
１４　０．１３　０．１２　０．１２　０．１３　０．
１３５０．２５　０．２７　０．３２　０．２６　０．
２５　０．２９　０．２６　０．２７　０．２９　０．
２ｇ６０．１９　０．２４　０．２６　０．２５　０．
２２　　０．２４　０，２０　０．２０　０．２３　０
．２２７０．２２　０．２４　０．２６　０，２６　０
，２６　０，２６　０，２４　０，２３　０．２７　０
．２３ＰＥＧの存在は、抗原−抗体複合体の形成を促進
せず、すなわち向上させなかったと結論される。

末凰里且 トリトンＸ−１００と、ツイーン２０とツイーン８０と
ラウリル硫酸ナトリウムと、ドデシルベンゼンスルホン
酸ナトリウムと、ＮＡＮＳＡ（アルキルベンゼンスルホ
ン酸ナトリウム）とを１種々の濃度で使用して表面活性
剤の比較を行なった。分析手順は、上記の選択された表
面活性剤の特定量を血清および抗−酵素標識結合体に対
する希釈剤の一部として組み込んだ。

結果を実施例１に記載した分析手順に基づき下記第８表
に示す。

アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム表面に活性剤で
あるＮＡＮＳＡの使用および／またはドデシルベンゼン
スルホン酸ナトリウムの使用は、分析の感度を著しく向
上させる。

星旦人 ト！月−ン　ツイーン　ツイーン　　ラウリル　ドデシ
ル　ＮＡＮＳＡＸ−１００２０８０硫酸ナト　ベンゼン
リウム　　スルホン 酸ナトリ ２　０．０６０．０６　０．０９０．０６　０．０４０
．０５　０．０８０．０９　．１３　．２５　０．２９
３　０．１６０．０１．　０．１７０．２４　０．１７
０，１１　０．１９０．１０　．１５　．２０　０．２
９４　０．０１０．０４　０．０５０．０５　０．（）
４０．０３　０．０８０．０４　　０．０６０．２０　
０．２１５　０．０９０．０４　０．０４０．０９　０
．０３０．１１　０．０８０．０６　０．１２０．１６
　０．２４６　０．０３０．０６　０．０３０．０４　
０．０３０．０３　０．０４０．０５　０．０５０．２
０　０．２６７　０．０５０．０５　０．０５０．０５
　０．０４０．０２　０．０６０．０５　０．１１０．
１７　０．２１８　０．０７０．０７　０．０６０．０
５　０．０５０．０７　０．０１０．１０　０．１００
．１７　０．２０矢ｍ耘以 実施例２の標準分析法並びに第１．第２および第３培養
の夫々につき標準培養時間を使用して、ＮＡＮＳＡを種
々の濃度で用いることにより表面活性剤の促進効果を示
した。ＮＡＮＳＡを第１および第２培養において所定濃
度で添加し、それらの結果を第１図に示す。

表面活性剤の濃度を最大値まで増大させると、設定培養
時間において光学濃度が増大することが判るであろう。

しかしながら光学濃度の増加が間違った結果をもたらす
ような最適濃度が存在すると確認された。従って、ＮＡ
ＮＳＡの最適濃度は０．０４〜０．０５ｗ／ｖ％の範囲
であると結論された。

ヌ１遭上士 ＩｇＧを分離しない同時的なＩｇＧおよびＩｇＭ支持体
マトリックス：ギルフォードによるポリスチレンキュベ
ツト・ 標準二予備分析したレベルのＩｇＧおよびＩｇＭを含有
するベーリング社のプラズマ蛋白質標準、純粋標準：カ
ルビオヘムーベーリング社からの純粋なヒトＩｇＧ（Ｆ
ｃ断片）、 被ｙｌ＝プラズマ蛋白質と純粋ＩｇＧ標準とを重炭酸−
炭酸緩衝液（０，１Ｍ）中に希釈し、次いで固体マトリ
ックスと共に２時間培養した。キュベツトをＰ　Ｂ　Ｓ
　ツイーン（０，０５％）およびＭｇ（１２（５ｍＭ）
で洗浄した。

使用した結合体は、最終希釈率１０５０における正常な
抗ＩｇＧ−アルカリホスファターゼ結合体および最終希
釈率９００における抗ＩｇＭ−アルカリホスファターゼ
結合体とした。

