JPS61178661A - エンテロトキシンの定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はエンテロトキシンの定量法に関し、特に食品中
に混入したブドウ球菌あるいはセレウス菌の産生ずる毒
素（以下エンテロトキシンと略す）を検出する方法に関
するものである。

特に食品衛生検査上、食中毒を生じせしめたエンテロト
キシン究明を行う際、食品及び患者材料（吐物）中に存
在するエンテロトキシンを正確に定■することにより、
食中毒の診断を行うものである。

（従来の技術） 従来からエンテロトキシンの定量法としては次のような
方法が行なわれている。食中毒を生じさせたと推定され
る食品１０ｇを９０ｍ１の生理食塩水あるいはリン酸緩
衝生理食塩水（以下ＰＢＳと略す）にてホモジネートし
、その０．１１をマンニット−食塩−卵黄寒天培地に塗
抹し、３７℃で２４〜４８時間培養を行い、生じたコロ
ニーを計測して、食品１ｇ中の菌数を出す。食品１ｇ中
の菌数が１０個以上の場合、菌による食中毒と推定され
る。次いで、コアグラーゼ産生性を１０倍希釈ウサギプ
ラズマ０．５μｌにブレーンハートインフュージョン培
地（以下ＢＨＩと略す）培養被検菌５１を加え、３〜２
４時間後、プラズマの凝固又は、フィブリンの析出が認
められるかどうか判定し、凝固した場合には黄色ブドウ
球菌と同定される。

さらに黄色ブドウ球菌の産生ずるエンテロトキシンを測
定する場合、被検菌を３％ＮＺ−アミン培地又はＢＨＩ
培地で振盪培養し、培養液を遠心後、ミクロスライドゲ
ル内沈降反応法により、一方にエンテロトキシンを動物
に免疫して得た抗血清を入れ、他方に培養遠心上清を倍
数希釈してそれぞれの穴に入れ、４８時間湿箱中で反応
させ、抗血清を入れた穴と各希釈液との間に沈降線、の
有無を判定する。あるいはエンテロトキシンに対する抗
血清をポリエチレン等のラテックスに結合させたものを
用いて培養上清を倍数希釈し、凝集を示す最高希釈倍数
を求め、本方法の最少検出感度によりエンテロトキシン
を求めるラテックス凝集反応が用いられている。

（発明が解決しようとする問題点） このように食中毒の原因解明には、食品中の菌の分離、
同定、エンテロトキシン量の定量といった一連の操作は
繁雑で、簡単に行なうことは不可能であった。本発明者
等は、食品中のエンテロトキシン、を直接定量する高感
度で、しかも簡便゛な方法を開発すべく鋭意研究した結
果本発明に到達した。

（問題点を解決するための方法） すなわち本発明は、エンテロトキシン含有液を抗エンテ
ロトキシン抗体不溶化担体および酵素標識抗エンテロト
キシン抗体と反応させ、結合した酵素標識抗エンテロト
キシン抗体または未結合の酵素標識抗エンテロトキシン
抗体の酵素活性を測定することによりエンテロトキシン
を定量することを特徴とするエンテロトキシンの定量法
である。

エンテロトキシンは黄色ブドウ球菌の産生ずる催吐活性
毒素に対して与えられた固有名詞と理解されてきたが、
近年コレラ菌、大組Ｌウェルシュ菌の下痢性毒素もエン
テロトキシンと呼ばれるようになった。そこで、従来よ
りのエンテロトキシンは国名を付してブドウ球菌エンテ
ロトキシンと呼ぶようになった。本発明はこれらの全て
のエンテロトキシンの定量を含有しているものである。

ブドウ球菌食中毒は菌体外毒素により発生する疾患であ
ることが、１９３０年代にＤａｃｋｓ　（Ｄａｃｋ　、
Ｇ　、１．　。

Ｃａｒｙ、　Ｗ、！、、　Ｗｏｏｌｐｅｒｔ、　ｏ、Ｉ
　Ｗｉｇｇｌｎｇ＋　Ｈ，Ｊ、　：　Ｊ。

Ｐｒｅｖ、　ｌｅｄ、、　４．　ｌＧ？、（１９３０）
）によって証明され、このエンテロトキシンが単離精製
された。このブドウ球菌エンテロトキシンにはＡ、Ｂ、
Ｃ，Ｄ及びＥの５つのタイプが存在することも明らかに
されている。これらの５つのタイプは、従来の技術の項
で述べたようなゲル内沈降反応により、特異的沈降パタ
ーンにより区別することが可能であり、５つのタイプの
中にも、共通抗原が存在することも又明らかである。こ
れらのエンテロトキシンの分離、精製法は別冊、蛋白質
、核酸、酵素１１．８９　（１９７Ｂ）に詳細に記載さ
れているように培養上清を出発原料にしてＣＭ−セファ
ローズカラムクロマトグラフイー、セファデックスＧ−
１００゜セファデックスＧ−７５によるゲル濾過を繰返
し行う操作が多く用いられる。

