JPS6121560B2

JPS6121560B2 -

Info

Publication number: JPS6121560B2
Application number: JP54111524A
Authority: JP
Inventors: Morio Ikehara
Original assignee: Wakunaga Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Wakunaga Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1979-08-31
Filing date: 1979-08-31
Publication date: 1986-05-27
Also published as: JPS5634697A

Description

【発明の詳細な説明】

〔〕発明の背景１技術分野本発明は、5′―トリホスホリルアデニリル―
（2′―5′）―アデニリル―（2′―5′）アデノシンの
合成的製造法に関連を有する。本発明でいう「5′―トリホスホリルアデニリル
―（2′―5′）アデノシン化合物」とは、オリゴマ
ー化合物、特に二量体である5′―トリホスホリル
アデニリル―（2′―5′）アデノシン（後記化合物
のｎ＝０の化合物からの化合物に相当、
ppp^A2′p⁵′^Aと表示することがある。）、三量体であ
る前記の5′―トリホスホリルアデニリル―（2′―
5′）―アデニリル―（2′―5′）アデノシン（同ｎ
＝１。同ppp^A（²p⁵′^A）₂）および四量体である5′―
トリホスホリルアデニリル―（2′―5′）―アデニ
リル―（2′―5′）―アデニリル―（2′―5′）アデ
ノシン（同ｎ＝２。同ppp^A（²p⁵′^A）₃）、を意味す
るものである。最近、インターフエロン処理した細胞中に蛋白
合成阻害物質が発見され、この物質の構造は、
5′―トリホスホリルアデニリル―（2′―5′）―ア
デニリル―（2′―5′）―アデノシン
（ppp^A2′p⁵′^A2′p⁵′^A）（以下、化合物（）と呼
ぶ）であるとされている（Proc.Natl.Acod.Sci.
U.S.A.第75巻、256（1978年））。すなわち、イン
ターフエロンで処理した細胞の抽出液とアデノシ
ン三リン酸（ATP）およびdsRNAとを数分間培
養すると、抽出液中に存在する酵素の作用によつ
てATPから低分子物質の化合物()が合成され
る。合成された化合物()、すなわちオリゴヌク
レオチド、はエンドヌクレアーゼを活性化するた
めポリソームを形成しているmRNAが分解され
て、蛋白質合成が阻害されるものと考えられてい
る。このような生化学的方法はそれなりの価値があ
ろうが、化合物()が蛋白合成阻害活性を有して
いるところからその制癌剤としての利用を考えれ
ば、化合物()の化学修飾の可能性が拡大される
期待をも含めわその合成的製造法、特に全合成的
製造法、は大いに興味のあるところである。〔〕発明の概要要旨本発明はこの点に解決を与えることを目的と
し、3′―水酸基が０―ニトロベンジル基で保護さ
れた対応5′―モノリン酸化物を5′―トリリン酸化
および脱ニトロベンジル化してこの
ppp^A2′p⁵′^A2′p⁵′^Aを得ることによつてこの目的を
達成しようとするものである。従つて、本発明による5′―トリホスホリルアル
デニル―（2′―5′）アデノシン化合物の製造法
は、3′―水酸基をＯ―ニトロベンジル化により保
護したアデノシン―5′―モノリン酸の（2′―5′）
オリゴマーをピロリン酸による5′―トリリン酸化
に、ついで紫外線照射による3′―水酸基の脱保護
に付すこと、を特徴とするものである。効果本発明によば、3′―水酸基をＯ―ニトロベンジ
ル化により保護したアデノシン―5′―モノリン酸
の（2′―5′）三量体（以下、化合物（―３）と
呼ぶ）から合成的に化合物()が得られるが、一
方この原料化合物（―３）はN₆―アシルまた
はトリチル―3′―Ｏ（ｏ―ニトロベンジル）アデ
ノシン―5′―モノリン酸（以下、化合物()と呼
ぶ）のオリゴマー化およびＮ―アシル基またはト
リチル基の離脱によつて得ることができ、この化
合物()はN₆―アシルまたはトリチル―3′―Ｏ
（ｏ―ニトロベンジル）アデノシン（以下、化合
物()と呼ぶ）の5′―モノリン酸化によつて得る
ことができ、この化合物()はアデノシンのＮ―
アシル化またはトリチル化および生成N₆―アシ
ルまたはトリチルアデノシンの3′―水酸基のベン
ジル化によつて得ることができる。二量体および
四量体についても同様である。従つて、本発明を利用すれば、アデノシンから
全合成物に蛋白合成阻害物質（化合物()）を得
ることができる。〔〕発明の具体的説明１全合成工程アデノシンから化合物()を得る全合成工程中
での本発明の位置づけを示せば、下記の通りであ
る。なお単位工程の部を生化学的方法によつて行
なつてもよいことはいうまでもない。２化合物()の合成本発明によれば、化合物()を5′水酸基のトリ