これらキュベツトを２５０μ２の結合体と共に１５分間
培養した。

２５０μＱの基質溶液を上記培養後にプレートを洗浄し
た後に加え、そしてこの培養を３０分間行なった。

全ての培養は４５℃の温度で行った。

刀」し及 ＩｇＧ　　　　　　　　　　　ＩｇＭ プラズマ−蛋白質　２０７５μｇ／ｍｌ　　Ｏ，７４２
３２μｇ／ｍｌ　　Ｏ，３３４１５０μｇ／ｍｌ　　Ｏ
，７１４６４μｇ／＋＋ｌ　　Ｏ，１９８３００μｇ／
ｍｌ　　　−９３０μｇ／ｍｌ　　Ｏ，１１結論： （１）純粋なＩｇＧ標準は、同濃度においてプラズマ蛋
白質標準に匹敵する結果を与えた６純粋なＩｇＧ標準は
ＩｇＭ結合体につき有意でない測定値を与えたのに対し
、プラズマ蛋白質標準における２３μｇ／ｍｌのＩｇＭ
については有意の測定値が得られた。

１０倍のＩｇＧ濃度において、ＩｇＭ測定の顕著な阻止
がＩｇＧの極めて高い濃度（４１５０μｇ／ｍｌ）にて
生じたが、適正なＩｇＭ測定値を得ることができる。し
かしながら、特定工ｇＧおよびＩｇＭの濃度は一般にこ
のような濃度に達しないであろう。

特定のＩｇＭ抗体を測定するためのＥＬＩＳＡを使用す
る殆んどの分析法は、高レベルのＩｇＧにより抗原部位
のスワンピングを防止するにはＩｇＭにつき分析する前
に血清中のＩｇＧを除去する必要があることを示唆して
いる。この除去を行なう共通の方法は、ＩｇＧに対し特
異的に結合する蛋白質Ａを使用することである。しかし
ながら、本発明に使用する分析法の感度は、ＩｇＧの分
離なしにＴｇＧとＩｇＭとを測定することにより低下し
ないと考えられる。より高い温度にてより短い培養時間
を用いるため、ＩｇＧにより抗原部位に対するＩｇＭの
排除は生じないと思われ、従って本発明の分析法の他の
利点は、ＩｇＭ抗体の分析においてＩｇＧの除去を必要
としないことである。

上記実施例は、特定のトキソプラズマ・ゴンジイ分析を
使用した。しかしながら、本発明の分析は広範囲のウィ
ルス抗体および／または抗原１例えば風疹、ＣＭＶ、ヘ
ルペス１および２１）トキソプラズマ、インフルエンザ
Ａ、ＢおよびＣ、パラインフルエンザ１．２および３、
ミコプラズマ、アデノウィルス、Ｑ熱、麻疹、帯状胞疹
、ロス　リバ−ウィルス、免疫複合体、ＨＣＧおよびチ
ロキシンなどを検出するための広範囲の分析法にも適用
することができる。適当な抗血清を使用することにより
、動物の抗体または抗原並びにヒトの抗体または抗原を
検出することもできる。

発明の効果 本発明によれば、高温度にて安定性の増大した免疫分析
技術並びにそれに使用する安定化試薬が得られ、本発明
の分析法は広範囲のウィルス抗体および／または抗原を
検出するための広範囲の分析法に応用することができる
。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＮＡＮＳＡの添加濃度に伴う表面活性剤の促
進効果を光学濃度の変化として示す特性曲線図である。 特許出願人　　　マンラブピーティーワイ、リミテッド
出願人代理人　弁理士　山本喜幾 択計一部

