JPS61201160A - クロマトグラフイ用充填剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の利用分野 本発明はアデニンを有するポリマーまたはオリゴマーを
そのアデニン含有量および配列の順序に基づキ、液体ク
ロマトグラフィの手法により迅速に分離するために好適
なカラム充填剤に関する。

従来技術 核酸および核酸塩基を含有するポリマーおよびオリゴマ
ーの分離分析方法としてはゲル電気泳動法、イオン交換
クロマトグラフィ法および逆相クロマトグラフィ法等が
使用されているが、電気泳動法およびイオン交換クロマ
トグラフィ法では、核酸の分子量または核酸構成部分の
うち塩基ではなく、りん酸部分の陰イオンとしての性質
を利用して分離するため、重合度による分別はよい分離
能を示すが、構成塩基の種類に基づく分離はモノマー以
外は十分な分離ができていない。

［例えばＵ、Ｆ４　Ｌｏａｎｉｎｇ　　Ｂｉｏｃｈｅｍ
、Ｊ、、　１０２２５１（１９６７）およびＧ、Ｔ、Ａ
ｓｔｅｒｉａｄｉａ　ａｔ　ａｌ−。

ＡｎａミＢｉｏｃｈｅｍ、、　ＩｃＩ　６４　　（１９
７６）　］一方、逆相クロマトグラフィ法による分離に
おいては、主に構成塩基と固定相との疎水性相互作用の
相違が分離機構に大きく影響しているが、塩基間の疎水
性の差は比較的小さなものであり、上記の方法による核
酸フラグメントの分離と同様に構成する核酸塩基の数に
よる分離については有効であるが、特定の塩基の含有量
に基づく分離は期待できない。〔例えばＲｏＤ、　Ｙｅ
ｌｌｓ、　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　］
！ｉｍｙｍｏｌｏｇｙ　６５　５２７　（１９８０）　
）発明の目的 本発明は核酸塩基であるアデニンを含有するポリマーま
たはオリゴマーをその含有数量に基づいて分離する液体
クロマトグラフィ用充填剤を提供することにある。

発明の概要 本発明者らは、核酸塩基を有する種々のポリマーおよび
オリゴマーを用いて、核酸塩基の分子内。

分子間相互作用について研究を行なってきた。

〔例えばに、Ｔａｋｅｍｏｔｏ、　Ｙ、　Ｉｎａｋｉ、
　　Ａｄｖ、　ＰｏｌｙｍｅｒＳｃｉ、、旦　１（１９
８３））その中でも、アデニンとチミン間の特異的水素
結合に基づく分子間相互作用は特に注目に値いするもの
であった。

これら塩基間の相互作用をクロマトグラフィに応用する
ことにより、種々の塩基の分離および特定の塩基の含有
量に基づく選択的分離に利用できる可能性が考えられる
。すでに、近藤らによって核酸塩基を有するポリエチレ
ンイミンをシリカゲルにコーティングして高速液体クロ
マトグラフィに利用して、種々の塩基モノマーの分離に
成功している。〔例えばＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｌ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ　５ｕｐｐｌ＋。

上、ｌ　１２５　　（１９８１））ｏ’Ｌかし、単にコ
ーティングした充填剤は固定相が溶出し種々の溶離条件
への適用に制限がある。

本発明は光学活性リシンポリマーの側鎖にチミンをグラ
フトして得たポリマーをシリカゲルに化学結合し、剛直
な光学活性リシンポリマーの螺旋構造の周囲に核酸塩基
が規則的に配列した構造をとる固定相、さらに、広いｐ
Ｈ範囲でこの構造が保てるようにグラフトしたチミンを
光二量化して得られた固定相を用意することにより、塩
基間の相互作用には有利に、かつ、幅広い溶離条件に対
応できろようにした液体クロマトグラフィ用充填剤であ
る。