リン酸化およびニトロベンジル保護基の離脱条件
に付すことによつて化合物()を合成する。１原料化合物() 化合物()は、3′―水酸基がｏ―ニトロベンジ
ル基でベンジル化されているアデノシン―5′―リ
ン酸の（2′―5′）オリゴマー、またはその塩であ
る。このオリゴマーの縮重合度は低く、本発明のオ
リゴマーは二〜四量体である。化合物()の合成の中間体としての用途を考慮
すれば、三量体（前記一般式でのｎ＝１）が適当
である。 5′―水酸基はモノリン酸化されているが、この
リン酸基は適当なカチオンによつて塩の形であつ
てもよい。適当なカチオンとしては、アルカリ金
属、アルカリ土類金属（マグネシウムを含む）、
アンモニウム、トリエチルアンモニウム、エタノ
ールアンモニウム、その他が代表的である。予想
される生化学的利用を考えると、この塩は薬学上
許容される塩であることが望ましいであろう。化合物()は新規物質であり、その製造法は後
記の通りである。２化合物()のトリリン酸化 5′―ヌクレオチドの5′―トリリン酸化に使用可
能な任意の方法を採用することができる。本発明で採用した方法は、ピロリン酸による方
法である。この方法は、好ましくは、化合物()
と１，1′―カルボニルジイミダゾールと反応さ
せ、さらにピロリン酸の塩たとえばトリ―ｎ―ブ
チルアミン塩と反応させることからなる。この方
法は、J.Am.Chem.Soc.87、1785（1965）に述べ
られている。この反応では、ヌクレオチドと１，
１―カルボニルジイミダゾールとからホスホルイ
ミダゾリデートが形成され、それがピロリン酸塩
と反応することからなるとされている。化合物()が3′―水酸基をｏ―ニトロベンジル
基で保護したものである場合についてこの反応の
反応条件の一例を示せば、下記の通りである。上
記文献の教示その他に基いて、使用する試薬の種
類を含めて下記の反応条件を必要に応じて変更す
ることは当業者にとつて容易である。先ず、化合物()（トリエチルアンモニウム
塩）をダウエツクス50×２（ピリジン型）のカラ
ムに通し、トリ―ｎ―ブチルアミンとピリジンを
加えて供沸することにより、ジメチルホルムアミ
ド（DMF）に溶け易いトリ―ｎ―ブチルアンモ
ニウム塩とする。ピリジンで３回、ピリジン―
DMF＝１：１の混液で１回、さらにDMFで１回
共沸した後、DMFに溶かし、１，1′―カルボニ
ルジイミダゾール５培量をDMFに溶かした溶液
を加え、室温で約12時間〜17時間反応させる。原
料消失を紙電気泳動で確認後、約８〜16倍量の
メタノールを加えて、過剰の試薬をこわす。ピロ
リン酸トリブチルアンモニウム10倍量を少量の
DMF溶液として加え、室温で約12時間反応させ
る。電気泳動でイミダゾリデートのスポツトの消
失を確認した後、遠心分離により沈殿（ピロリン
酸イミダゾリウム）を除き、上澄液（DMF溶
液）にメタノールを加えてDMFを共沸留去す
る。なお、上記の反応条件は、下記のような変更す
ることができる。１，1′―カルボニルイミダゾー
ルの代りにメチル化されたイミダゾールを用いて
もよい。またｎ―ブチルアミンの代りにｎ―オク
チルアミンを用いてピロリン酸を可溶化すること
もできる。上記の方法の外に可能な5′―トリリン酸化法と
しては、モルホリンとジシクロヘキシルカルボジ
イミドによつて5′―モルホリノリン酸を形成さ
せ、これに可溶化したピロリン酸塩を反応させて
5′―トリリン酸を合成することもできる。（J.G.
MoffattおよびH.G.Khorana，J.Am.Chem，Soc.
，83、649（1961））。３ニトロベンジル基の離脱上記のようにして5′―トリリン酸化としたの
ち、3′―水酸基を保護していたｏ―ニトロベンジ
ル基を外す。そのための一つの方法は、該トリリン酸化物ま
たはその前駆体ヌクレオチドを波長280〜320nm
以上の紫外線で照射することからなる。紫外線照
射は、被照射化合物が溶液状態にあるようにして
行なうことが好ましい。その場合の溶媒として
は、水が適当である。照射によりベンジル基を外したのちは、エーテ
ル等で洗浄してから、適当な手段を用いて化合物
()を分離回収すればよい。３原料化合物()の合成１化合物()の合成化合物()は、N⁶―アシルまたはトリチル―
3′―Ｏ（ｏ―ニトロベンジル）アデノシン―5′―
モノリン酸（化合物）を脱水剤と反応させてオ
リゴマー構造を形成させ、次いでアデノシンのア
ミノ基を保護していたアシル基またはトリチル基
を離脱させることにより合成される。化合物()
の縮合オリゴマー化を促進すべき脱水剤として
は、たとえばジシクロヘキシルカルボジイミド、
トシルクロリドその他のアレンスルホニルクロリ
ド等がある。N⁶―アシル基またはトリチル基の
離脱のための加水分解条件は、このようにして形
成された（2′―5′）リン酸エステル結合は保存さ
れるように比較的温和なものであるべきである。
N⁶―アシル基を離脱せるためのこのような加水
分解条件の一例は、濃アンモニア水による処理で
