JPS61254855A - 螢光色素による化学修飾を目印としたｄｎａ断片の螢光検出方法 - Google Patents
螢光色素による化学修飾を目印としたｄｎａ断片の螢光検出方法Info
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- JPS61254855A JPS61254855A JP9598885A JP9598885A JPS61254855A JP S61254855 A JPS61254855 A JP S61254855A JP 9598885 A JP9598885 A JP 9598885A JP 9598885 A JP9598885 A JP 9598885A JP S61254855 A JPS61254855 A JP S61254855A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分前）
本発明は、ターミナルデオキシヌクレオタイド転移酵素
（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙ
ｌ ｔｒａ−ｎｓｆｅｒａｓｅ）を用いて、螢光色素に
よって化学修飾できるＳＨ基をもつヌクレオチド三燐酸
類をＤＮＡの３′末端に結合させることによって、ＤＮ
Ａの塩基配列順序を螢光測定によシ決定する方法に関す
る。
（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙ
ｌ ｔｒａ−ｎｓｆｅｒａｓｅ）を用いて、螢光色素に
よって化学修飾できるＳＨ基をもつヌクレオチド三燐酸
類をＤＮＡの３′末端に結合させることによって、ＤＮ
Ａの塩基配列順序を螢光測定によシ決定する方法に関す
る。
（従来技術）
近年、ＭａｘａｍとＧｉ １ｂｅｒｔは、ＤＮＡ（Ｄ塩
基配列を決定する方法として、３′末端に放射性ヌクレ
オチドを取り込ませるか、５′末端に燐の放射性同位元
素を結合させた標識ＤＮＡの塩基を、ＤＮＡ１１１成塩
基アデニン、グアニン、シトシン、チミンそれぞれに％
異的に反応する化学物質により修飾切断して、断片ＤＮ
Ａを作り、電気泳動させて得られる泳動パターンにより
塩基配列を解読する手段を開発した。Ｍａｘａｍ−９ｉ
ｌｂｅｒｔ法によれば、Ｔ）ＮＡはランダムな長さの断
片となるが、かえってこれによってその切断長と切断点
の塩基からＤＮＡ中の塩基の全配列を知ることができる
ｒ、また、螢光性のヌクレオチドを直接ＤＮＡ３’末端
に取り込ませて螢光標識とするものも提案されている（
直接螢光標識法）。
基配列を決定する方法として、３′末端に放射性ヌクレ
オチドを取り込ませるか、５′末端に燐の放射性同位元
素を結合させた標識ＤＮＡの塩基を、ＤＮＡ１１１成塩
基アデニン、グアニン、シトシン、チミンそれぞれに％
異的に反応する化学物質により修飾切断して、断片ＤＮ
Ａを作り、電気泳動させて得られる泳動パターンにより
塩基配列を解読する手段を開発した。Ｍａｘａｍ−９ｉ
ｌｂｅｒｔ法によれば、Ｔ）ＮＡはランダムな長さの断
片となるが、かえってこれによってその切断長と切断点
の塩基からＤＮＡ中の塩基の全配列を知ることができる
ｒ、また、螢光性のヌクレオチドを直接ＤＮＡ３’末端
に取り込ませて螢光標識とするものも提案されている（
直接螢光標識法）。
（発明が解決しようとする問題点）
Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法においては、放射性アイ
ソトープを用いなければならないので、特別の規制を受
け、普通の実験室で塩基配列を決定することができない
。また、直接螢光標識化法においては、螢光性ヌクレオ
