JPS61227792A - 純化したメチオニンアデノシル転移酵素を使用するｓ−アデノシルメチオニンの酵素的合成法 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は高度に純化したＳ−アデノシルメチオニンを調
製するための方法、ならびに該Ｓ−アデノシルメチオニ
ンの調製に使用する実質的に純化したメチオニンアデノ
シル転移酵素調製物およびその調製方法に関する。

〔技術的背景と先行技術〕

アミノ酸はタンパク質の構成要素として役立ち得ること
が仰られている一方で、ホルモンおよび神経伝達物質な
どの様々な生化学物質の前駆体として代謝上、重要な役
割を果たしている。たとえば、アミノ酸メチオニンのメ
チル基は極めて多数のメチル化された生化学物質の生成
に利用されている。メチオニンがメチル供与体として利
用されるためには、メチオニンはまず、アデノシン５−
３リン酸（ＡＴＰ）で活性化されＳ−アデノシルメチオ
ニン（ＳＡ、Ｍ）とならなければならない。

放射線標識したＳ−アデノシルメチオニンは、生合成ア
ミンであるノルエピネフリンおよびヒスタミンなどの種
々の内因性化合物を定置する際に主として用いられる。

従って、放射線標識したＳ−アデノシルメチオニンは重
要な放射線化学物質である。

交感神経系の異常は、多種多様の望ましくない臨床的症
状となって現われることがある。それゆえ、この交感神
経系を十二分にモニターするには、体内における神経ホ
ルモンなど様々な化合物の濃度定置のための正確かつ信
頼できる方法が必要である。さらに、このような化合物
は体内にごく少量しか存在しないので、この方法は極め
て高感度であること、すなわちごく少量の化合物を検知
できるものでなければならない。この様な定置は頻繁に
行なわれるので、実験室条件下で種々の体組織および体
液を分析したとき再現性が高いこと、および診断の迅速
化のため、結果が素早く得られることがさらに必須とな
る。

放射線酵素検定は、種々の生合成アミンの定置において
広範に使用される高感度分析法である。

この検定は、メチル供与体として放射線活性のＳ−アデ
ノシルメチオニンを使用し、適当な酵素によって特定の
化合物を酵素的にメチル化して放射線標識生成物に導く
反応を基礎としている。現在使われている放射線酵素検
定の多くは、ヒト血漿のような重要な生物学的試料中の
カテコールアミンを定量するのに必要なだけの感度を持
っていない。

市販の入手可能な放射線標識したＳ−アデノシルメチオ
ニンは、それを使用するどの放射線酵素検定の感度をも
減少させる、多数の不純物を含有していることがわかっ
た。この化合物の製造元が使用する一般的な合成法は、
比較的に不純であるが容易に製造可能な、メチオニンア
デノシル転移酵素（ＭＡＴ、Ｓ−アデノシルメチオニン
の酵素法合成に使用する酵素）の調製物を使用する。そ
の結果、放射線標識したＳ−アデノシルメチオニン生成
物は、放射線標識された汚染物質を除去し、そしてその
Ｓ−アデノシルメチオニンを放射線酵素検定に適する様
にするため、合成後に厳密な精製全必要とする。Ｓ−ア
デノシルメチオニンの調製および精製に現在使用されて
いる代表的な方法ハ、カント二が教示している［　（ａ
ｎｔｏ旧、バイオケミカル壷プリパレーションズ（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ　）、５
．５８頁（１９５５）およびメンツズ・イン・エンザイ
モロジ−２（ＭＥＴＨＯＤＳＩＮ　　ＥＮＺＹＭＯＬＯ
ＧＹ　２　）、２５４頁、アカデミラグ・プレス（Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ　　）、ニューヨーク（１
９５５）］。また、］Ｓ−アデノシルメチオニをさらに
ｊｉｆ製する方法を、グレーザーおよびピアール〔Ｒ，
Ｌ、Ｇｌａｚｅｒ　　ａｎｄ　Ａ、Ｌ、　Ｐｅａｌｅ　
、アナリテイカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔ
ｉｃａｌＢｊｏｃｈｅｍ　）、旦ユ、５）６頁（１９７
８））が教示している。

〔発明の目的および構成〕

高 本発明は、純度のＳ−アデノシルメチオニンを△ 調製するための改良法に関する。本発明者らは、粗製の
メチオニンアデノシル転移酵素調製物が、これを使って
放射線標識されたＳ−アデノシルメチオニンを酵素的に
合成している間に放射線標識し された不純物の生成を触媒・１従って放射線酵素検△ 定における放射線標識されたＳ−アデノシルメチオニン
の有用性が限定される、ということを見い出した。従っ
て、本発明方法は実質的に純化したメチオニンアデノシ
ル転移酵素を使用スるＳ−７デノシルメチオニンの酵素
的調製法に関するものである。