ある。本発明は化合物()の製造に関するものではな
いので、化合物()の製造の詳細については同時
提出の特許願(3)の明細書（特開昭56−34699号公
報）に委ねることにする。２化合物()の合成本発明による化合物()の出発原料として使用
される化合物()は、N⁶―アシルまたはトリチル
―3′―Ｏ（ｏ―ニトロベンジル）アデノシン（化
合物()）を5′―水酸基モノリン酸化条件に付す
ことによつて得ることができる。5′―水酸基モノ
リン酸化条件の一例はオキシ塩化リンたとえば三
塩化ホスホリルまたは塩化ピロホスホリルをリン
酸トリ低級アルキル（Ｃ〜Ｃ程度）エステル、た
とえばリン酸トリメチルまたはリン酸トリエチル
中でこのアデノシン化合物と反応させることから
なる。なお、本発明は化合物()の製造に関する
ものではないので、化合物()の製造の詳細につ
いては同時提出の特許願(2)の明細書（特開昭56−
34699号公報）に委ねることにする。各種ヌクレ
オシドのオキシ塩化リンとリン酸トリアルキルと
による5′―ヌクレオチドの合成に関しては、Bull.
Chem.Soc.Japan、Vol.42、3505―3508（1969）
を参考にすることができる。３化合物()の合成一方、化合物()の原料として使用される化合
物()は、N⁶―アシルまたはトリチルアデノシン
をｏ―ニトロフエニルジアゾメタンまたはｏ―ニ
トロベンジルハロゲニドと反応させることによつ
て得ることができる。また、化合物()の原料と
して使用されるN⁶―アシルまたはトリチルアデ
ノシンは、アデノシンを適当なアシル化剤たとえ
ば酸ハロゲン化物、就中酸成分が低級脂肪族モノ
カルボン酸（炭素数４程度以下）たとえば酢酸あ
るいは芳香族モノカルボン酸たとえば安息香酸で
あり、ハロゲンが塩素であるもの、特に塩化ベン
ゾイル、でアシル化することによつて得ることが
できる。N⁶―トリチル化の場合は、置換または
非置換トリチルロゲニドと脱ハロゲン化水素条件
下に反応させればよい。この場合の置換基として
は、低級アルキルおよび低級アルキルオキシ基
（炭素数４程度以下）が適当である。これらの化
合物の合成に関しては、同時提出の特許願(1)の明
細書（特開昭56−34696号公報）を参照された
い。４実験例１ N⁶―ベンゾイルアデノシンの合成（参考
例）アデノシン（1.335g（5m mol））をピリジン
（10ml）に懸濁させ、ピリジンを留去したのちふ
たたびピリジン（33ml）に懸濁させ、塩化ベンゾ
イル（3.5ml（30m mol））を加えて、０℃で撹拌
した。２時間後TLC（展開溶媒クロロホルム：
エタノール＝20：１）で原料の消失を確認したの
ち、０℃で水（５ml）を加えて反応させ、クロロ
ホルム（50ml）で２回抽出した。このクロロホル
ム溶液を５％炭酸水素ナトリウム水溶液（50ml）
で２回洗浄し、さらに水（50ml）で２回洗浄した
のち、クロロホルムを減圧留去した。残査を95％エタノール（30ml）およびピリジン
（15ml）の混合液に溶かし、０℃で５分間撹拌し
た。これに2N水酸化ナトリウム水溶液（45ml）
を加えて０℃で５分間撹拌し、さらに室温で10分
間撹拌した。この反応溶液にDowex50W×２（ピ
リジン型、150ml）を０℃下で加え、その溶液を
Dowex50W×２（ピリジン型、50ml）を充填した
カラムに流した。さらに、20％ピリジン―水
（200ml）で溶出し、溶出液を濃縮した。これをエ
ーテルで洗浄したのち溶媒を減圧留去し、残留物
を水から再結晶した。収量 1.372g（74％）融点 156〜157℃ ２ N⁶―ベンゾイル―3′―Ｏ―（ｏ―ニトロベン
ジル）アデノシン()の合成（参考例）金属ナトリウム（1.84g（80m mol））をメタノ
ール（120ml）に溶解させた溶液に、ｏ―ニトロ
ベンジリデントシルヒドラジン（12.8g（40m
mol））およびトリエチレングリコール（40ml）
を加え、遮光してメタノールを減圧留去した。残査を室温でおよそ40分間放置したのち氷水
（50ml）を加え、クロロホルム（40ml）で３回抽
出した。水（40ml）で３洗浄したのち、−20℃以
下で約20分間冷却してから過した。液を濃縮
し、N⁶―ベンゾイルアデノシン（3.7g（10m
mol））および塩化スズ()・2H₂O（100mg）をジ
メチルホルムアミド（80ml）に溶解させた溶液に
加え、遮光して45℃〜50℃で撹拌した。 12時間後、先の水層からふたたびクロロホルム
（30ml）で３回抽出し、同様の操作をして反応後
に加えた。 24時間後、TLC（展開溶媒クロロホルム：エ
タノール＝10：１）で反応が進行したことを確認
し、ジメチルホルムアミドを減圧留去した。残査
をピリジン（15ml）に溶かし、ｎ―ヘキサン
（800ml）に加えた。一晩放置後、ｎ―ヘキサンをデカンテーシヨン
で除き、残つたアメ状物質をピリジに溶かして回
収し、ピリジンを減圧留去した。残留物をトルエ
ンで共沸したのち、60％エタノール水溶液から再