本発明に用いられる抗エンテロトキシン抗体は次のよう
にして得ることができる。すなわち、上記のようにして
分離、精製したエンテロトキシンに対する抗血清を得る
には、例えばエンテロトキシン６０μｇ／■ｌ、　ＯＪ
ｍｌとフロイントの完全アジュバント０．１１を等全混
合しウサギ皮下に注射し、さらに６〜７週後に追加免疫
し、最初の免疫より１０〜ｌｌａ目で全採血する。得ら
れたエンテロトキシンに対する抗血清の力価、純度はゲ
ル内沈降反応により検定する。

このようにして得られたエンテロトキシンに対する抗血
清を用いて、抗体画分を通常の３３％飽和硫安塩析−Ｄ
ＥＡＥセファローズカラムクロマトグラフィーにより１
ｇ０ｍ分を得る。又別法としてプロティンＡ結合セファ
ローズＣＬ−４Ｂに抗血清を通し、ＰＢＳで洗浄後吸む
されたＩｇＧを、グリシン−塩酸緩衝液ｐＨ２，７を用
いて溶出する。

溶出後、直ちに２Ｍ）リスアミノメタンで中和後、ＰＢ
Ｓに対し一夜透析することによりＩｇＧに精製すること
もできる。さらに動物より得られる抗血清以外でもハイ
ブリドーマ法によるモノクロナール抗体も利用すること
ができる。

このようにして得た抗エンテロトキシンの１１０画分を
不溶性担体に結合する方法としては物理吸着を利用して
も良く、又通常蛋白質あるいは酵素を不溶化するに用い
られる方法を用いて共存結合させても良い。例えば不溶
性多糖類を用いる場合であれば、不溶性多糖を臭化シア
ン、過ヨーソ酸ナトリウム、エピクロルヒドリンｌ、１
′−力ルボニルジイミダゾール等で活性化して結合反応
を行なわせる。又、固相に適当なスペーサーを導入後、
スペーサーを介して抗エンテロトキシン抗体を結合させ
ても良い。

本発明で使用する抗エンテロトキシン抗体は、１１０画
分をそのまま用いても良いが、抗原結合部位のみを分離
したものでも良い。即ち、パパイン、ペプシンなどのプ
ロテアーゼで処理して得られるＦａｂ＋　Ｆａｂ’、　
Ｆ　（ａｂ’）　、部分なども使用することができる。

本発明の不活性担体としては、ポリスチレン等のプラス
チック、ガラスあるいはアガロース、デキマトラン、セ
ルロース等の多糖類が使用でき、形態としては、ビーズ
吠、繊維吠、チューブ吠等種々の形態が利用できる。又
、酵素を標識剤として１１０画分に結合させる方法とし
てグルタルアルデヒドを架橋剤として用いる方法（Ａｖ
ｒａｍｅａｓ、Ｓ、；１ｍｍｕｎｏｃｈｅ１ｓｔｒｙ、
　８．４３−５２．１９９９）及びペルオキシダーゼを
標識剤として用いる１ｌａｋａｎｅの過ヨーソ酸酸化法
（Ｎａｋａｎｅ、　Ｐ、に、、　＆　Ｋａｗａｏｌ、　
Ａ、；　Ｊ、旧５ｔｏｃｈｅｓ＋、　Ｃｙｔｏａｂｅｔ
ａ、　２２．１０８４−１０９３．１９７４）　＋さら
にβ−ガラクトシダーゼを標識剤とし、マレイミドを架
橋剤として用いる方法（加藤兼房、石川栄治：免疫実験
操作法、ＩＶ、　１９７５　Ｐ１１３））により、標識
酵素と抗体の１１０画分あるいはＦａｂ、Ｆａｂ；Ｆ（
ａｂ’　）。

分を結合させることができる。“ ａ！識酵素としては、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラ
クトシダーゼのほかにアルカリホスファターゼ、ゲルコ
ールオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等通常用いられ
る酵素であればいずれでも良いが、特にペルオキシダー
ゼが、測定感度が高いために好ましい。

又、酵素基質−発色剤としては、一般に用いられている
ものが使用可能であり、ペルオキシダーゼの場合には、
過酸化水素と０−フェニレンジアミン・２ＨＣ９，過酸
化水素と２，２′−アジノージ−（３−エチレンベンツ
チアゾリンスルホン酸■〕とが、感度の点より用いられ
、又、蛍光基質として過酸化水素と３（ｐ−ヒドロキシ
フェニル）プロピオン酸（ＨＰＰＡと略す）も使用可能
であり、β−Ｄ−ガラクトシダーゼの場合、０−ニトロ
フェニルβ−ローガラクトシドあるいは蛍光基質として
４−メチルウンベリフェリルβ−ローガラクトシドを用
いることができる。さらにアルカリホスファターゼの場
合には、ｐ−ニトロフェノール・リン酸や蛍光基質とし
ての４−メチルウンベリフェリル・リン酸の使用もでき
る。