本発明はＳ−アデノシルメチオニンを酵素的に合成する
ための改良方法であって、実質的に純化シタメチオニン
アデノシル転移酵素調製物をメチオニンアデノシル転移
酵素の供給源として使用し、Ｌ−メチオニンを、触媒量
の該メチオニンアデノシル転移酵素の存在下、適当な緩
衝液中、約２０〜約４０℃の温度範囲で、少なくとも１
モル当量のアデノシン５−３リン酸と反応させることを
特徴とする方法に関するものである。

本発明は実質的に純化したメチオニンアデノシル転移酵
素調製物およびその調製法をも提供するものである。

第１図および第２図はオートラジオグラムである。

第１図は、本発明の製造方法において使用した実質的に
純化したメチオニンアデノシル転移酵素の純度と、カン
ト二［Ｃａｎｔｏｎｉ　、バイオケミカル・プリパレー
ションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｐｒｅｐａ　−
ｒａｔｉｏ’ｓ）、５．５８頁（１９５５）］の方法に
より精製した酵素の純度との比較を示している。この因
で示される結果は、３７℃で６０分間、各酵素それぞれ
を三重水素化したＳ−アデノシルメチオニンとインキュ
ベートすることによって得られたものである。この肉は
、本発明の製造方法において使用した酵素の純度がカン
ト二の酵素に比較して著しく改良されていることを示し
ている。

第２図も本発明の製造方法において使用したメチオニン
アデノシル転移酵素とカント二（上記）の方法で精製し
た酵素との比較を表わす。この因で示される結果は、約
３７℃で３０分間、各酵素それぞれを三重水素化したし
一メチオニンとインキュベートすることによって得られ
たものである。

この因からも、放射線標識された汚染物質数が少ないこ
とから、本発明の！１造方法において使用した酵素の純
度が改良されていることがわかる。

次式： ％式％ 〔式中、ＡＴＰはアデノシン５−３リン酸、ＰＰｉは無
機ピロホスフェートおよびＰｉ　は無機ホスフェートを
表わす〕 は本発明の、Ｓ−アデノシルメチオニンの酵３的合成法
において使用される生化学反応式を表わす。

Ｌ−メチオニンからＳ−アデノシルメチオニン−＼の合
成を触媒するのに使用される酵素は既卸であり、Ｓ−了
デノシルメチオニンシンセダーゼまタハメチオニン了デ
ノシル転移酵素のどちらかである。ここでは後者の酵素
を使用する。本発明者らは、放射線標識されたＳ−アデ
ノシルメチオニンの合成において、実質的に純化した酵
素を使用することにより、生成物の純度が劇的に改良さ
れ、特に放射線酵素検定における用途に適した調製物が
得られることを見い出した。

本発明の方法を使用して標識していないＳ−アデノシル
メチオニンを調製することもできるが、本方法は放射線
標識した物質の合成に使用するのに都合がよい。従って
、ここで使用するゞＳ−アデノシルメチオニン′という
語句は、放射線標識された物質および非標識の物質の両
刃を表わす。

放射線標識したＳ−アデノシルメチオニンハ、典型的に
は、供与メチル基上に二重水素標識を持っているか（化
合物はＳ−（メチル？Ｈ〕−了デノシルーＬ−メチオニ
ンとして仰られる）、または供与メチル基上に〔１４Ｃ
〕炭素原子を持っている（化合物はＳ−〔メチル−１４
０〕−アデノシル−Ｌ−メチオニンとして仰られる）。

これらの放射線標識したメチル供与体は以下の構造式で
表わされる： Ｓ＝［メチル−Ｈ〕−アブ　　　　ｓ−（メチル−１４
Ｃ〕−アゾツノシル−Ｌ−メチオニン　　　　　　シル
ーＬ−メチオニン〔式中、星印１＊）は放射線標識の位
置を表わす〕。

本発明の方法は、適当な緩衝液中で１モル当量のし一メ
チオニンと、少なくとも１モル当量のＡＴＰおよび触媒
ｌの実質的に純化したメチオニンアデノシル転移酵素と
を混合することにより行なう。不純な酵素を使用するＳ
−アデノシルメチオニンの酵素的調製法は当分野でよく
知られており、この一般的な条件を本発明方法にも同様
に使用できる。本発明は、実質的に純化したメチオニン
アデノシル転移酵素を製造過程において使用すること、
および以前に使用されていた酵素が、放射線酵素検定の
ように、感度が重要であるほとんどの用途に使用できな
い様なＳ−アデノシルメチオニンを創製してしまう程不
純であるという認識から成り立っている。

ここで使用するに適当な緩衝液はよく知られており、こ
れらは典型的にはマグネシウムとキレートを形成しない
キャパシティーを有し、使用ＰＨ範囲は約７．０〜約８
．５である。典型的なこのタイプの緩衝液には、１．３
−ビス〔トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノコプ
ロパン（ビス−トリスプロパン）、ビス〔２−ヒドロキ
シエチル〕ビスートリス）、およびＮ−〔ヒドロキシメ
チル△ 〕メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）が挙
げられる。