結晶した。再結晶を数回行なつて、純粋なN⁶―
ベンゾイル―3′―Ｏ―（ｏ―ニトロベンジル）ア
デノシンを得た。さらに、母液を集めて濃縮乾固し、残査を少量
のピリジンに溶解して、シリカゲルカラム
（Merck Ｇ―60、150g）でクロロホルム：メタノ
ール45：１を展開溶媒として2′―Ｏ―ベンジル体
と3′―Ｏ―ベンジル体を分離した。各フラクシヨ
ンを集め、60％エタノール水溶液から再結晶し
た。 N⁶―ベンゾイル―3′―Ｏ―（ｏ―ニトロベンジ
ル）アデノシン収率＝30％融点＝218〜221℃ δppm＝3.68（br，Ｓ，Ｈ―5′，1H），4.22
（brS，Ｈ―3′，4′，2H） 4.90（ｔ，Ｈ―2′，1H）， 6.12（ｄ，Ｈ―1′，1H）， 5.08（ｄ，Ar―CH2―，2H） N⁶―ベンゾイル―2′―Ｏ―（ｏ―ニトロベンジ
ル）アデノシン収率＝18％融点＝101〜103℃ δpm＝3.72（br，Ｈ―5′，1H）， 4.12（ｍ，Ｈ―4′，1H）， 4.50（ｑ，Ｈ―3′，1H）， 4.70（ｔ，Ｈ―2′，1H）， 6.28（ｄ，Ｈ―1′，1H）， 5.06（ｄ，Ar―CH₂―，2H）３ N⁶―ベンゾイル―3′―Ｏ―（ｏ―ニトロベン
ジル）アデノシン―5′―リン酸()の合成（参考
例）リン酸トリエチル（８ml）と塩化ホスホリル
（0.8ml（8m mol））とを混合し、氷冷下に撹拌し
た。15分後、N⁶―ベンゾイル―3′―Ｏ―（ｏ―ニ
トロベンジル）アデノシン（1.013g（2m mol））
を加え、氷冷下に撹拌を続けた。２時間後、紙
電気泳動法で原料の消失を確認し、反応液を飽和
炭酸水素ナトリウム水溶液（200ml）に加えて反
応を止めた。1NHClでPH３に調整し、析出した白
沈を去して、液を活性炭カラム（40ml）に加
えた。白沈をさらに少量の0.001NHClで洗い、洗
液を活性炭カラムで処理した。すなわち、カラム
に水を流して十分洗浄したのち、ピリジン：95％
エタノール：水＝５：50：45の溶液で溶出した。
溶出した溶液を濃縮、乾固し、白沈と合わせて水
に溶かして、DEAE Sephadex Ａ―25のカラム
を用い、重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液を
０〜0.5Mのグラジエントで合計２リツトルで溶
出し（18ml／12分）、分離、精製した。収率＝64％ UV＝λ_nax230nm（シヨルダー） 279nm λ_nio248nm 紙電気泳動（PH7.5）Apに対する移動＝
0.98 イオン交換クロマトグラフイーにおける溶出
塩濃度＝0.094M ４ N⁶―ベンゾイル―3′―Ｏ―（ｏ―ニトロベン
ジル）アデノシン5′―リン酸()の縮重合（参考
例） N⁶―ベンゾイル―3′―Ｏ―（ｏ―ニトロベンジ
ル）アデノシン5′―リン酸（0.89g（1.53mM））
をピリジン（５ml）に溶かし、３回共沸したお
ち、Dowex50W×２（ピリジン型1.5g）を加え、
ピリジン（５ml）で２回共沸し、ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド1.29g）を加えて、ピリジン、
ピリジン：ジメチルホルムアミド＝１：１混液、
およびジメチルホルムアミド各５mlで１回ずつ共
沸した。さらに、ジメチルホルムアミド（３ml）
に溶かし、およそ0.5mlまで濃縮してから30℃で
放置した。 15日後、50％ピリジン水溶液（20ml）を加えて
反応を止めた。４時間後、ｎ―ヘキサン（20ml）
を加え、析出物を取し、液からｎ―ヘキサン
を除いた。さらに、ｎ―ヘキサン（20ml）で２回
洗浄したのち、水―ピリジン層を留去した。これ
をピリジン（７ml）で３回共沸したのち、ピリジ
ン（５ml）に溶かし、無水酢酸（６ml）を加え、
30℃で２日間放置した。この反応液に、氷冷下に
水（５ml）を加え、溶媒を留去したのち、50％ピ
リジン水溶液（10ml）を加えて一晩室温で放置し
た。溶媒を留去し、ピリジン（10ml）に溶かし、
濃アンモニア水（30ml）を加え50℃で放置した。３時間後に溶媒を留去し、水（15ml）を加えて
溶かし、エーテル（10ml）で３回洗浄した。一旦
溶媒を留去し、水（350ml）に溶解させて、
DEAEセルロースのカラム（φ3.2×47cm＝378
cm³）に加え、重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝
液を０〜0.5Mのグラジエントで合計10リツトル
で溶出した。各フラクシヨンは、光照射後にペー
パークロマトグラフイーにより単一のスポツトを
与えることにより調べた。各鎖長は光照射後、
BAP（Bacterial alkaline、phosphatase）処理で
5′―端リン酸を水解したものについてVPD
（Venom phosphodiesterase）水解を行ない、生
じるアデノシンとアデノシンリン酸の比より決定
した（表１）。