本発明の定量法はエンテロトキシン含有液を抗エンテロ
トキシン抗体不溶化担体および酵素標識抗エンテロトキ
シン抗体と反応させ、結合した酵素標識抗エンテロトキ
シン抗体または未知の酵素標識抗エンテロトキシン抗体
の酵素活性を測定することにより、エンテロトキシン定
量する方法である。

具体的には次のような方法がある。

（１）　　エンテロトキシン含有液を抗エンテロトキシ
ン抗体不溶化担体と反応させ、エンテロトキシン−抗エ
ンテロトキシン抗体不溶化担体複合体を形成しく第１段
反応）、次いで該複合体と酵素標識抗エンテロトキシン
抗体を反応させ（第２段反応）、該複合体と結合した酵
素標識抗エンテロトキシン抗体の酵素活性を測定するこ
とにより、エンテロトキシンを定量する。

■　エンテロトキシン含有液を酵素標識抗エンテロトキ
シン抗体と反応させ、エンテロトキシン−酵素標識抗エ
ンテロトキシン抗体複合体を抗エンテロトキシン抗体不
溶化担体を反応させ（第２段反応）、該担体に結合した
酵素標識抗エンテロトキシン抗体の酵素活性を測定する
ことにより、エンテロトキシンを定量する。

（３）　　エンテロトキシン含を液と酵素標識抗エンテ
ロトキシン抗体複合体と抗エンテロトキシン抗体不溶化
担体とを同時に反応させ、該担体に結合した酵素標識抗
エンテロトキシン抗体の酵素活性を測定することにより
、エンテロトキシンを定量する。

上記反応は温度４〜４５℃、特に３７℃付近で行なうこ
とが好ましく、反応ＰＨは中性付近、特にｐＨ７〜７．
５付近であることが好ましい。酵素活性測定は酵素の至
適ＰＨ１付近で行なうことが好ましい。

反応時間は特に制限はないが、逐次反応法の（１）およ
び■においては、第１段反応を約３０分〜約２時間ある
いは一夜放置後、第２段反応を約３０分〜約２時間ある
いは一夜放置する。同時反応法の（３）においては、約
１０分〜約５時間反応させる。反応温度、反応ｐａおよ
び反応時間は必要により変化してもよい。

酵素活性測定は結合した酵素標識抗エンテロトキシン抗
体の酵素活性に代えて未結合の酵素標識抗エンテロトキ
シン抗体の酵素活性を測定してもよい。

検体中に存在するエンテロトキシンの息は予め作製した
標識曲線により正確にかつ高感度で測定する。

（発明の効果） 本発明では、微生物の産生したエンテロトキシンを簡便
で、迅速な操作により正確に測定でき、食中毒原因解明
ができる。

（実施例） 次に実施例により本発明を説明する。

（１）　　精製ブドウ球菌エンテロトキシンＡの調製品
用らの方法〔日細誌３Ｇ、８８３．（１９７５）〕によ
り調製した。即ち黄色ブドウ球菌Ｆ　Ｒｌ−７２２を用
い３％ＮＺアミンープロティンヒドロラーゼ（以下ＰＨ
Ｐと略す）培地を用い、１６〜１８時間振盪培養し、遠
心分離により培養上清を得、８Ｎ−ＨＣＩでｐＨを５．
７に調製した。４倍量の蒸留水で希釈したものを０．０
ＩＭリン酸緩衝液ｐＨ５，７で平衡化したＣＭ−セファ
デックスによるバッチクロマトを行い、カラムにつめｐ
Ｈ５，７のｏ、０１Ｍリン酸緩衝液で洗浄後、　ｐＨ５
，７の０．０１Ｍリン酸緩衝液とｐＨ７，５の０．１Ｍ
リン酸緩衝液でグラシュエンド溶出した。次いで０．０
２５Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ９，５テ平衡化し
たＤＥＡＥ−セファデックスカラムクロマトにかけ、０
．０２５Ｍグリシン−ＮＡＯＨ緩衝液ｐＨ９，５と０．
２ＮＮ　ａ　Ｃｌを含む０．０５Ｍグリシン−ＮａＯＨ
緩衝液ｐＨ９，５でグラシュエンド溶出し、セファデッ
クスＧ−７５ゲル濾過後、精製水に対し透析後、凍結乾
熾し、精製ブドウ球菌エンテロトキシンＡとした。