ここで使用するゞ実質的に純化したメチオニンアデノシ
ル転移酵素′という語句は、放射線酵素検定において決
用するに十分な純度の放射線標識したＳ−アデノシルメ
チオニンを合成する際に使用するの【こ適する、実質的
をこ他の汚染物質を含有せず、かつ十分な純度の卸成を
有する酵素として定義される。十分な純度のＳ−アデノ
シルメチオニンを得るには、本発明の酵素的合成法（こ
おいて使用する酵素の純度に制限があることを、実験的
に測定した。特に、メチル転移酵素類および低分子量の
内因性化合物の除去が、高純度のＳ−アデノシルメチオ
ニンの合成にとって極めて重要である。

メチル転移酵素をメチオニンアデノシル転移酵素（ＭＡ
Ｔ　）から除去せず、このＭＥＴを使用してＳ−アデノ
シルメチオニン（ＳＡＭ）を合成したときは、このメチ
ル転移酵素はＳＡＭの一部との望ましくない反応を触媒
する。この結果、残存するＳＡＭ中に、除去することが
困難な放射線標識した不純物を生じる。同様に、ＳＡＭ
によるメチル化を受けやすい低分子量の内因性化合物を
、ＳＡＭの合成に使用する前にＭＡＴから除去しないと
きには、ＳＡＭの一部はこれらの不純物と反応してしま
う。

咄乳動物のメチル転移酵素類は、通常２５．０００〜３
０．０００　　の分子量を荷する。重要な生合成アミン
類は通常３００前後の分子量を有する。メチオニンアデ
ノシル転移酵素はｓ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏの位の分子量を有
する。従って、分子量３０．０００以下の不純物および
好ましくは分子量５０．０００以下の不純物のすべてを
除去（これはサイズ排除クロマトグラフィーを使用して
行なうことができる）することによって、実質的に生合
成アミン類およびメチル転移酵素を含有しない、実質的
に純化したメチオニンアデノシル転移酵素調製物が得ら
れる。

触媒社の、実質的に純化したメチオニンアデノシル転移
酵素を本発明方法に使用する。本方法において使用する
酵素の正確な社は、その比活性によって異なる。当分野
において通常の卸識を有する者には理解されるように、
実朋的には、標準的な操作条こ従って実質的に純化した
酵素を滴定することによって酵素活性を測定する。本発
明方法においては過剰の酵素を使用することが好ましく
１Ｌ−メチオニンは高価な試薬であるので放射線標識し
たＳ−了デノシルメチオニン合成時には特に好ましいが
、反応物から生成物への最大変換が得られる酵素り）使
用すべきである。

以下に、本発明方法において使用するに適した実質的に
純化されたメチオニンアデノシル転移酵素を得るための
方法を説明する。この操作は、合成課程および放射線酵
素検定において、利用可能なＳ−γデノシルメチオニン
を消耗し、かつそれと競合すると考えられる、競合的な
メチル転移酵素および天然に存在する物質を除去するよ
うに設計されている。

メチオニンアデノシル転移酵素は、専ｐＨ］＝乳動物の
肝臓に偏在しているが、他の組織中にも多少は存在して
いる。酵素を含有する肝臓の代表的な供給源はウサギお
よび特にラットである。

酵素を含有する哺乳動物組織を標準的な操作によって単
離し、たとえば塩化ナトリウムの等張渡に浸漬すること
により、直ちに冷却する。使用時、この溶液の温度を約
０〜約５℃の範囲に保つ。この温度範囲を、この後のす
べての酵素精製過程においても使用する。

このようにして単離した哺乳動物組織は酵素の抽出物を
容易にするため破壊しなければならない。

組織破壊は、超音波破壊のようないくつかのよく知られ
た方法のどれか、組織圧搾法または好ましくは均質化（
ホモジナイズ）によって機械的に行なうことができる。

均質化はいくつかの常法のいずれかによって行なうこと
ができるが、好ましくは始めをこ酵素を含有する組織を
細かく刻んで小さなかけらにし、次いでこのかけらをホ
モジナイザー中で等仮性溶媒と混合することによって行
なう。

ここで使用するに適当なホモジナイザーはブリンクマン
φポリトロン（Ｂｒｉｎｋｍａｎ　　Ｐｏ１ｙｔｒｏｎ
）ｄＪように、混合器（ブレンダー）と池の装ｆｌを備
えている。適当な等仮性溶媒には、ショ糖、塩化マグネ
シウムまたはリン酸ナトリウムあるいはリン酸カリウム
のようなリン酸塩緩衝液が含まれる。好ましい等仮性溶
媒は塩化マグネシウムを含有する等強性の塩化カリウム
溶液である。使用する等仮性溶媒の量は酵素を完全に溶
解するのに十分な置でであるが、好ましくは哺乳動物の
組織試料の約３−１０倍容険の等仮性溶媒を使用する。