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）１０個までの炭素原子を有するポリヒドロキシ化
   合物を少なくとも１０ｖ／ｖ％含有する蛋白質−蛋白質
   結合体の組成物。 （２）ポリヒドロキシ化合物がグリセリンである特許請
   求の範囲第１項記載の組成物。 （３）少なくとも約２０ｗ／ｖ％のポリヒドロキシ化合
   物を含有する特許請求の範囲第１項または第２項記載の
   組成物。 （４）約５ｗ／ｖ％までのポリアルキレングリコールを
   更に含有する特許請求の範囲第１項乃至第３項のいずれ
   かに記載の組成物。 （５）ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコ
   ールである特許請求の範囲第４項記載の組成物。 （６）ポリヒドロキシ化合物が２０〜５０ｗ／ｖ％の濃
   度である特許請求の範囲第１項乃至第５項のいずれかに
   記載の組成物。 （７）試料中の所定物質とこの物質に対し比較的特異性
   である１種もしくはそれ以上の免疫蛋白質との間の免疫
   反応に基づく分析方法において、この分析における前記
   物質と前記免疫蛋白質との間の培養を３７℃〜５０℃の
   温度にて所定時間に亘り行なうことを特徴とする分析方
   法。 （８）温度が約４５℃である特許請求の範囲第７項記載
   の方法。 （９）試料中の所定物質を定性的および／または定量的
   に測定するための分析方法において、 （１）免疫反応により前記物質と結合し得る蛋白質また
   は核蛋白質を結合させまたは吸着させる支持体を供給し
   ； （２）この支持体を前記試料と接触させて前記物質を前
   記蛋白質に結合させ； （３）過剰の試料を前記支持体から除去し；（４）前記
   支持体を、この支持体に結合されると前記物質に対し相
   対的に特異結合し得る標識蛋白質と接触させて、この標
   識蛋白質を前記物質に結合させ； （５）未結合の標識蛋白質を除去し； （６）前記標識蛋白質の存在を定量的または定性的に測
   定し； 前記工程（２）および／または（４）を５ｗ／ｖ％まで
   のポリアルキレングリコールの存在下で行なうことを特
   徴とする分析方法。 （１０）ポリアルキレングリコールがポリエチレングリ
   コールである特許請求の範囲第９項記の方法。 （１１）ポリアルキレングリコールが６，０００〜８，
   ０００の分子量を有する特許請求の範囲第９項または第
   １０項記載の方法。 （１２）ポリアルキレングリコールを約０．１５ｗ／ｖ
   ％の量で存在させる特許請求の範囲第９項乃至第１１項
   のいずれかに記載の方法。 （１３）工程（２）および（４）を、更に１ｖ／ｖ％ま
   での実質的に親水性の表面活性剤の存在下で行なう特許
   請求の範囲第９項乃至第１２項のいずれかに記載の方法
   。 （１４）表面活性剤がアルキルベンゼンスルホン酸の塩
   である特許請求の範囲第１３項記載の方法。 （１５）試料中の所定物質を定性的または定量的に測定
   するに際し； （１）免疫反応により前記物質と結合し得る蛋白質を結
   合させ、または吸着させる支持体を供給し；（２）前記
   支持体を前記試料と接触させて、前記物質を前記蛋白質
   に結合させ； （３）過剰の試料を前記支持体から除去し；（４）前記
   支持体を、この支持体に結合させた際前記物質に対し相
   対的に特異結合し得る標識蛋白質と接触させて、前記標
   識蛋白質を前記物質および前記支持体に結合させ； （５）未結合の標識蛋白質を除去し； （６）前記標識蛋白質の存在を定量的または定性的に測
   定し； 前記工程（２）および（４）を約１ｖ／ｖ％までの比較
   的親水性の表面活性剤の存在下で行なうことを特徴とす
   る分析方法。 （１６）表面活性剤をアルキルベンゼンスルホン酸の塩
   から選択する特許請求の範囲第１５項記載の方法。 （１７）表面活性剤がドデシルおよび／またはラウリル
   ベンゼンスルホン酸のナトリウムもしくはアンモニウム
   塩である特許請求の範囲第１６項記載の方法。 （１８）免疫学的分析のための貯蔵安定性の支持体−リ
   ガンド複合体を製造するに際し、 （１）前記分析用として固体もしくは粒状の支持体また
   はマトリックスを供給し； （２）前記支持体の表面へ所定の蛋白質を結合させ； （３）前記蛋白質が結合される前記支持体を０．０１〜
   ５ｗ／ｖ％のポリアルキレングリコールの溶液と接触さ
   せる ことを特徴とする製造方法。 （１９）ポリアルキレングリコールがポリエチレングリ
   コールである特許請求の範囲第１８項記載の方法。 （２０）支持体がポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたは
   ガラスである特許請求の範囲第１８項記載の方法。 （２１）特許請求の範囲第１８項乃至第２０項のいずれ
   かに記載の方法により製造される貯蔵安定性の支持体−
   リガンド。 （２２）特許請求の範囲第２１項記載の貯蔵安定性支持
   体および／または特許請求の範囲第１項乃至第６項のい
   ずれかに記載の組成物を含有することを特徴とする分析
   用のキット。