■　ブドウ球菌エンテロトキシンＡに対する抗血清 ブドウ球菌エンテロトキシンＡにする抗血清は精製ブド
ウ球菌エンテロトキシンＡを初回１０μｇ　（０，５ｍ
１）とフロイントの完全アジュバント（０，５ｍ１）を
混ぜ、１膳！のウサギの背部皮下に接種した。７〜９週
目にブースターとしておのおの同量のブドウ球菌エンテ
ロトキシンＡをアジュバンドを加えないで皮下に免疫し
た。力価が最高になった１１〜１３週に採血した。

（３）　　抗ブドウ球菌エンテロトキシンＡ抗血清より
のＩｇＧ画分の調製 得られたブドウ球菌エンテロトキシンＡに対するウサギ
抗血清をプロティンＡ結合セファローズＣＬ−４Ｂ　（
ファルマシア製）をつめたカラムに通し、０．０１Ｍ　
Ｐ　Ｂ　Ｓで洗浄し、波長２８０ａｍにおける吸光度が
０．０５０以下になった段階で０．１Ｍグリシン−ＨＣ
ｌ緩衝液ｐ■２．７を通し、プロティンＡ結合セファロ
ーズＣＬ−４Ｂに結合しているＩｇＧ画分を溶出させた
。溶出後、すぐに２Ｍ）リスアミノメタンを用いて中和
し、０゜０１１　Ｐ　Ｂ　Ｓ　（＋）Ｈ７，２）に対し
透析する。透析後精製抗ブドウ球エンテロトキシンＡウ
サギＩｇＧとして使用に供した。

（４）　　Ｆ（ａｂ’）ｍ　フラグメントの調製抗ブド
ウ球菌エンテロトキシンＡウサギＩｇＧにペプシン（ブ
タ腸粘膜由来、シグマ社製）ＩＯＷ／Ｖ％を加え、３７
℃、１６時間処理し、セファデックスＧ−２００ゲル瀘
過によりＦ（ａｂ’　）ｔ　フラグメントを得た。

■　抗ブドウ球菌エンテロトキシンＡウサギＩｇＧをペ
ルオキシダーゼの結合体の調製過ヨウ素酸塩酸化法（Ｎ
ａｋａｎｅ、　Ｐ、に、、　＆にａｗａｏｉ＋Ａ、；　
Ｊ、　Ｈｌｓｔｏｃｈｅｓ、　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、　２
２．１０８４−１０９Ｌ（凰３７４）】により、抗ブド
ウ球菌エンテロトキシンＡウサギＩＫＧと西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ（東洋紡製、グレードＩ−Ｃ）を結合し
、セファデックスＧ−２００ゲル濾過により、ペルオキ
シダーゼ標識抗ブドウ球菌エンテロトキシンＡウサギＩ
ｇＧを得た。

■　抗体結合固相の調製 抗ブドウ球菌エンテロトキシンＡウサギＩｇＧを１／４
インチポリスチレンボールに物理吸着させた。即ち、抗
ブドウ球菌エンテロトキシンＡウサギＩｇＧを０．ＩＭ
炭酸緩衝液ｐａｓ、ｓに２０〜３０ｇｇ／ｍｌに調製し
た液にポリスチレンポールを浸漬し、室温４時間、４℃
、液装置した。０．０１Ｍ　Ｐ　ＨＳ　（１）■７．２
）啓洗浄後、１％牛血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ　）、
ｏ、ｒ％Ｐ　Ｂ　Ｓ　（ｐＨ７，２）に使用まで保存し
た。

抗体結合固相は、少なくとも６力月は安定であった。

■　　測　　定　　操　　作 標準ブドウ球菌エンテロトキシンＡは、精製ブドウ球菌
エンテロトキシンＡを、０．０１Ｍ　Ｐ　Ｂ　Ｓに、所
定濃度になるように溶解調製したものを用いた。

標準ブドウ球菌エンテロトキシンＡｍ、１００μ！ある
いは、食中毒を生じさせた食品１０ｇを生理食塩水９０
１に溶解ホモジネートシ、遠心分離した。上清１００μ
！を、内径１０ＩＩＩ１１高さ３０龍の試験管が２０個
結合したイムノポールトレー（小野薬品工業社製）の中
に入れ、正常家兎血清４　Ｖ／Ｖ％を含む、０．０１Ｍ
　Ｐ　Ｂ　Ｓ　＋）１１？、２，２００μｌを追加混合
後、抗体結合ポールを１ヶ入れ、３７℃で、１時間、静
置インキュベートした。