チドとＤＮＡ構成ヌクレオチドとの間のエネルギー転移
により螢光強度が低下する欠点がある。
ソトープを用いなければならないので、特別の規制を受
け、普通の実験室で塩基配列を決定することができない
。また、直接螢光標識化法においては、螢光性ヌクレオ
チドとＤＮＡ構成ヌクレオチドとの間のエネルギー転移
により螢光強度が低下する欠点がある。
本発明の目的は、これら従来法の欠点を改良し、しかも
Ｍａｘａｍ −Ｇｉ ｌｂｅ ｒｔ法を越える感覚を有
する新規なりＮＡ断片の螢光検出方法を提供することで
ある。
Ｍａｘａｍ −Ｇｉ ｌｂｅ ｒｔ法を越える感覚を有
する新規なりＮＡ断片の螢光検出方法を提供することで
ある。
（問題点を解決するための手段）
本発明は、塩基の化学修飾から電気泳動までの手法はＭ
ａｘａｍとＧ１１ｂ・ｒｔの開発した方法を用いる。本
発明の析しい点は、放射性同位元素によるＤＮＡの標識
のかわりに、ＳＨ基導入のヌクレオチドをＤＮＡ３’末
端に結合させ、ＳＨ基を標的にして螢光物質を作用させ
て螢光標識し要点にある。本発明は螢光性のヌクレオチ
ドを直接ＤＮＡ３’末端に＃Ｉｌシ込ませる螢光標識と
は異なる間接螢光標識法である。
ａｘａｍとＧ１１ｂ・ｒｔの開発した方法を用いる。本
発明の析しい点は、放射性同位元素によるＤＮＡの標識
のかわりに、ＳＨ基導入のヌクレオチドをＤＮＡ３’末
端に結合させ、ＳＨ基を標的にして螢光物質を作用させ
て螢光標識し要点にある。本発明は螢光性のヌクレオチ
ドを直接ＤＮＡ３’末端に＃Ｉｌシ込ませる螢光標識と
は異なる間接螢光標識法である。
本発明の螢光色素による化学修飾を目印とし７１ｊＤＮ
Ａ断片の螢光検出方法は、Ｍａｘａｍ −Ｇ１−１ｂｅ
ｒＬ法にならって得られ次ＤＮＡ断片を電気泳動等の手
段によって分離し、塩基配列を決定するにあたって、Ｓ
Ｈ基をもつヌクレオチド三燐酸類似物質としての６メル
カグトプリン三燐酸、チオグアノシン三燐酸、まｆｃは
４チオウリジン三燐酸ｆＤＮＡの３′末端ＩＣｔｅｒｍ
ｉｎａｌ ｄｅｏ−ｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒ
ａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｋよって１分子または２分子結合
させた後、ＳＨＭ忙特異的に結合する螢光色素であるＮ
−（７−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉ−ｎｏ −４−ｍｅ
ｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｙｎｙｌ ） ｍａｌｅｉｍｉｄ
ｅ、Ｎ −（１−ａｎｉｌｉｎｏｎａｐｈｔｈｙｌ −
４） ｍａｌｅｉｍｉｄｅ ％Ｎ−（９−ａｃｒｉｄｉ
ｎｙｌ ） ｍａｌｅｉｍｉｄｅ 、ま次はＮ−（４−
ａｎｉｌｉｎｏｐｈｅｎｙｌ ） ｍａｌｅｉｍｉｄｅ
を結合させるものである。
Ａ断片の螢光検出方法は、Ｍａｘａｍ −Ｇ１−１ｂｅ
ｒＬ法にならって得られ次ＤＮＡ断片を電気泳動等の手
段によって分離し、塩基配列を決定するにあたって、Ｓ
Ｈ基をもつヌクレオチド三燐酸類似物質としての６メル
カグトプリン三燐酸、チオグアノシン三燐酸、まｆｃは
４チオウリジン三燐酸ｆＤＮＡの３′末端ＩＣｔｅｒｍ
ｉｎａｌ ｄｅｏ−ｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒ
ａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｋよって１分子または２分子結合
させた後、ＳＨＭ忙特異的に結合する螢光色素であるＮ