発明の構成 本発明における光学活性リシリポリマーはモノマ一単位
がＬ−リシンまたはＤ−リシン単独からなる重合度８以
上のペプチドまたはその誘導体である。重合度が８未満
では剛直な螺旋構造を形成し難いため好ましくない。な
お、重合度の上限は分離する試料の分子量あるいはシリ
カゲルの細孔径およびシリカゲル表面積の容量関係から
１００が好ましい。

このペプチドの合成法としては、一般に酸塩化物法、ア
ジド法、混合酸無水物法、活性エステル法。

インシアナート法、ホスファゾ法、亜すン酸エステル法
、酸化還元法、Ｎ−カルボキシ無水物法などの通常の合
成法が使用できる。この中でもホモポリマーの合成には
操作の簡便さ、ラセミ化の生じ難さ、収率のよさ１重合
度の調節の容易なアミンを開始剤とするＮ−カルボキシ
無水物法が好ましい。用いる光学活性リシンの６位アミ
ン基の保護基は一般に使われているベンジルオキシカル
ボニル基ｓ　ｔａｒｔ−ブトキシカルボニル基などウレ
タン系保護基、ホルミル基、トリフルオロアセチル基、
トシル基などを挙げることができるが、ポリマー合成後
保護基を除去する場合の温和な条件で収率よく除去する
ためにベンジルオキシカルボニル基が好ましい。

また、その保護基の除去方法としては、高分子側では反
応が不十分である接触還元処理は好ましくないが、酢酸
生臭化水素酸、トリフルオロ酢酸。

有機溶媒中塩化水素などの処理を挙げることができる。

光学活性リシンポリマーへのチミンの導入は８位のアミ
ノ基の保護基を除去後、しばしばペプチド合成で用いら
れる活性エステル法により、３−（１−チミル）プロピ
オン酸のエステル類、例えばｐ−二トロフェニルエステ
ル、クロロ化フェニルエステル、シアノメチルエステル
、ジカルボン酸イミドエステルなどを用い、リシンのε
−アミノ基とアミド結合でつなぐことにより容易に化学
修飾される。

シリカゲルとこの化学修飾されたりシンポリマーの結合
は、光学活性リシンポリマーのカルボン酸末端をペプチ
ド合成で一般に使用されている前記の方法で行なうこと
ができるが、比較的容易で温和な条件下にてできるカル
ボキシル基をエステル化する活性エステル法が好ましい
。

本発明におけるシリカゲルは平均細孔径１００〜１００
０　Ａ、好ましくは１５０〜５００又であれば通常のシ
リカゲルを用いることができるが、特に、アミノプロピ
ル型シリカゲルが好ましい。

担体として使用しているアミノプロピル型シリカゲルは
シリカゲルをアミノプロピルアルコキシシラン類で処理
することによって得られる。

平均細孔径が１００ス未満では光学活性リシンポリマー
が細孔内に浸透して化学結合し難く、また、１０ａａＸ
を超えるとシリカゲルの単位重量当り十分な固定相結合
量を得ることができ難いため好ましくない。

また、その粒子径は液体クロマトグラフ用充填剤として
通常用いられる粒径であればなんらさしつかえないが、
液体の流れ抵抗が比較的少な（、かつ粒子内外での溶質
の拡散や流れの乱れによるバンドの拡がりを防ぐために
、２μｍ〜２００μｍのものが好ましい。

以上の方法により得られた液体クロマトグラフィ用充填
剤は、赤外線吸収スペクトルを測定して、１７００　ｃ
ｍ−”付近にポリＩ、−リシン誘導体由来のピークが出
現していることにより、光学活性リシンポリマーの側鎖
にチミンをグラフトして得たポリマーとシリカゲルとが
化学結合していることを確聴した。

さらに、本発明の液体クロマトグラフィ用充填剤は、ポ
リ−シーリシンまたはポリ−クーリシンの側鎖にグラフ
トしているチミンを分子内二量化した液体クロマトグラ
フィ用充填剤であってもなんらさしつかえない。

分子内二量化は、光学活性リシンポリマーに結合したチ
ミンを紫外線、特に２８０　ｎｍ付近の波長の照射によ
る光二量化を行なうことにより容易に反応することがで
きる。