１時間後、アスピレータ−を用いて、液を吸引除去し、
Ｏ，ＯＩＭ　Ｐ　Ｂ　Ｓ　ｐＨ７，２を用いて３回洗浄
後、０．２５Ｗ／Ｖ％ＢＳＡを含む。０．０１Ｍ　Ｐ　
ＨＳ　　ｐＩＮ７．２で適当に希釈した。希釈したもの
（標準ブドウ球菌エンテロトキシンＡ　１００　ｎｇ／
ｍｌを用いた場合に吸光度が！、θ付近になるように調
製する。）２５００１加え、３７℃、２時間、インキュ
ベートした。インキュベート終了後、　０．ＯｆＭ　Ｐ
　Ｂ　５ｐＨ７，２を用いて３回洗浄後、新たな試験管
ボックス（イムノポール・スピッツボックス）にポール
のみ移し、　０．０２％ＨｓＯａ、Ｏ−フェニレンジア
ミン・２ＨＣ１（牛丼化学社製）３■／ｍｌ含む、０．
２Ｍクエン酸、０．１関リン酸緩衝液ＰＨ５，７，０，
５１を加え、暗所、室温で１時間反応させた。

１時間後、ＩＮ−硫酸２１を加え酵素反応を停止後、波
長４９２ｎｍでの吸光度を測定した。得られたブドウ球
菌エンテロトキシンＡの標準曲線を第１図に示す。食品
中のブドウ球菌エンテロトキシンＡは、この標準曲線よ
り求められた。又、ブドウ球菌エンテロトキシンの他の
型、即ちＢ％ｃ１Ｄ、Ｈについて、そのエンテロトキシ
ン濃度を１０００　ｎｇ／ｍｌとしたときの交差程度は
、Ｅのみ２０　ｎｇ／ｌ程度検出され２％程度の交差反
応を示した。

実施例　２ （１）　　精製ブドウ球菌エンテロトキシンＢの調製精
製ブドウ球菌エンテロトキシンＢの調製は実施例に示し
たような品用らの方法によって調製した。即ち、黄色ブ
ドウ球菌２４３　（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａ
ｕｒｅｕｓ２４３　）株を用い、３％ＮＺ−アミン加え
、３ＩＡＰＨＰ培地を用いて振盪培養し、遠心分離によ
り培養上清を得、６Ｎ−ＨＣｆでｐｎｓ、７に調製後、
蒸留水で５倍に希釈した。次いでＣＭセファデックスバ
ッチ法クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セファデックス
カラムクロマトグラフィーおよびセファデックスＧ−７
５によるゲル濾過を行い、精製水に対し透析後、凍結乾
燥し、精製ブドウ球菌エンテロトキシンＢを得た。

■　ブドウ球菌エンテロトキシンＢに対する抗血清 実施例１で示したブドウ球菌エンテロトキシンＡに対す
る抗血清作製法と同一の操作を行いエンテロトキシンＢ
に対する抗血清を得た。

（３）　　抗ブドウ球菌エンテロトキシンＢ抗血清より
のＩｇＧ画分の調製 実施例１で示したブドウ球菌エンテロトキシンＡに対す
る抗血清より糖製抗体を得たと同じ方法で、ブドウ球菌
エンテロトキシンＢに対する精製抗体を得た。

（２）精製抗ブドウ球菌エンテロトキシンＢウサギＩｇ
Ｇとペルオキシダーゼの結合体の調製実施例１で示した
と同じ過ヨウ素酸塩酸化法により、ペルオキシダーゼ結
合位ブドウ球菌エンテクトキシンＢウサギＩｇＧを得た
。

■　抗体結合固相の調製 実施例１で示した同じ方法で抗体結合固相を得た。

■　　測　　定　　操　　作 実施例１で示したと同じ方法で測定操作を行い、ブドウ
球菌エンテロトキシンＢの標準曲線はエンテロトキシン
Ａに対する標準曲線と類似の標準曲線が得られた。他の
ブドウ球菌エンテロトキシンに対しては、交差反応を示
さなかった。

実施例　３゜ （１）　　ブドウ球菌エンテロトキシンＣの精製黄色ブ
ドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕ
ｓ）　ＦＲＩ−３８１を用い、実施例１と同じような方
法で培養し、遠心分離により得た培養上清に精製水を加
え、希釈後、ｐＩＩを５．７にしＣＭ−セファデックス
を加え、エンテロトキシンＣを吸普後、カラムにつめ、
０．０１ｇリン酸緩衝液ＰＩＩ５．７で洗浄後０．０Ｉ
Ｍリン酸緩衝液ｐＨ５，７と０．ＩＭリン酸緩衝液ｐ１
１７．５を用いてグラシュエンド溶出する０次いで、０
．０２５Ｍグリシン緩衝液ｐＨ９，５で平衡化したＤＥ
ＡＥ−セルロースによるクロマトで０．０２５Ｍグリシ
ン緩衝液ｐＨ３，５と０．２ＮＮａＣＩ加え、０．０５
Ｍグリシン緩衝液ｐｎ９．５によるグラシュエンド溶出
し、セファデックスＧ−７５によるゲル濾過後、凍結乾
燥を行うことにより、精製エンテロトキシンＣを得た。