−（７−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉ−ｎｏ −４−ｍｅ
ｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｙｎｙｌ ） ｍａｌｅｉｍｉｄ
ｅ、Ｎ −（１−ａｎｉｌｉｎｏｎａｐｈｔｈｙｌ −
４） ｍａｌｅｉｍｉｄｅ ％Ｎ−（９−ａｃｒｉｄｉ
ｎｙｌ ） ｍａｌｅｉｍｉｄｅ 、ま次はＮ−（４−
ａｎｉｌｉｎｏｐｈｅｎｙｌ ） ｍａｌｅｉｍｉｄｅ
を結合させるものである。
（発明の効果）
本発明の方法は、ＤＮＡの塩基配列の決定のためにＭａ
ｘａｍ −Ｇｉ １ｂｅｒｔ法とほぼ同様に行うので、
ＤＮＡはランダムな長さの断片になるが、かえってこれ
によってその切断長と切断点の塩基からＤＮＡ中の塩基
の全配列がわかるという特＠を有している。
ｘａｍ −Ｇｉ １ｂｅｒｔ法とほぼ同様に行うので、
ＤＮＡはランダムな長さの断片になるが、かえってこれ
によってその切断長と切断点の塩基からＤＮＡ中の塩基
の全配列がわかるという特＠を有している。
本発明によるＤＮＡの螢光標識化の利点は、汚染の心配
のある放射性同位元素の使用を回避できる点にある口し
たがって、普通の実験室で特別の規制を受けずに本発明
の方法によって実験することができる。本発明の螢光標
識法による塩基配列決定時の感覚け、標＠ＤＮＡの露光
時間を十分にとるととＫより、放射性同位元素による標
Ｒを超え得るものである。従来の螢光性ヌクレオチドを
用いたＤＮＡ３’末端標識法は、螢光性ヌクレオチドと
ＤＮＡ構成ヌクレオチドとの間のエネルギー転移により
、螢光強度が低下する欠点があるが、本発明のＳＨ基を
通しての間接螢光標識法では、エネルギー転移による螢
光強度の低下はない。この点で、螢光ヌクレオチドによ
る直接螢光標識法を改良している。
のある放射性同位元素の使用を回避できる点にある口し
たがって、普通の実験室で特別の規制を受けずに本発明
の方法によって実験することができる。本発明の螢光標
識法による塩基配列決定時の感覚け、標＠ＤＮＡの露光
時間を十分にとるととＫより、放射性同位元素による標
Ｒを超え得るものである。従来の螢光性ヌクレオチドを
用いたＤＮＡ３’末端標識法は、螢光性ヌクレオチドと
ＤＮＡ構成ヌクレオチドとの間のエネルギー転移により
、螢光強度が低下する欠点があるが、本発明のＳＨ基を
通しての間接螢光標識法では、エネルギー転移による螢
光強度の低下はない。この点で、螢光ヌクレオチドによ
る直接螢光標識法を改良している。
本発明はＤ Ｎ Ａ ３’末端に導入したＳＨ基に螢光
色素を作用させるため、螢光色素を替えることＫより、
化学修飾切断ＤＮＡ断片の発光波長が選択できる。この
点は塩基配列決定の自動製雪作製の際に大いに役立つ。
色素を作用させるため、螢光色素を替えることＫより、
化学修飾切断ＤＮＡ断片の発光波長が選択できる。この
点は塩基配列決定の自動製雪作製の際に大いに役立つ。
なお、標識しないＤＮＡ断片から螢光が出ても、その波
長は短いので、判別することができる。
長は短いので、判別することができる。
（実施例）
塩基配列（ＣＡＡＧＣＴＴＧ）をもつｇｍａ ｒのオリ
ゴヌクレオタイドが用いられ念。
ゴヌクレオタイドが用いられ念。
０、４ Ａ２６０ユニツトのＤＮＡ水溶液（４０μｔ）
を反応液（４０ｍＭカコジル酸カリウム、８ｍＭＭｇＣ
１２，１ｍＭＤ Ｔ Ｔ、 ２．５ ｍＭ ６メルカプ
トプリンリボシド三燐酸、１６０ユニツト・ターミナル
デオキシヌクレオタイド転移酵素、ＰＨ６，９、ＤＮＡ
溶液を加えた後の般終濃変を示した。）に加え九総容１
２００μｔの溶液をエッペンドルフ型プラスチック製（
容量１．５ｍｔ）のチューブに入れ、３７℃の温浴に６
時間以上（本例では２２時間）浴させ、ＤＮＡの３′末