【表】生成物の物理化学的性質（BAP処理前および
後のペーパークロマトグラフイーでのRf値の比
較、UV吸収特性、ハイポクロミシテイー、ε値
および電気泳動特性）は、下表に示す通りであ
る。生成物のオリゴマーは式ｐ^A（²p⁵′^A）_nで表示
されており、ｍは１〜３であつて、これはそれぞ
れ化合物()でｎが０〜２の場合に相当する。

【表】５ 3′―水酸基の保護基がｏ―ニトロベンジル基
である5′―モノリン酸化アデノシンの5′―トリ
ホスホリルアデニリル―（2′―5′）―アデニリ
ル―（2′―5′）―アデノシンの合成（実施例）各オリゴマーのトリエチルアンモニウム塩を
Dowex50W×２（ピリジン型）のカラムを通した
のち、トリ―ｎ―ブチルアミンとピリジンを加え
て共沸することによりトリ―ｎ―ブチルアンモニ
ウム塩とした。ピリジン（２ml）で３回、ピリジン：DMF＝
１：１の混液（２ml）で１回、さらにDMF（２
ml）で１回共沸したのち、DMF（0.5ml）に溶か
し、１，1′―カルボニルジイミダゾール５倍量を
DMF（0.5ml）に溶解させた溶液を加え、室温で
１晩反応させた。 12時間後、紙電気泳動法で反応の進行を調
べ、原料が残つている場合は１，1′―カルボニル
ジイミダゾールのDMF溶液を同量追加し、さら
に４時間反応せた。原料の消失を確認したのち、
８倍量のメタノールを加えて過剰の試薬を分解し
た。室温で１時間放置後、ピロリン酸トリブチル
アンモニウムの10倍量のDMF（0.5ml）溶液を加
え、室温で放置した。一夜放置後、紙電気泳動法で反応の進行を調
べ、イミダゾール体と思われるスポツトの消失を
確認し（残つている場合には、さらに同量のピロ
リン酸を加えて一夜放置）、遠心分離により沈殿
を除き、さらに沈殿をDMF（２ml）で２回洗浄
した。DMF溶液を集めてメタノールを加え、
DMFを共沸留去した。残渣を水（18ml）に溶かし、３時間紫外線照射
してｏ―ニトロベンジル基をはずし、エーテル
（10ml）で２回洗浄後、半量をペーパークロマト
グラフイー、などの定性に用い、半量はペーパー
クロマトグラフイーさらに紙電気泳動法を行な
つて分離、精製した。生成物の物理化学的性質（ペーパークロマトグ
ラフイーでのRf値の比較、UV吸収特性、ハイポ
クロミシテイー、ε値、および電気泳動特性）
は、下表に示す通りである。5′―トリホスホリル
アデニリル―（2′―5′）アデノシン化合物は式
ppp^A（²p⁵′^A）_nで表示されており、ｍは１〜３で
あつて、これははそれぞれ前記化合物()でｎが
０〜３の化合物に相当する化合物()を示す。

