JPS61205217A - γ‐グルタミン酸単位を有する高システインペプチド、その製造方法および用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明はｒ−グルタミン酸単位を有する高システィン
ペプチドに関する。

動物源（金属チオネイン）の比較的高開会のアミノ酸シ
スナインを有する蛋白質のアミノ酸は互いにα−ペプチ
ド結合により結合されている。このような金属チオネイ
ンはかなりの量の重金属を結合することが１き、かつそ
のような重金属１含有する微生物における解毒または汚
染除去を促進すると推定されている（これに関してはＫ
ａｇｉ。

Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、８９，１８３９．（１９８１）を
参照）。

さらＫ、酵母の分解から得られる式： ％式％ を有するペプチドはＡｇｒｉ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、４
９，７１　。

（１９８５）から公知ｔある。

本発明の目的は、以下にフィトケラチンｐｈｙ　ｔ。

ｃｈｅｌａｔｉｎｅ）として表わし、次のアミノ酸配列
：Ｎｌ（＋−（ｙ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ）　−Ｇｌｙ−ＣＯ
Ｏ−６ｎ （式中ｎは４伽７の整数、γ−Ｇｌｕはｒ−グルタミン
酸を表わし、Ｃｙｓはシスティンを表わし、Ｇｌｙはグ
リシンを表わす）。

Ｋより特徴づけられるペプチドを提供することにある。

本発明によるペプチドは次の構造式： ％式％ 忙より示される。

本発明の別の目的は金属カチオン含有を有するフィトケ
ラチンを提供するととＫある。基本的Ｋ、これは相当す
るフィトケラチンのチオレート基との配位結合中は導入
しうるすべての金属カチオンを包含する。例を挙げると
、特に鉛、スズ、ビスマス、チタン、パメジウム、モリ
ブデン、マンガン、コバルト、ニッケル、鉄、銅、銀、
金、白金、／ぐラジウム、亜鉛、力Ｐミクム、水銀、ウ
ラン、ヒ素およびセレン金属のカチオンがある。

もちろん、金属含量はチオレート基に配位結合したカチ
オンの原子価に左右される。金属含量は１〜４モルフあ
り、２価のカチオンについては金属含量は通常フィトケ
ラチン１モル当り′２モル１ある。

本発明によるフィトケラチンは植物材料を抽出すること
に′よ・り得ることが１きる。基本的に、植物材料は下
等ないし高等植物の両方を包含する。

しかしながら、好ましくは被子植物、特に双子葉の被子
植物がその入手が容易！あるという理由から用いられる
。

フィトケラチンを得るためた例として次の植物材料が挙
げられる二 Ａｐｏｃｙｎａｃｅａｅ科、特にＣａｔｈａｒａｎｔｕ
ｓ　ｒｏｓｅｕｓ。

Ｒａｕｗｏｌｆｉａ　５ｅｒｐｅｎｔｉｎａ、Ｒｈａｚ
ｙａ　５ｔｒｊｃｔａ：Ｂｅｒｂｅｒｉｄａｃｅａｅ科
、特にＢｅｒＭｒｉｓ　５ｔｏｌｏｎｉｆｅｒａ：Ｂｒ
ａｓｓｉｃａｃｅａｅ科、特にＴｈ１ａｓｐｉ　ａｌｐ
ｅｓｔｒｅ：Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ科、特に
３ｉ１ｅｎｅ　ｃｕｃｕｂａｌｕｓ：Ｐａｐａｖｅｒａ
ｃｅａｅ科、特にＦｕｍａｒｉａ　ｐａｒｖｉｆｌｏｒ
ａ：Ｐａｎｕｎｃｕｌａｃｃｉａｅ科、特にＴｈａ　１
　ｉｃｔｒｕｍ　ｄｆｐｔｅｒｏｃａｒｐｕｍ：Ｒｕｂ
ｉａｃｅａｅ科、特にＧａｌ　ｉｑｍ　ｍｏｌ　ｌｕｇ
ｏ：ｋｓａｃｅａｅ科、特ＫＲｏａａ　ｃａｎｉｎａ、
Ｍａｌｕｓ　５ｉｌｖｅｓｔｒｉｓ　；５ｏｌａｎａｃ
ｅａｅ科、特にＳｏｌａｎｕｗ　ｍａｒｇｉｎａｔｕｖ
ｌ、。