次いで組織懸濁液を、約ｉ　０．０００　ｘ　Ｑ〜約６
０，０００ｘｌ　の範囲の強さで約１５〜６０分間遠心
する。好ましくは遠心を約４０．０００ｘｊｌの強さで
約２０分間行なう。混合物の濃度をジチオエリスリトー
ル（ＤＴＥ）の添加により約１ｍＭに調整する。

次いで高分子量の汚染物質を除去するため、押退した上
澄液を５代表的には約１００，０００ｘｇ〜３００゜０
００ｘ＆の強さで約１５〜１２０分間遠心する。

好ましくは遠心を約２２０．０ＯＯＸダ　の強さで約６
０分間行なう。

次いで、このようにして得た上澄液を脂質層除去のため
、代表的にはガーゼでｒ過する。このように調製した上
澄液を分離し、酵素を沈殿させる酵素グレードの固体硫
酸アンモニウム（−塀えてスラリー化する。硫酸アンモ
ニウムによる沈殿の目的は、タンパク質のような／」１
分子のものをすべて除去することおよび同時に酵素調製
物を濃縮することである。硫酸アンモニウムは約５５％
〜約８５％の１度範囲で、より好ましくは硫酸アンモニ
ウムの６５％飽和溶液（酵素調製物１０００ｍ／に対し
硫酸アンモニウム４１３ｙ）が得られる濃度で使用する
。調製物を約５〜約６０分間、好ましくは約２０分間攪
拌し、約４０．０００　ｘ　Ｉで約１゜分間遠心する。

上澄液を除き、沈殿を約７．０〜９．０のｐＨ範囲を有
する適当な緩衝液で懸濁させる。この精製法において使
用するに適当な緩衝液は約７．０〜約９．０の範囲のｐ
Ｈを有し、かつ２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）
−１、３−プロパンジオール（トリス）、ビス−トリス
およびビス−トリスプロパンのようなカチオン緩衝液、
またはリン酸ナトリウムあるいはカリウム等のリン酸塩
のようなアニオン性緩衝液であるべきである。これらの
緩衝液は生化学分野で知られているものであり、市販品
を利用することができる。沈殿物の懸濁に使用する好ま
しいｍ新液は、２５ｍＭ　　リン酸カリウム、１ｍＭの
〔エチレン−ビス（オキシエチレンニトリル）〕四酢酸
（ＥＧＴＡ’）、５ｍＭ塩化マグネシウムおよび１ｍＭ
（７）ＤＴＥの溶液である。

通常、塩化マグネシウムを含まない上記の好ましい緩衝
溶液に対して、溶液を約２４時間透析する。緩衝液の取
り替えが１回必要になることもあり、必要ならそれ以上
取り替えてもよい。

次に酵素調製物をアニオン交換カラムクロマトグラフィ
ーにかける。アニオン交換クロマトグラフィーは２つの
機能を有している。第１番目は、ノルエピネフリン、エ
ピネフリンおよびヒスタミンのようなカチオンはカラム
に結合しないということである。従ってカラムはこれら
の妨害物質の除去に役立つ。２番目は、アニオン交換ク
ロマトグラフィーはタンパク固有のイオン的性質に基き
タンパクを分離するので、精製された酵素調製品が得ら
れるというこａである。

アニオン交換クロマトグラフィーには、セルロースまた
は他の多数のポリマーなとの種々のマトリックスと共有
結合した、たとえばジエチルアミノエチルまたはトリエ
チルアミノエチル基等のアルキルアミンから成るカラム
材料が使用される。

種々のこれらのクロマトグラフィー材料は、市販品を利
用するこさができるが、好ましい材料は、ファーマシア
・ケミカルズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ）から、ジエチルアミノエチル−セファセル（Ｓｅｐ
ｈａｃｅｌ　）として販売されている。

酵素調製物をカラムに入れた後、カラムを先に使用した
ものと同一の緩衝液で溶出する。この緩衝溶出液は典型
的には約２０容量多のグリセリンのようなアルキルジオ
ールを含有している。すべての非吸着タンパクが溶出す
るまで溶出を続ける。

次いで酵素活性体を好ましくは同一の緩衝液で溶出し、
酵素を含有するフラクションを集め、限外押退のような
常法により濃縮する。

次に・この濃縮した酵素調製物を分子サイズ排除クロマ
トグラフィーでさらに精製する。分子サイズ排除クロマ
トグラフィーは、酵素調製物の純度を低下させる、より
小さい分子を効果的に排除する。使用する担体材料は２
つの基準を満たしているべきである。第１番目【こ、分
子量約２００．０００以上の分子を保持しない担体材料
を選択する。これにより高分子量の不純物が始めにカラ
ムから溶出し、除かれる。２番目に、カラムに保持され
る物質に関して、担体材料は１０−１３０．０００ダル
トンの分子量分画範囲を有しているべきである。