この液体クロマトグラフィ用充填剤も赤外線吸収スペク
トルからほぼ同様に確認することができろ。

次に、本発明により得られた充填剤を用いた液体クロマ
トグラフィの溶離条件は逆相クロマトグラフィに用いら
れる条件であればなんらさしつかえないが、好ましい条
件を示す。

溶離液としては純水または緩衝液と水溶性有機溶媒の混
合溶液または有機溶媒単独を用いることが好ましい。

有機溶媒としては、試料に紫外線吸収をもつ物質が多い
ので紫外線吸収の少ないメタノール、エタノール、アセ
トニトリル、ジオキサン、テトラヒドロフランなどが好
ましい。その流速としては毎分（１５〜２０譚の線速で
、温度は２０°Ｃ〜８０”Ｃが好ましい。

発明の効果 本発明のクロマトグラフィ用充填剤は、核酸塩基を含有
するポリマーおよびオリゴマーのアデニン含有量に基づ
く選択的分離に有効である。

以下、本発明を実施例により、具体的に説明する。

実施例１ ε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リシン−Ｎ−力ル
ポキシ無水物（ｔ　−Ｚ　−ＬＩＩＬｙｓ−ＮＣＡ）７
９を１００艷のジオキサン中６−アミノカプロン酸エチ
ル（１２９を開始剤として、３０℃。

１００時間重合して、水中沈殿してＺ−Ｌ−リシンポリ
マーＳ、Ｂ９を得た。この生成物４ｇを２５チ臭化水素
酸の酢酸中で２５°Ｃ９２４時間処理してベンジルオキ
シカルボニル基とポリマー末端のエチル基を除去して、
エーテル中沈殿、洗浄してＬ−ＩＪシランリマー臭化水
素塩を５，５９得た。

次に上記ポリマー五２ｇをジメチルスルホキシド（以下
ＤＭＥＩＯと略記する。）６０ｄ中に溶解しトリエチル
アミン４．２５４と３−（１−チミル）プロピオン酸ペ
ンタクロロフェニルエステル８ｇを加え２５℃、２４時
間反応し、リシン残基のアミノ基’１−（１−チミル）
プロピオアミド基に変えた生成物（１）を４．２９得た
。

生成物（１）を′２−１ｇとりＤＭＳｏ　５０ｄ中で、
トリクロロ酢酸ペンタクロロフェニル１．６９　ト）　
Ｉ７エチルアミン１５ｍ１でポリマー末端カルボキシル
基をペンタクロロフェニルエステルとしたポリマー（２
）を２−０９得た。

２ｇのシリカゲルをアミノプロピルアルコキシシランで
処理したアミノプロピル型シリカゲル（平均細孔径２５
０オングストローム、粒子径１０μｍ）にポリマー（２
）１６ｇを５０−のＤＭ８０中２５°Ｃ２２４時間反応
してＤＭＳ　Ｏ，アセトン、水の順に洗浄して充填剤（
３）を２．１９得た。

なお、アミノプロピル型シリカゲル、生成物（１）およ
び充填剤（３）のそれぞれの赤外線吸収スペクトルの測
定結果を第１図に示す。

充填剤（３）は、１７００　ｃｒｎ−’付近にポリ−シ
ーリシン誘導体由来のピークが出現し、ポリマーにポリ
−Ｌ−ＩＪシラン導体が結合していることが示されてい
る。また、充填剤（３）の化学式は以下のように推定し
ている。

ＮＨＣＯＣＦＩ、ＣＨ。

す 充填剤　（３） 充填剤（３）を内径４騙、長さ１５ｃｒｎのステンレス
カラムに充填し、高速液体クロマトグラフ（高速液体ク
ロマトグラフＨＬＯ−８０５Ｄ　　東洋曹達工業社製）
を用いて、溶離液：５０容量チメタノー／’水浴液、流
速：　（Ｌ　３５　ｍｌ／　ｍｉｎ、温度：４０’Ｃの
分離条件で、試料２０μｔをカラムに導入してアデニン
およびチミンを含有するエチレンイミンオリゴマーのク
ロマトグラフィ分離を行なった。その結果を第２表に示
す。なお、測定す／プルの構造および略号は第１表に示
す。