【表】

Claims

【特許請求の範囲】１ 3′―水酸基をＯ―ニトロベンジル化により保
護したアデノシン―5′―モノリン酸の（2′―5′）
オリゴマーをピロリン酸による5′―トリリン酸化
に、ついで紫外線照射による3′―水酸基の脱保護
に付することを特徴とする。5′―トリホスホリル
アデニリル―（2′―5′）アデノシン化合物の製造
法。２ 5′―トリリン酸化が該オリゴマーを１，1′―
カルボニルジイミダゾールと反応させ、さらにピ
ロリン酸塩と反応せることからなる。特許請求の
範囲第１項記載の方法。３ 3′―水基の脱保護が該オリゴマーのトリリン
酸誘導体を280〜320nmの波長の紫外線で照射す
ることからなる、特許請求の範囲第１項または第
２項記載の方法。４オリゴマーが二〜四量体である。特許請求の
範囲第１〜３項のいずれか１項に記載の方法。５オリゴマーが三量体であり、生成5′―トリホ
スホリルアデニリル―（2′―5′）―アデノシン化
合物が5′―トリホスホリルアデニリル―（2′―
5′）―アデニリル―（2′―5′）―アデノシンであ
る、特許請求の範囲第１〜４項のいずれか１項に
記載の方法。