こうすることにより、メチル転移酵素が代表的には３０
．０００　　前後の分子ｍを胃しており、かつＭＡＴが
ｇ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏ台の分子Ｉｆｆ有しているので、Ｍ
ＡＴからの内因性メチル転移酵素の除去が容易になる。

分子サイズ排除クロマトグラフィーに使用するクロマト
グラフィー担体材料は容易に入手できるが、好ましい担
体材料はＬＫＢ社〔ガイザーズパーグ（Ｇａｉｔｈｅｒ
ｓｂｕｒｇ　）、メリーランド（Ｍａｒｙｌａｎｄ　）
　：１から市販されているウルトロゲル（Ｕｌ　ｔｒｏ
ｇｅｌ　）　Ａ　ＣＡ−４４である。典型的には、酵素
精製に先だち、カラムを約７．５〜８．５の範囲のｐＨ
を臀する緩衝液で平衡化する。カラムを緩衝液で溶出し
、酵素を含有するフラクションを集める。好ましい緩衝
液は、５ＱｍＭのＴＥＳ　カリウム、５ｍＭ塩化マグネ
シウム、１ｍＭのＥＧＴＡ、１０容１）％のグリセリン
および１ｍＭのＤＴＥ（ｐＨ約８）である。

フラクションがカラムから溶出するとき、酵素活性体の
位置測定のため、通常該フラクションを、ＵＶスペクト
ルおよび酵素検定等いくつかの常法のどれかによって検
査する。このようにして実質的に純化した酵素は本発明
の酵素的合成法に使用するのに適している。

適当な緩衝液中にＡＴＰ％Ｌ−メチオニンおよび実質・
的に純化したメチオニンアデノシル転移酵素を含有する
反応混合物を、約２０〜約４０’Ｃの範囲の温度で約３
０〜１２０分間インキュベートする。好ましくは約３７
℃でＦＪ６０分間反応を行なう。

コノようにして調製したＳ−アデノシルメチオニンは、
当分野における通常の仰識を有する者によく知られた方
法によって、容易に分離することができる。本発明の方
法により調製したＳ−アデノシルメチオニンは純度が同
上しているため、この化合物を精製するための操作は、
従来の精製操作に比べはるかに簡単である。典型的には
反応混合物を、生成物は保持するが未反応のメチオニン
マタはＳ−アデノシルホモシスティン副生成物は保持し
ないカチオン交換カラムに通す。最後に、希塩酸をカラ
ムに通し、Ｓ−アデノシルメチオニン生成物を集める。

このようにして分離した生成物は通常低温で貯蔵して分
解を防ぐ。さらに、安定性を付加するため混合物にエタ
ノールを加えることが好ましい。

精製された酵素は、Ｓ−アデノシルメチオニン汚染物質
の生成を触媒しないため、上記のメチオニンアデノシル
転移酵素精製操作により、本発明のＳ−アデノシルメチ
オニンの酵素的合成法において使用する上での優れた酵
素が得られる◇ここで言う汚染物質は、不純なメチオニ
ンアデノシル転移酵素調製物中に存在するメチル転移酵
素との競合反応によって生成すると考えられている。さ
らに、Ｓ−アデノシルメチオニンからメチル基を受容す
る種々の生合成アミノ類も汚染物質と考えられている（
それによりこの高価な試薬の利用率が消耗する）。従っ
て、実質的に純化した酵素、を使用することにより、高
品質のＳ−アデノシルメチオニンの合成が可能となり、
これにより生成物の厳密な分離操作が不要となる。