端ＫＳＨ基誘導ヌクレオタイド（６メルカグトヌクレオ
チド）全結合させた。
を反応液（４０ｍＭカコジル酸カリウム、８ｍＭＭｇＣ
１２，１ｍＭＤ Ｔ Ｔ、 ２．５ ｍＭ ６メルカプ
トプリンリボシド三燐酸、１６０ユニツト・ターミナル
デオキシヌクレオタイド転移酵素、ＰＨ６，９、ＤＮＡ
溶液を加えた後の般終濃変を示した。）に加え九総容１
２００μｔの溶液をエッペンドルフ型プラスチック製（
容量１．５ｍｔ）のチューブに入れ、３７℃の温浴に６
時間以上（本例では２２時間）浴させ、ＤＮＡの３′末
端ＫＳＨ基誘導ヌクレオタイド（６メルカグトヌクレオ
チド）全結合させた。
酵素反応終了ｖｋ、 溶液を４本のエッペンドル７型プ
ラスチック製チューブに分注し、ＤＡＣＭ （Ｎ −（
７−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ −４−ｍｅｔｈｙｌ
−３−ｃｏｕｍａｒｉｍｙｌ ） −ｍａｌｅｉｍｉｄ
ｅ ）のアルコール飽和溶液２０μｔｔ−それぞれのチ
ューブに加え、ＤＮＡ３’末端を螢光Ｓａｔ、＋。この
操作の後、４本のチューブそれぞれＶＣ４００μｔエチ
ルアルコールを加えて、−晩マイナス２０℃の冷凍庫に
安置したものを回転数８０００ｒｐｍで１０分間遠心し
、ＤＮＡを沈澱させた。そして、沈澱させたＤＮＡをエ
タノール−水混合洗浄液（エタノール：水＝１７：６）
で洗浄した後、９９．５％エタノールでＩ！に洗浄した
。
ラスチック製チューブに分注し、ＤＡＣＭ （Ｎ −（
７−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ −４−ｍｅｔｈｙｌ
−３−ｃｏｕｍａｒｉｍｙｌ ） −ｍａｌｅｉｍｉｄ
ｅ ）のアルコール飽和溶液２０μｔｔ−それぞれのチ
ューブに加え、ＤＮＡ３’末端を螢光Ｓａｔ、＋。この
操作の後、４本のチューブそれぞれＶＣ４００μｔエチ
ルアルコールを加えて、−晩マイナス２０℃の冷凍庫に
安置したものを回転数８０００ｒｐｍで１０分間遠心し
、ＤＮＡを沈澱させた。そして、沈澱させたＤＮＡをエ
タノール−水混合洗浄液（エタノール：水＝１７：６）
で洗浄した後、９９．５％エタノールでＩ！に洗浄した
。
洗浄のすんだ３′末端螢光標ＲＤＮＡは次の表に示され
る手順で化学修飾切断され、塩基配列決定に用いる修飾
切断片螢光標ｌｌＤＮＡとなる。
る手順で化学修飾切断され、塩基配列決定に用いる修飾
切断片螢光標ｌｌＤＮＡとなる。
コノ手順は基本的にＭａｘａｍ −Ｇｉ １ｂｅｒｔ法
に従ったものである。
に従ったものである。
ＤＮＡ塩基の化学修飾手順表
３００μΩ激 ３００μｔ ２０μｔＨ２０＋
２０μｔ２．５Ｍｂｕｆｆｅｒ＋ ＤＭＳｂｕｆｆｅ
ｒ ２ｐｔキヤリア ＮａＣ１水溶液１μｔキ
ヤリア ＋１μｔギヤリ −ＤＮＡ
＋２μｔキヤリーＤＮＡ アーＤＮＡ （１
０ｍｇ／ｍｔ） アーＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍ４
（１０ｍｇ、澹４ を乾固した試 （１０ｍｇ
／ｍ４を乾固した試 を乾固した 料に入れた。
を乾固した試料に入れた。 試料に入れ （ａｔ
９℃） 科に入れた＠（ａｔＱ℃） たｃ、（
ａｔ ９℃）（ａｔ ９℃） ・１↓ ８ 与 ４↓２μｔＤ
Ｍｓ ２μｔＤＭＳ ３０ｕｚヒドラ ３
０μｔヒドラを加え約２４ を加え約４ ジンを加え
約 ジンを加え約分室温で反応 ８分室錫で ３
７分反応さ ５０分反応ささせた。 反応させ
た。 せた◎ せた０甘 ■ ８
■ ４０μｔＤＭ ４０μｔＤＭ ４５０μｔヒト
４５０μｔヒトＳ停止液を Ｓ停止液を ラジン停止
液 ラジン停止液加え次。 を加えた。 を加え
た。 を加えた。