■　測定材料の調製 ブドウ球菌エンテクトキシンＣに対する抗血清は、実施
例１、実施例２に記載の方法に準じて作製し、又、精製
１ｇ（ｉ画分を得た。又、西洋ワサビペルオキシダーゼ
との結合物も同様に作製した。

■　　測　　定　　方　　法 実施例１に記載の方法でブドウ球菌エンテロトキシンＣ
の測定を行った。エンテロトキシンＡの場合と同様な標
準曲線が得られ、他のエンテロトキシンＡ、Ｂ１Ｄ１Ｅ
との交差もほとんど認めらなかった。

実施例　４ （１）　　精製ブドウ球菌エンテロトキシンＤの調製黄
色ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒ
ｅｕｓ）１１５１−７ＮＧを用い、実施例１と同じ方法
で培養し、遠心分離により得た培養上清を１０倍に濃縮
後、ｐｉを５．７に調製し、実施例１と同じ方法でブド
ウ球菌エンテロトキシンＤを精製した。

■　測定材料の調製 実施例１に記載の方法で、測定材料を調製した。

即ち、抗血清よりの精製１ｇＧ１西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ結合１ｇＧ等を調製した。

■　　測　　定　　方　　法 実施例１に記載の方法に準じて、ブドウ球菌エンテロト
キシンＤの測定を行ったところ、実施例１と同様な結果
が得られた、 実施例　５゜ 品用らの方法〔品用邦汎１国田信治、阪ロ玄二：日細誌
３２．８２９　（１９７〕）〕に従ってブドウ球菌エン
テロトキシンＥの精製を行い、実施例１に記載の方法に
従って抗血清、精製１ｇＧ、西洋ワサビペルオキシダー
ゼ結合１ｇＧを得、実施例１に記載の方法でブドウ球菌
エンテロトキシンＥの測定を行ったところ、実施例１と
同様な結果が得られ、ブドウ球菌エンテロトキシンＡと
一部交差反応のあることが認められたが、その測定値に
しめる割合はわずかで実用上は問題にならなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１における標準曲線を示す。 特許出願人　　東洋紡績株式会社 手続補正書（自発） 昭和６０午２月１９日 特許庁長官　　志　賀　　学　殿 １、　事件の表示 昭和６０年特許願第　　　　　　号 （昭和６０年２月５日提出） λ　発明の名称 エンテロトキシンの定量法 ａ　補正をする者 事件との関係　　特許出願人 大阪市北区堂島浜二丁目２番８号 ４、　補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ＆　補正の内容 （１）　明細書の所定箇所を別紙正誤表の通り訂正する
。 （２）　明細書第２３頁第１１行目と第１２行目との間
に、次の実施例６を挿入する。 「実施例６ セレウス苗によるエンテロトキシンの検出（１）　　セ
レウス菌によるエンテロトキシン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
ｃｅｒｅｕｓエンテロトキシ／、以下Ｂ、Ｃ。 エンテロトキシンと略す）の精製 九 食中毒由来セレウス菌を１％ブドウ糖加Ｂｒａｉｔ−Ｈ
ｅａｒｔ−１ｎｓｕｓｉｏｎ（旧ｒｃｏ社製）培地で３
２℃、６時間振とう培養し、遠心上清を得、品用らの方
法［大阪府立公衛研所報　９，１３１　（１９７８）］
に従って精製した。 （２）　抗血清の作製 ｎ、ｃ、エンテロトキシンを６０μｇ／■ｔ、０．０ｍ
ｌとフロインドの完全アジ、バンド０．８ｉ＋　ｔを等
全混合し、ウサギ皮下に免疫した。６〜７週後にｎ、ｃ
　、エンテロトキシンを３０μｇｌｕｔ　、１　ａｆｔ
を追加免疫し、最初の注射より１１週０に全採血を行い
、抗血清を作製した。 （３）　　測定材料の調製 実施例１に記αの方法で測定材料を調製した。 即ち、抗血清よりの精製１ｇＧ画分、抗体結合ポール、
西洋ワサビペルオキシダーゼ結合１ｇＧ等を調製した。 （４）　　測定方法 実施例１に記載の方法に準じて、Ｂ、Ｃ，エンテロトキ
シンの測定を行ったところ、実施例１と同じような結果
が得られた。」 ａ　添付書類 訂正された明細書　　第３．４頁 〃　　　　第６．７．８頁 〃　　　　　第１３．１４．１５． １８．１７．１８頁 正　　　　誤　　　　表 に食品中に混入したブドウ球菌あるいはセレウス菌の産