次に、加業生産に使用される典型的な規模で、本発明に
よって調製した三重水素化したＳ−アデノシルメチオニ
ンを分離するために設計した操作を挙げる。この２段階
クロマトグラフィー法は、ＳＰ−セファデックス（Ｓｅ
ｐｈａｄｅｘ　）カラムクロマトグラフィーによる三重
水素化したＳ−アデノシルメチオニンの分離、およびそ
れに次ぐバイオ−ゲルＰ−２サイズ排除クロマトグラフ
ィーによる素速い脱塩を包含する。グレーザーおよびビ
ニール（Ｒ，Ｇｌａｚｅｒ　　ａｎｄ　　Ａ、Ｐｅａｌ
ｅ　％アナリイテイカル・バイオケミストリー（Ａｎａ
ｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、立」、５）６−５２０頁〕
は以前に、ｓｐ−セファデックスを使用するカチオン交
換クロマトグラフィーが、メチオニンおよびＳ−アデノ
シルホモシスティンのような構造的に関連した化合物か
らＳ−アデノシルメチオニンの効果的な分離方法である
と報告している。従って、実質的に純化したメチオニン
アデノシル転移酵素を使用して三重水素化したＳ−アデ
ノシルメチオニンを酵素的に合成した後、塩酸を加えて
最終濃度０．２Ｍにして反応を終わらせることができる
。この混合物を直ちにｓｐ−セファデックスカラムにか
け、カラム量の数倍の０．２ＭＭＣｌでベースライン（
Ａ２６０および放射線活性）まで洗浄する。次いで、三
重水素化したＳ−アデノシルメチオニンを０．５Ｍ塩酸
で特異的に溶出する。次いでこの三重水素化したＳ−ア
デノシルメチオニンをバイオ−ゲルＰ−２使用のサイズ
排除クロマトグラフィーによって脱塩する。典型的には
このカラムは、希釈した塩酸または硫酸のような鉱酸お
よび１−５％エタノール（Ｖ／Ｖ　）で予め平衡化して
おく。この様にして、生成物は市販品として包装するの
に適した最も安定な化学的１境中で溶出される。この三
重水素化したＳ−アデノシルメチオニンの濃度は、希釈
するかまたは真空下で濃縮することによって容易に調節
することができる。

要約すると、三重水素化したＳ−アデノシルメチオニン
は、実質的に純化したメチオニンアデノシル転移酵素を
合成反応に使用することにより、簡単な２段階処理で分
離することができる。これに対し、現在の商業的処理法
は、放射線酵素グレードの製品を製造するためには、た
とえばＨＰＬＣ法を使用して厳密な〔３Ｈ″ｌＳ−アデ
ノシルメチオニンの５浄化（クリーンナツプ）＃を必要
とする。

これは、放射線酵素検定においてブランク値を劇的に増
即させる放射線標識した汚染物質の生成を触媒する、不
純なメチオニンアデノシル転移酵素調製物の使用に直接
起因する。ここで開示した分離操作はＳ−アデノシルメ
チオニン分離のための分析的なアプローチを提供しよう
とするものであり、カラム固定相または緩衝液強度を微
妙に変化させることによってより高い効果を得ることも
可能であろうから、特定の操作を開示しようとするもの
ではない。

第１図および第２図は、本発明方法において実質的に純
化したメチオニンアデノシル転移酵素を使用することに
よって得られた優位性を視覚的に説明するものである。

さらに、これらの因は酵素の純度を評価するためのｎｍ
な分析手法の進歩を示している。

第１図は、本発明方法において使用する実質的に純化し
たメチオニンアデノシル転移酵素の調製物中の三重水素
化したＳ−アデノシルメチオニンの相対的安定性を、市
販の三重水素化したＳ−アデノシルメチオニンの合成に
現在使用されている代表的な酵素調製物の場合と比較し
て示したものである。この図を得るために使用した操作
は次の通りである。三重水素化したＳ−アデノシルメチ
オニンを、水、実質的に純化した酵素、またはカント二
の方法〔Ｃａｎｔｏｎｉ　ｓバイオケミカル・　プレバ
レージョン（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｐｒｅｐａｒ
ａｔｉｏｎ）　％　５％５８頁（１９５５）］により精
製した酵素とそれぞれ別の試験管中で混合する。これら
の試験管を２本に複製する。各試験管を約３７℃で約６
０分間インキュベートし、ホウ酸カリウムの添加により
反応を終結させる。生成した水性溶液をトルエン：イン
アミルアルコール（３：２、Ｖ：Ｖ）で抽出し、有機相
を乾燥する。元の水性溶液および抽出有機層の両方から
の２つのサンプリング液をシリカゲルプレート上にスポ
ットし、容置比でクロロホルム８０％、メタノール１７
％、およびエチルアミン７０％と水酸化アンモニウム３
０％から成る溶液を３％含有する溶媒系で展開する。次
いでこのプレートを一７０℃で約１６時間写真フィルム
に感光させ、フィルムを通常の操作に従って現像する。

この操作は螢光強化オートラジオグラフィーとして仰ら
れている。

第２図で示される結果を得るための次の操作は上記操作
と同様である。三重水素化したし一メチオニンを水、過
剰の実質的に純化した酵素またはカント二の酵素のどれ
かとそれぞれ混合する。この試料を３７℃で３０分間イ
ン干ユベートシ、酸、塩基または中性ｐＨの！′ｌ衝水
溶水溶液ずれかを添加することによって反応を終結させ
る。各溶液をトルエン＝イソアミルアルコール（３：２
．ｖ：Ｖ）で抽出し、有機相を乾燥する。各試料を、第
１図について説明したと同様の溶媒系および手法を使用
する薄層クロマトグラフィーによって展開する。