Ｎ１ｃｏｔｉａｎａ　ｒｕｓｔｊｃａ：Ａｓｔｅｒａｃ
ｅａｅ科、特にＥｃｈｉｎａｃｅａ　ｐｕｒｐｕｒｅａ
　；およびＡｐｉａｃｅａｅ科、特にＡｎｅｔｈｉｕｗ
　ｇｒａｖｅｏｌｅｕｓ　　からの植物材料。

好ましくは、これらの植物の細胞培養物が植物材料とし
て用いられる。しかしながら、分化した植物または植物
の部分もまた本発明のペプチドを得るために用いること
ができる。

植物中でのフィトケラチンの形成は該植物を少なくとも
１種の金属または金属塩１処理することｋより誘発され
る。この処理は植物が金属または金属カチオンを吸収さ
せることの１きる適当な方法１行うことがｆ（きる。好
ましくは、フィトケラチンの形成は細胞培養物を水性系
において金属塩溶液！処理することにより誘発される。

典型的には、その手順は次のとおりである：細胞材料を
金属塩溶液中マ培警し、それによって急性植物毒性以下
！ある金属濃度を維持する。金属濃度の下限は約１μモ
ル／ｌである。上述したように、上限は含有される金属
カチオンの植物毒性に大きく左右される。金属濃度は１
００ｍモル／Ｉまｆ及ぶことが１きる。好ましくは、金
属濃度は１０μモル／ｌ〜１ｒＩＬモル／ｌの範囲であ
る。

したがって、フィトケラチンを得るために、金属または
金属カチオンの存在下で培養された植物材料を用いるこ
とが好ましい方法ｆある。

植物材料は植物からのペプチドの抽出を許容する方法を
用いることにより抽出される。典型的には、植物または
細胞培養物が破壊される方法が用いられる。そのような
方法に関して、植物材料は例えば液体窒素１冷凍され、
必要ならば粉砕され、最後に水性のわずかにアルカリ性
の製剤中に取り込ませることが有利である。該水性製剤
のｐＨが７．５〜９．５の範囲内！あるならば最も有効
ｆある。

しかしながら、１〜６０比を有する製剤も同様に使用す
ることが１きる。しばしば特有の比範囲に適した緩衝液
が水性製剤として用いられろ。

分解されていない植物材料を分離した後、もし存在する
ならば抽出物をさらに処理する。抽出物をまず例えばイ
オン交換体上ｆ凍結乾燥またはペプチドの吸収により濃
縮し、次い１溶離するならば最も有効である。

その後、共抽出された蛋白質は、電解質、例えば硫酸ア
ンそニウム溶液を添加することにより沈殿させる。本発
明によるペプチドは沈殿工程の開港液中に留まる。最後
に、付加的な精製工程、例えば限外濾過、ゲル濾過また
は硫酸銅溶液によるフィトケラチンの沈殿を行ってもよ
い。各場合において、溶離液は金属チオレートに対する
典型的な吸収蕾に従うＵＶ測定に基づき、かつ必要なら
ばＳＨ官能基の定量検出により（例えば、ＥＪＪｍａｎ
試薬を用いて）選択してもよい。

植物材料がアルカリ媒体に取り込まれるか又は導入され
た場合には、フィトケラチンは相当する量の金属イオン
を用いて製造される。遊離のペプチドは例えば金属カチ
オンを酸性化し、沈殿（例えばＨ２Ｓ沈殿）することに
より得ることが１きる。

あるいは、金属カチオンを担持したペプチドは例えば錯
化剤（例えばエチレンジアミンテトラアセテート）の助
けによって金属含量を除去してもよい。

植物材料が酸性製剤中に取り込まれる場合には、ペプチ
ドは金属カチオン含量なしに得られる。

原則として、式 ％式％ の本発明のペプチドは混合物として得られ、それによっ
て誼ペプチド ＮＨ３”　−（ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ　）４−Ｇｌｙ−Ｃ
ｏｏ　−は本発明によるペプチド中の主成分１ある。多
くの場合、この単位の頻度は長鎖ペプチド量の６〜８倍
現われる。