第１表 第２表において、チミン含有オリゴマーはチミン含有量
に関係なく、はぼ同一の溶出時間であるが、アデニン含
有オリゴマーはアデニン含有量の増加とともに溶出時間
が延びて、オリゴマーが分離していることを示している
。

実施例２ 実施例１で得られた充填剤（３１１，０９をメタノール
、水、７セト７（１７５ｍ、１’７５ｄ、ｆ　Ｏｍ）の
混合溶液中で、パイレックス反応管中窒素雰囲気下０°
Ｃで高圧水銀ランプで１時間元を照射してチミン基を光
二量化した充填剤（４）を得た。充填剤（４）を用いて
実施例１と同一条件にて得られたクロマトグラフィ分離
の結果を第２表および第２図に示す。

実施例１と同様にアデニン含有オリゴマーではアデニン
の含有量の増加に伴なって、溶出時間が延びた。

比較例１ ε−Ｚ　　Ｌ−Ｌｙｅ−ＮＣｋ　　１０９を１００ｍ１
のジオキサン中ｎ−プロピルアミンｌ１１１１−を開始
剤として５０”Ｃ，２４時間重合し、Ｚ　−Ｌ−Ｌｙｓ
ポリマー水中沈殻させ７．８ｇ得た。

これケ２２とり３０−のジメチルホルムアミド（以下Ｄ
ＭＦと略記する。）中で１７の無水グルタール酸とトリ
エチルアミン１−で末端アミノ基をアミド化した生成物
（５）を水中沈殿させ１．９２９得た。１ｇの生成物（
５）を実施例１と同様末端のカルボキシル基を５０−の
ＤＭＦでＣＬｌｇのトリクロロ酢酸ペンタクロロフェニ
ルで５０℃、２４時間反応して生成物２−５２を得た。

２．０９の実施例１と同様のアミノプロピル型シリカゲ
ルに上記生成物２．５２を３０−のＤＭＦ中で６０”Ｃ
１７０時間処理して充填剤（６）　２．５９を得た。

なお、生成物（５）および充填剤（６）のそれぞれの赤
外線吸収スペクトルの測定結果を第１図に示す。

なお、充填剤（６）の化学式は以下のように推定してい
る。

充填剤　（６） 充填剤（６）を用いて実施例１と同一条件にて得られた
クロマトグラフィ分離の結果を第２表に示す。

チミンおよびアデニン含有オリゴマーは塩基含有情圧無
関係にほぼ同一の溶出時間を示した。

第２表

【図面の簡単な説明】

第１図は生成物（１）　（５）　、充填剤（３）　（６
）および原料アミノプロピル型シリカゲルのそれぞれの
赤外線吸光スペクトラムを示す図。 ＠２図は本発明の充填剤を用いて、アデニン含有オリゴ
マーを分離して得られたクロマトグラムである。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ポリ−Ｌ−リシンまたはポリ−Ｄ−リシンの側鎖
   にチミンをグラフトした重合度８以上のポリマーがシラ
   ンを介して平均細孔径 １００Å以上であるシリカゲルと化学結合したことを特
   徴とするクロマトグラフィ用充填剤
2. （２）チミンをグラフトした重合度８以上のポリマーが
   チミンの分子内二量化したポリマーである特許請求の範
   囲第（１）項記載のクロマトグラフィ用充填剤
3. （３）シランが ▲数式、化学式、表等があります▼ （Ｒ＿１、Ｒ＿２、Ｒ＿３のうち少なく１個は炭素数１
   〜３のアルコキシ基であり、その他は炭素数 １〜５のアルキル基） で示されるアミノプロピルシランである特許請求の範囲
   第（１）項または第（２）項記載のクロマトグラフィ用
   充填剤