第１図および第２図において行なった研究の結果は、Ｓ
−アデノシルメチオニンの合成時に使用するにはカント
二の酵素の性質が不満足であること、および本発明方法
において使用する酵素が相対的に純粋であることを示し
ている。上記のカント二の方法に従って調製した酵素は
、三重水素化したＳ−アゾンシルメチオニン由来の放射
線標識メチル基を含有する他のアミンに固有の条件下で
、メチル化した生成物に変換される生合成アミン２含有
すると考えられている。さらにこの反応の結果、ホモシ
スティンのようなＳ−アデノシル転移酵素抑制剤が生じ
、それによって利用可能なメチル供与体の踵が激減する
。

以下に、Ｓ−アデノシルメチオニンを調ｉする　　・た
めの本発明方法において使用するに十分な純度のメチオ
ニンアデノシル転移酵素を製造する方法を例示する。　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１メチオニン
アデノシル転移酵素の精製法次の精製手順におけるすべ
ての行程を０〜４℃で行なった。

ウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラット（２００−３００＆
）５匹を除頭して殺し、肝臓を取り出し、直ちに水冷食
塩水中で冷１した。組織（４７，１ｇ）を細かく刻ｈ１
プリン・クマンーポリトロン（ＢｒｉｎｋｍａｎＰｏｌ
ｙｔｒｏｎ　）を使用して５ｍＭ塩化マグネシウムを含
有する塩化カリウム（１，１９％）等張渡を４倍瞳加え
てホモジナイズし、−４ｏ、ｏｏｏｘｙで２０分間遠心
した。次いで上澄液を２２０．０００　ｘ　（ｌ　で１
時間再遠心した。

上澄液をガーゼで濾過し、ＤＴＥを添加して１ｍＭに調
整した。次いで調製物に固体硫酸アンモニウムを加えて
５６％飽和（２，２Ｍ）とすることにより酵素を沈殿さ
せた。４０．０００　Ｘ　ｙで１゜珍問遠心して沈殿を
集め、２５ｍＭ　リン酸カリウム−１，０ｍＭのＥＧＴ
Ａ−５ｍＭ塩化マグネシウム−１，３ｍＭのＤＴＥ（ｐ
Ｈ７，５、緩衝液Ａ）３０ｇｌ口に再懸濁し、塩化マグ
ネシウムを除いた緩衝液Ａ５）に対して１６時間透析し
た。

透析したタンパクＶ、２！Ｏ％のグリセリンを含有する
緩衝液Ａ４００ｘｌで予め平衡化しておいたジエｆ　７
Ｌ／γミノエチル−セファセルカラム（７×１、６　ｃ
ｍ　）にかけた。２８０　ｎｍの吸収がベースラインに
復帰した後、２５ｍＭから２．５０　ｍＭへのリン酸カ
リウム直線グラディエンド１５０ｇ／を使って、約１ｍ
ｌ／分の流出速度でカラムを溶出した。

酵素活性のピークを有するフラクションを集め、ｐＭ−
１０ディアフロ（Ｄｉａｆｌｏ）メンプランを使ってア
ミコン（Ａｍ１ｃｏｎ）限外押退セル中で約１０ｄに濃
縮した。

この濃縮したタンパクを、５０ｍＭのＴＢＳ　　カリウ
ム−５ｍＭの塩化マグネシウム−１ｍＭのｆｉ：ＧＴＡ
−１０−のグリセリン−１ｍＭのＤＴＥ（１）Ｈ８，Ｏ
）で予め平衡化しておいたＡＣＡ４４カラム（９０Ｘ２
ｃＩＩ））こかけた。カラムを３０ｔｘｌ／時間の流出
速度で溶出し、フラクションを６　ｌｌｌづつ集めた。

活性ピークを有するフラクションを集め、１０ｇ１に濃
縮した。このようにして実質的に純化した酵素は、本発
明のＳ−アデノシルメチオニンの酵素的合晒法において
使用するのに適していた。

本発明方法で使用されるメチオニンアデノシル転移酵素
の活性を定遇するために検定法を開発した。この検定法
は、メチオニンアデノシル転移酵素を精製する際、その
活性を測定するための分析上の基盤となり、同時に実質
的に純化したこの酵素を使用して放射線標識されたＳ−
アデノシルメチオニンを合成するための基盤となる。

メチオニンアデノシル転移酵素の活性は、放射線標識し
たＳ−アデノシルメチオニンを合成しようとする本発明
方法で代表される反応体とカテコール−Ｏ−メチル転移
酵素（ＣＯＭＴ）とをカップリングさせること、および
カテコールの放射線標識されたＯ−ヒドロキシアニソー
ルへの変化を測定することによって、放射線法的に測定
することができる。従って、放射線標識された０−ヒド
ロキシアニソールの合成はＳ−アデノシルメチオニン濃
度の正の関数であり、これは、最初の反応中に存在する
メチオニンアデノシル転移酵素の活性態に比例している
。この検定法は、次の反応式二カテコール　　　　　　
　　　　　　　　放射線標識された０−ヒドロ千シアニ ンーノ叶Ｓ−アゾンシ ルホモシスティン で示される生化学的原理を基礎にしている。