本発明によるペプチドの全量に基づいた、ペプチド混合
物の％としてのペプチド単位の典型的な頻度分布は次の
データから導くことが１きる。

７Ｇ　−９０モル％　（ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ　）４−Ｇ
ＩＹ５−１５モル％　（ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ　）５−Ｇ
ｌｙ２−１０モル％　（γ−Ｇｌ　ｕ　−Ｃｙ　ｓ　）
６−ＧＩ　ＶＯ，１−５モル％　（ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ
　）７−Ｇｌｙさらに、該混合物は上記のそル％データ
を考慮していない、類似した短鎖ペプチド、特に（γ−
Ｇｌｕ−Ｃｙｓ　）３−Ｇｌｙ、および（ｒ−Ｇｌｕ−
Ｃｙｓ）２−Ｇｌｙを含有してもよい。

所望ならば、ペプチドは広く知られた方法により分離す
ることが１きる。そのような方法の例として、とりわけ
高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）　、ゲル濾過
、クロマトグラフィーまたはイオン交換体が包含される
。

本発明のペプチドは個々に混合物中ＩＣ（すなわち成分
として）またはペプチド組成物を処方するために用いら
れてきたタイプの製剤の形ｆ用いることが１きる。例え
ば、公知の技術によって、本発明によるペプチドは担体
材料上に物理的または化学的に吸着させることが！きる
。そのような担体材料の例として、とりわけアルギン酸
塩、官能基（例えばオキシラン基）を有するアガロース
、セルロース、ポリアクリル酸樹脂、ガラス、ケイ酸塩
が挙げられる。本発明によるペプチドは急性および慢性
の重金属中毒を治療するための薬剤の形〒使用すること
ができる。あるいは、金属カチオンを含有させた本発明
のペプチドはまた金属欠損症状の治療のためｋ、または
相当する金属（例えば鉄、亜鉛）のホメオスタシスを維
持するために用いることができる。

他の応用は環境保護、例えば重金属で汚染された廃水の
処理の分野に存在する。

なお、本発明によるペプチドは水溶液から有価金属を富
化するために用いることができる。

さらに、重金属を含有させた本発明のペプチドは相当す
る抗体を得るために用いることができ、該抗体はそれぞ
れ植物が重金属を含有せしめられる範囲を決定するため
の診断剤として利用できる。

本発明を以下の実施例により一層詳しく説明するが、し
かしそれらの例は例示のために記載したもの１あって、
本発明を限定するもの１はない。

例１ Ｒａｕｗｏｌｆｉａ　５ｅｒｐｅｎｔｉｎａの細胞培養
物１０００１１（５３ＩＩの乾燥重量に相当する）を３
００μモルの硫酸カドミウム溶液３Ｉ中で連続的に振と
うしながら５日間培養した。続いて、細胞培養物を収穫
し、蒸留水１洗浄し、液体窒素中１凍結させた。その後
、粉砕された細胞培養物をｐＨＬ６の緩衝液５００ｇＩ
ＬＩ（トリヒドロキシルメチルアミツメクン／ＨＣｊ／
２−メルカプトエタノールの１０ｍモル水溶液）中に懸
濁させた。

次い１懸濁液を遠心分離した。上澄み層を再びｐＨ８，
６Ｋ調整し、伝導率が＜ＩＮＳになるように希釈した。

その後、上澄み層をアニオン交換体力？Ａ（Ｊ）エチル
アミノ−エチル−７がローヌカ２ム）中を通過させた。

続いて、溶離を水溶液（ＮａＣｊＯ，５モル／ｌ、トリ
ヒドロキシルメチルアミノメタン／　ＨＣｌ　１０　ｖ
ａ％ＡＩ／ｊ：ｐＨ＝８．６）Ｍ行った。蛋白質を沈殿
させるために、固体の硫酸アンモニウムを飽和度が８５
％に達するま一１！該溶離液に添加した。その後、その
混合物を遠心分離し、上澄み層を限外−過することによ
り硫酸アンモニウムを除去し、次い”ｌ’１５１１１に
濃縮した。