生ずる毒素（以下エンテロトキシンと略す）を検出する
方法に関するものである。 特に食品衛生検査上、食中毒を生じせしめたエンテロト
キシン究明を行う際、食品及び患者材料（吐物）中に存
在するエンテロトキシンを正確に定量することにより、
食中毒の診断を行うものである。 （従来の技術） 従来からエンテロトキシンの定量法としては次のような
方法が行なわれている。食中毒を生じさせたと推定され
る食品１０ｇを９０ｍ１の生理食塩水あるいはリン酸緩
衝生理食塩水（以下ＰＢＳと略す）にてホモジナイズ後
、その０．１ｍｌをマンニット−食塩−卵黄寒天培地に
塗抹し、３７℃で２４〜４８時間培養を行い、生じたコ
ロニーを計測して、食品１ｇ中の菌数を求める０食品１
ｇ中の菌数が１０個以上の場合、本国による食中毒と推
定される０次いで、コアグラーゼ産生性を５〜７倍希釈
ウサギプラズマ０．５ｍｌにブレーンハートインフュー
ジョン培地（以下ＢＨＩと略す）培養被検菌０．５１を
加え、３〜２４時間後、プラズマの凝固又は、フィブリ
ンの析出が認められ場合には黄色ブドウ球菌と同定され
る。 さらに黄色ブドウ球菌の産生ずるエンテロトキシンを測
定する場合、被検菌を３％ＮＺ−アミン培地又はＢＨＩ
培地でｔｉ盪培養し、培養液を遠心後、ミクロスライド
ゲル内沈降反応法を用いる。 その方法は中央の穴にエンテロトキシンを動物に免疫し
て得た抗血清を入れ、周囲の穴に培養遠心上清をそれぞ
れ入れ、４８時時間和中で反応さす。抗血清を入れた穴
と培養上清を入れた穴との間に沈降線の形成有無を確認
して判定する。あるいはエンテロトキシンに対する抗血
清をラテックスに結合させたものを用いて培養上清を倍
数希釈し、凝集を示す最高希釈倍数を求める。本方法の
最少検出感度によりエンテロトキシンを検出するラテッ
クス凝集反応が用いられている。 （発明が解決しようとする問題点） ようになった。そこで、従来からエンテロトキシンと呼
ばれていた毒素は国名を付してブドウ球菌エンテロトキ
シンと呼ぶようになった。本発明はこれらの全てのエン
テロトキシンの定量を含有しているものである。 ブドウ球菌食中毒は菌体外毒素により発生する疾患であ
ることが、１９３０年代にＤａｃｋｓ　（Ｄａｃｋ　、
Ｇ　、Ｍ、　。 Ｃａｒｙ、　Ｗ、Ｅ、、　Ｗｏｏｌｐｅｒｔ、　ｏ、、
　Ｗｌｇｇｌｔｌｇ、Ｈ，Ｊ、　：　Ｊ。 Ｐｒｅｙ、　Ｍｅｄ、、　４．１８７．（１９３０））
によって証明され、それ以後このエンテロトキシンが単
離精製され、現在このブドウ球菌エンテロトキシンには
Ａ。 Ｂ、Ｃ，Ｄ及びＥの５つのタイプが存在することも明ら
かにされている。これらの５つのタイプは、従来の技術
の項で述べたようなゲル内沈降反応により、特異的沈降
パターンにより区別することが可能であり、５つのタイ
プの中にも、共通抗原が存在することも又明らかである
。これらのエンテロトキシンの分離、精製法は別冊、蛋
白質、核酸、酵素１１．Ｈ（１９７Ｂ）に詳細に記載さ
れているように培養上清を出発原料にしてＣＭ−セファ
ローズカラム、クロマトグラフィー、セファデックスＧ
−１００，セファデックスＧ−７５によるゲル濾過を繰
返し行う操作が多く用いられる。 本発明に用いられる抗エンテロトキシン抗体は次のよう
にして得ることができる。すなわち、上記のようにして
分離、精製したエンテロトキシンに対する抗血清を得る
には、例えばエンテロトキシン６０μｇ／■Ｌ　Ｏ，６
ｍｌとフロイントの完全アジュバント０．１１を等量混
合しウサギ皮下に注射し、さらに６〜７週後に追加免疫
し、最初の免疫より１０〜１１週目で全採血する。得ら
れたエンテロトキシンに対する抗血清の力価、特異性は
ゲル内沈降反応により検定する。 このようにして得られたエンテロトキシンに対する抗血
清から、３３％飽和硫安塩析−ＤＥＡＥセファローズカ
ラムクロマトグラフィーにより抗体ＩｇＧ画分を得る。 又別法としてプロティンＡ結合セファローズＣＬ−４Ｂ
に抗血清を通し、ＰＢＳで洗浄後吸着されたＩｇＧをグ
リシン−塩酸緩衝ＨＤＢ２．７を用いて溶出する。溶出