次に上記の検定操作について説明する。

メチオニンアデノシル転移酵素の検定 最初の反応混合物７５μｅは次の成分、ＴＢＳカリウム
（ｐＨ８，０）１５．０／ｊ　モ／Ｉ／％　ＥＧＴＡＯ
１５μモル、ＡＴＰ（７グネシウム塩＞０．７５）１％
ル、Ｄ　Ｔ　Ｅ　７５ｎモルおよびＬ−〔メチル−３Ｈ
〕メチオニン（２、５ｆｉ　Ｃｉ　；　０．３　Ｃｉ／
ｍ　）　７．５　ｎモルを含有していり。

メチオニンアデノシル転移酵素２５μｅを添加すること
により反応を開始させた。次に００Ｍ７２５μｇおよび
１）　ｍＭカテコール１０μｌ！を加えることにより２
番目の反応を開始させた。３７℃で１５分間インキュベ
ートした後、２．５Ｍホウ酸カリウム（１）Ｈｌｌ）５
０μｇ　およびインアミルアル：ｌ−ル２．５　％　（
Ｖ／Ｖ　）を含有するヘプタ：／１．２５ｍ１を加える
ことにより反応を終結させた。渦動（ポルテックス）混
合し、１ｓｏｏｘｙで５分間遠心した後、有機相からの
１　ｍｌ量をイコノフルオア〔Ｅｃｏｎｏｆｌｕｏｒ　
、ニュー・イングランド・ニ二一りレア−（Ｎｅｗ　Ｅ
ｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　）製有機計数シンチラ
ント、ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ）、　マサチューセット
（Ｍａｓｓ、）１）０　ｍｌを含有するシンチレーショ
ンバイアルニ移し、次いで液体シンチレーション分光法
で定厘した。

本発明方法において使用される出発原料はすべて既知で
あり、市販品を利用することができる。

たとえば、放射線標識したＳ−アデノシルメチオニンを
調製する際には放射線標識したし一メチオニンを使用し
なければならないが、この原料はニュー・イングランド
串ニユークレア−または了マージャム（Ａｍｅｒｓｃｈ
ａｍ　）のどちらかの市販品を利用することができる。

アデノシン５−三リン酸も多数の生化学品供給会社から
の市販品を利用することができ、筋組織からこの化合物
を単離するための方法も多数発表されている。たとえば
、べ一カ−〔Ｂｅｒｇｅｒ、バイオ午ミカ・エト・バイ
オフイジヵ、アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ、　Ａｃｔａ）、２０．２３頁（１９５６）］を８照
。

【図面の簡単な説明】

＠１図は、水、実質的に純化した酵素、またはカント二
の方法で精製した酵素それぞれと反応させたときの、　
　３Ｈ−８−アデノシルメチオニンの安定性ヲ比較した
オートラジオグラムの模写図である。 第２因は、水、実質的に純化した酵素、またはカント二
の方法で精製した酵素それぞれと反応させたときの、３
Ｈ−メチオニンの安定性を比較したオートラジオグラム
の模写図である。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）触媒量のメチオニンアデノシル転移酵素の存在下
   、適当な緩衝液中、約２０〜約４０℃の範囲の温度でＬ
   −メチオニンを少なくとも１モル当量のアデノシン５−
   三リン酸と反応させることからなるＳ−アデノシルメチ
   オニンの酵素的合成法であつて、該メチオニンアデノシ
   ル転移酵素の供給源として実質的に純化したメチオニン
   アデノシル転移酵素調製物を使用することから成る方法
   。
2. （２）メチオニンアデノシル転移酵素調製物が実質的に
   メチル転移酵素を含有しないものである第（１）項記載
   の方法。
3. （３）メチオニンアデノシル転移酵素調製物が実質的に
   分子量３０．０００未満の分子を含有しないものである
   第（１）項記載の方法。
4. （４）メチオニンアデノシル転移酵素調製物が実質的に
   分子量５０．０００未満の分子を含有しないものである
   第（１）項記載の方法。
5. （５）メチル転移酵素を実質的に含有しないメチオニン
   アデノシル転移酵素調製物。
6. （６）分子量３０．０００未満の分子を実質的に含有し
   ない第（５）項記載のメチオニンアデノシル転移酵素調
   製物。
7. （７）分子量５０．０００未満の分子を実質的に含有し
   ない第（５）項記載のメチオニンアデノシル転移酵素調
   製物。
8. （８）実質的に純化したメチオニンアデノシル転移酵素
   調製物を調製する方法であつて、比較的不純なメチオニ
   ンアデノシル転移酵素調製物をサイズ排除クロマトグラ
   フィーにかけて、該調製物から分子量３０．０００未満
   の分子を実質的に全て除去することから成る方法。