２０μｔ２．５Ｍｂｕｆｆｅｒ＋ ＤＭＳｂｕｆｆｅ
ｒ ２ｐｔキヤリア ＮａＣ１水溶液１μｔキ
ヤリア ＋１μｔギヤリ −ＤＮＡ
＋２μｔキヤリーＤＮＡ アーＤＮＡ （１
０ｍｇ／ｍｔ） アーＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍ４
（１０ｍｇ、澹４ を乾固した試 （１０ｍｇ
／ｍ４を乾固した試 を乾固した 料に入れた。
を乾固した試料に入れた。 試料に入れ （ａｔ
９℃） 科に入れた＠（ａｔＱ℃） たｃ、（
ａｔ ９℃）（ａｔ ９℃） ・１↓ ８ 与 ４↓２μｔＤ
Ｍｓ ２μｔＤＭＳ ３０ｕｚヒドラ ３
０μｔヒドラを加え約２４ を加え約４ ジンを加え
約 ジンを加え約分室温で反応 ８分室錫で ３
７分反応さ ５０分反応ささせた。 反応させ
た。 せた◎ せた０甘 ■ ８
■ ４０μｔＤＭ ４０μｔＤＭ ４５０μｔヒト
４５０μｔヒトＳ停止液を Ｓ停止液を ラジン停止
液 ラジン停止液加え次。 を加えた。 を加え
た。 を加えた。
それぞれ、９９．５ ％エタノールを約１ ｍ ｌ加え
てマイナス２０℃冷凍庫に一晩放置しｔＤＮＡを沈澱さ
せた。
てマイナス２０℃冷凍庫に一晩放置しｔＤＮＡを沈澱さ
せた。
１１００００ｒｐで１０分間遠心するととＫより沈澱を
ベレット状にし上澄液を除去した。
ベレット状にし上澄液を除去した。
ペレットを水−エタノール混液と９９．５ ％エタノー
ルで洗浄した・ ２０μｔリン ４０μｔのりン １００μｚｔＭ
１００μｚｘＭ酸ｂｕｆｆｅｒ ＠ｂｕｔｔｅｒ
ピペリジンを ピペリジンをを加え９０ とｌ
Ｏμ荀、５ 加え９０℃の 加え９０℃の℃の熱
浴Ｋ ＮＨＣ６を加 熱浴に３０分 熱浴に３０
分１５分間 え１５分おき 間浴させた０ 間浴
させた。
ルで洗浄した・ ２０μｔリン ４０μｔのりン １００μｚｔＭ
１００μｚｘＭ酸ｂｕｆｆｅｒ ＠ｂｕｔｔｅｒ
ピペリジンを ピペリジンをを加え９０ とｌ
Ｏμ荀、５ 加え９０℃の 加え９０℃の℃の熱
浴Ｋ ＮＨＣ６を加 熱浴に３０分 熱浴に３０
分１５分間 え１５分おき 間浴させた０ 間浴
させた。
浴させ穴。 に振り６０分
間反応させた。
ＮａＯＨ水 ０．３ Ｍ酢酸す 加え凍結乾燥
を溶液を加え トリウム水溶 ２回くり返した。
を溶液を加え トリウム水溶 ２回くり返した。
各試料に１０Ｍ１素水５Ｊｉ液１０μｔを加え９０℃９
０秒処理した後、電気泳動用試料とした。
０秒処理した後、電気泳動用試料とした。
４種類の化学修飾切断を施した３′末端螢光標１＠ＤＮ
Ａを２０１ポリアクリルアミドゲル（４ｏｑｂアクリル
アミド： ５ ｍ ｔ、 １０ ＠濃縮ＴＢＥ液： １
？Ｆ１１．尿素：４．２ｇ、１１過硫酸７７モニウム
： １ ｍ Ａ 、架橋剤としてＴＥＭＥＤ （Ｎ、Ｎ
、 亀Ｎ’ −Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍ
ｉｎｅ ） ３μｔを加えたもの）中で電気泳動（２５
０ボルトで約２時間） し、紫外線ランプをゲルに＠射
し、紫外線カツトフィルターを通して５分間露光して写
真をとった。写真に見られるバンドの中からＤＡＣＭ自
身及びＤ Ａ ＣＭ −Ｕｒｅａ Ｃｏｍ−ｐｌｅｘ
による余分のバンドを除去して描いたものが第１図であ
る。マーカーとしてＢＰＢ （ブロモフェノールブルー
、２０％ゲル中で約ｌＯ塩基に相当）を使用した。
Ａを２０１ポリアクリルアミドゲル（４ｏｑｂアクリル
アミド： ５ ｍ ｔ、 １０ ＠濃縮ＴＢＥ液： １
？Ｆ１１．尿素：４．２ｇ、１１過硫酸７７モニウム
： １ ｍ Ａ 、架橋剤としてＴＥＭＥＤ （Ｎ、Ｎ
、 亀Ｎ’ −Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍ
ｉｎｅ ） ３μｔを加えたもの）中で電気泳動（２５
０ボルトで約２時間） し、紫外線ランプをゲルに＠射
し、紫外線カツトフィルターを通して５分間露光して写
真をとった。写真に見られるバンドの中からＤＡＣＭ自
身及びＤ Ａ ＣＭ −Ｕｒｅａ Ｃｏｍ−ｐｌｅｘ
による余分のバンドを除去して描いたものが第１図であ
る。マーカーとしてＢＰＢ （ブロモフェノールブルー
、２０％ゲル中で約ｌＯ塩基に相当）を使用した。
６メルカプトプリンリボシドリン酸が残っているので、
電気泳動の際下端にバンドをつくる。
電気泳動の際下端にバンドをつくる。
このことを考慮して泳動パターンから塩基配列を読むと
、ＧＴＴＣＧＡＣとなる。Ａ塩基修飾のバンドが重なっ
ていると考えると、使用したオリゴマー （ＣＡＡＧＣ
ＴＴＧ）の塩基配列と一致する。
、ＧＴＴＣＧＡＣとなる。Ａ塩基修飾のバンドが重なっ
ていると考えると、使用したオリゴマー （ＣＡＡＧＣ
ＴＴＧ）の塩基配列と一致する。
以上において、
（Ｄ Ｍ Ｓ ｂｕｆｆｅｒ）は次のものからなる：５
９ｍＭカコジル酸ナトリウＡ（ｐＨ８，０）、１６ｍＭ
塩化マグネシウム、 ０．１ ｍＭＥＤＴＡ２Ｎａ。
９ｍＭカコジル酸ナトリウＡ（ｐＨ８，０）、１６ｍＭ
塩化マグネシウム、 ０．１ ｍＭＥＤＴＡ２Ｎａ。
（ＤＭＳ停正液）は次のものからなる：２．５Ｍメルカ
プトエタノール、 ３、０ Ｍ酢酸ナトリウム、 ０、１ Ｍ酢酸マグネシウム、 ｌ ｍ Ｍ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ２Ｎ１１ 。
プトエタノール、 ３、０ Ｍ酢酸ナトリウム、 ０、１ Ｍ酢酸マグネシウム、 ｌ ｍ Ｍ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ２Ｎ１１ 。
１、 Ｏｒｎｇ／ｍｔ ｔ ＲＮ Ａ ０（ヒドラジ
ン停止液）は次のものからなる：０．３Ｍ酢酸ナトリウ
ム（ＰＨ６，０）、ＩＱｍＭ酢酸マグネシウム、 １ ｍ Ｍ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ２Ｎａ 。
ン停止液）は次のものからなる：０．３Ｍ酢酸ナトリウ
ム（ＰＨ６，０）、ＩＱｍＭ酢酸マグネシウム、 １ ｍ Ｍ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ２Ｎａ 。
０、１ ｎｇ／ｍｔ ｔ ＲＮＡ。
（リン酸ｂｕｆｆｏｒ （ｐ Ｈ７，０） ）は：１０
ｍ Ｍ Ｎ１８２Ｐ０．１ １ｏ ｍ Ｍ Ｎ、２ＨＰＯ４） と’ｅａ合して
Ｐ Ｈ７，０に調製し念ものにＥＤ Ｔ Ａ２Ｎａｅ加え濃ｔ’ｔｏ。
ｍ Ｍ Ｎ１８２Ｐ０．１ １ｏ ｍ Ｍ Ｎ、２ＨＰＯ４） と’ｅａ合して
Ｐ Ｈ７，０に調製し念ものにＥＤ Ｔ Ａ２Ｎａｅ加え濃ｔ’ｔｏ。
１ｍＭとし念もの。
（１０ｆｔ！濃縮ＴＢＥ液）は：
Ｔｒｉｓ 塩酸５４ｇ１ホウ酸２７．５ｇ％ＥＤＴＡ
７．５ ｇを蒸留水５００ｍｔに溶かしたもの（ｐＨ８
，３２）。
７．５ ｇを蒸留水５００ｍｔに溶かしたもの（ｐＨ８
，３２）。
第１図は本発明の実施例の３′末端螢光標＃１！ＤＮＡ
の塩基化学修飾切断泳動パターンを示す図面である。 （ほか１名）
の塩基化学修飾切断泳動パターンを示す図面である。 （ほか１名）
Claims (3)
- （１）Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法にならつて得られ
たＤＮＡ断片を電気泳動等の手段によつて分離し、塩基
配列を決定するにあたつて、ＳＨ基をもつヌクレオチド
三燐酸類似物質をＤＮＡの３′末端にｔｅｒｍｉｎａｌ
ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅ
ｒ−ａｓｅによつて１分子または２分子結合させた後、
ＳＨ基に特異的に結合する螢光色素を結合させることを
特徴とする、螢光色素による化学修飾を目印としたＤＮ
Ａ断片の螢光検出方法。 - （２）ＳＨ基をもつヌクレオチド三燐酸類似物質として
６メルカプトプリン三燐酸、チオグアノシン三燐酸、ま
たは４チオウリジン三燐酸を用いることを特徴とする、
特許請求の範囲第１項の螢光検出方法。 - （３）螢光色素としてＮ−（７−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍ
ｉｎｏ−４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｙｎｙｌ）ｍａ
ｌｅｉｍｉｄｅ、Ｎ−（１−ａｎｉｌｉｎｏｎａｐｈｔ
ｈｙｌ−４）ｍａｌｅｉｍｉｄｅ、Ｎ−（９−ａｃｒｉ
ｄｉｎｙｌ）ｍａｌｅｉｍｉｄｅ、または、Ｎ−（４−
ａｎｉｌｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）ｍａｌｅｉｍｉｄｅを用
いることを特徴とする、特許請求の範囲第１項または第
２項の螢光検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9598885A JPS61254855A (ja) | 1985-05-08 | 1985-05-08 | 螢光色素による化学修飾を目印としたｄｎａ断片の螢光検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9598885A JPS61254855A (ja) | 1985-05-08 | 1985-05-08 | 螢光色素による化学修飾を目印としたｄｎａ断片の螢光検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61254855A true JPS61254855A (ja) | 1986-11-12 |
Family
ID=14152511
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9598885A Pending JPS61254855A (ja) | 1985-05-08 | 1985-05-08 | 螢光色素による化学修飾を目印としたｄｎａ断片の螢光検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61254855A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994024120A1 (en) * | 1993-04-13 | 1994-10-27 | Naxcor | Non-nucleosidic coumarin derivatives as polynucleotide-crosslinking agents |
-
1985
- 1985-05-08 JP JP9598885A patent/JPS61254855A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994024120A1 (en) * | 1993-04-13 | 1994-10-27 | Naxcor | Non-nucleosidic coumarin derivatives as polynucleotide-crosslinking agents |
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