最後に、濃縮した溶液をｐＨ７でゲルー過（Ｓｅｐｈａ
ｄｅ−Ｇ−５０＊Ｐｈａｒｍａｃｊａ　Ｃｏ、、Ｕｐｐ
ｓａｌａ。

スクエーデン）Ｋ付した。、ｐＨは酢酸アンモニウム溶
液１溶離することにより、小割合の高分子量蛋白質がま
ず得られ、次い１所望のベプチｒが得られた。

゛　　溶離液を凍結乾燥した後、２００■のペプチド混
合物が得られた。力Ｐミウム含量は１＆７ｗｔ％であっ
た。

例２ 例１に従って得られたペプチド混合物１００ｑをＱ、０
１Ｎ塩酸２篤Ｉに溶解させた。ガス状の硫化水素を該溶
液に導入し、硫化カドミウムの沈殿を生成させた。続い
て、遠心分離を行い、上澄み層を凍結乾燥した。金属を
含有しないペプチド混合物８４謂ｔが得られた。

皺ペゾチド混合物を１逆相”カラム（ＮｕｃＪｅｏｓｊ
　ＩＣ−１８，１０μ町Ｍａｃｈｅｒｅｙ　＆　Ｎａｇ
ｅｌ、Ｄｕｒｅｎ、西ドイツ）上のＨＰＬＣｌｃより分
離した。この混合物は次の組成を有していた。

４４．９モル％　Ｎ）（’：　−Ｃｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ
）ｓ二Ｇｌｙ−ＣＯＯ−４７，６％ル％ＮＨ１−（ｒ−
Ｇｌｕ−ｃｙＳ）４−Ｇｌｙ−ａＸ）−＆６モに４　　
Ｎ＜　−（ｒ　　Ｇｌｕ−θｒｓ）５−Ｇｌｙ−ＣＯＯ
−１，７！ル４Ｎ川（ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ）６−Ｇ１ｙ
＝ｃＯｏ−Ｑ、ｌ　−Ｔ−ル％　ＮＨｉ　−（ｒ−Ｇｌ
ｕ−Ｃｙａ）、−０１ｒＣＯＯ−例ろ 金属を含有しないペプチド混合物（例２による）５０■
を０．０１　Ｎ塩酸２　ｘｉに溶かし、１モル溶液の形
の硫酸鉄２５０μそルと混食した。この混合工種は窒素
雰囲気中１行われた。続いて、この混合物を０．０１Ｎ
苛性ソーダ溶液（ｐＨ＝７．５）″Ｉ？中和した。

こうして得た溶液を最後に７ガロースカラム［Ｆ］ （Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　
Ｃｏ−ｐＵｐｐｓａｌａｓスウェーデン）に導入した。

水で溶離し溶離液を凍結乾燥した後、鉄を含有するペプ
チド混合物が５０■の収量で得られた。

本発明のわずか数個の態様および例を記載したが、本発
明の精神および範囲を逸脱することなく多くの変形およ
び変更が可能ｆある。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）式 ＮＨ＾＋＿３−（γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ）＿ｎ−Ｇｌｙ−
   ＣＯＯ−（式中、ｎは４〜７の整数である） で示されるアミノ酸配列からなることを特徴とするペプ
   チド。
2. （２）金属カチオン含有量がペプチド１モル当り１〜４
   モルである特許請求の範囲第１項に記載のペプチド。
3. （３）ａ）植物材料を金属塩の作用下で培養し、ｂ）上
   記ａ）工程からの植物材料を抽出することを特徴とする
   式 ＮＨ＾＋＿３−（γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ）＿ｎ−Ｇｌｙ−
   ＣＯＯ−（式中、ｎは４−７の整数である） で示されるアミノ酸配列からなるペプチドの製造方法。
4. （４）得られたペプチドから、沈澱反応および／または
   錯体形成反応により含有金属を除去する特許請求の範囲
   第３項に記載の製造方法。
5. （５）式 ＮＨ＾＋＿３−（γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ）＿ｎＧ１ｙ−Ｃ
   ＯＯ−（式中、ｎは４〜７の整数である） で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを重金属含有
   化学的または生理的な的系から重金属を除去するために
   使用すること。
6. （６）特許請求の範囲第２項に記載のペプチドを生理学
   的系内のホメオスタシスを維持するために使用すること
   。