後、直ちに２Ｍトリスアミノメタンで中和後、ＰＢＳに
対し一夜透析することによりＩｇＧを精製することもで
きる。さらに動物より得られる抗血清以外、例えばハイ
ブリドーマによるモノクロナール抗体も利用することが
できる。 このようにして得た抗エンテロトキシンのＩｇＧ画分を
不溶性担体に結合する方法としては物理吸着を利用して
も良（、又通常蛋白質あるいは酵素を不溶化するに用い
られる方法を用いて共有結合させても良い。例えば不溶
性多糖類を用いる場合であれば、不溶性多糖を臭化シア
ン、過ヨーソ酸ナトリウム、エピクロルヒドリン１．１
’−カルボニルジイミダゾール等で活性化して結合反応
を行なわせる。又、固相に適当なスペーサーを導入後、
スペーサーを介して抗エンテロトキシン抗体を結合させ
ても良い。 本発明で使用する抗エンテロトキシン抗体は、ＩｇＧ画
分をそのまま用いても良いが、抗原結合部位のみを分離
したものでも良い。即ち、パパイン、ペプシンなどのプ
ロテアーゼで処理して得らキシン抗体の酵素活性に代え
て未結合の酵素標識抗エンテロトキシン抗体の酵素活性
を測定してもよい。 検体中に存在するエンテロトキシンの量は予め作製した
標識曲線により正確にかつ迅速に測定する。 （発明の効果） 本発明では、微生物の産生じたエンテロトキシンを簡便
で、迅速な操作により正確に測定できる。 （実施例） 次に実施例により本発明を説明する。 （１）　　［１ブドウ球菌エンテロトキシンＡの調製品
用らの方法〔日細誌３０．Ｈ３，（１９７５）　）によ
り調製した。即ち黄色ブドウ球菌Ｆ　Ｒｌ−７２２を用
い３％ＮＺアミンープロティンヒドロラーゼ（以下ＰＨ
Ｐと略す）培地を用い、１６〜１８時間振盪培養し、遠
心分離により上清と菌体を分離し、この上清と、８Ｎ−
ＨＣＩでｐｌｌを５．７に調製した。４倍量の蒸留水で
希釈したものをＯ，ＯＩＭ！Ｊン酸緩衝液ｐＨ５，７で
平衡化したＣＭ−セファデックスを添加しバッチクロマ
トを行う。毒素吸着樹脂をカラムにつめｌ）［５，７の
０．０！にリン酸緩衝液（ｐＨ５，７）で洗浄後、毒素
溶出はｐｌｌ５　、フの０．０！Ｍリン酸緩衝液とｐａ
’ｙ　。 ５のＯ，ＩＮリン酸緩衝液によるグラシュエンド溶出を
行った。次いで毒素活性分画を集め０．０２５Ｍグリシ
ン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９，５）で平衡化したＤＥＡ
Ｅ−セファデックスカラムクロマトにかけ、毒素溶出は
０．０２５１１グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９，５
）と０．２ＭＮ　ａ　Ｃｌを含む０．０５Ｍグリシン−
ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９，５）によるグラシュエンド溶
出を行なう。さらに、セファデックスＧ−７５ゲル濾過
後、精製水に対し透析後、凍結乾燃し、精製ブドウ球菌
エンテロトキシンＡとした。 ■　ブドウ球菌エンテロトキシンＡに対する抗血清 ブドウ球菌エンテロトキシンＡにする抗血清は精製ブド
ウ球菌エンテロトキシンＡを初回１０μｇ　（０，５ｍ
１）とフロイントの完全アジュバント（０，５ｍ１）を
混ぜ、１１のウサギの背部皮下に接種した。７〜９３！
ｌ目にブースターとして同量（１０Ｍｇ）のブドウ球菌
エンテロトキシンＡをアジュバントを加えないで皮下に
注射した。力価が最高になった１１〜１３週に採血した
。 ■　抗ブドウ球菌エンテロトキシンＡ抗血清よりのＩｇ
Ｇ画分の調製 得られたブドウ球菌エンテロトキシンＡに対するウサギ
抗血清をプロティンＡ結合セファローズＣＬ−４Ｂ　（
ファルマシア製）カラムに通し、波長２８０ｎ■におけ
る吸光度がｏ、ｏｓｏ以下になるまで０．０１Ｍ　Ｐ　
Ｂ　Ｓで洗浄した。次いでプロティンＡ結合セファロー
ズＣＬ−４Ｂに結合しているＩｇＧ画分を０．１翼グリ
シン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２，７）で溶出した。溶出後
、すぐに２１）リスアミノメタンを用いて中和し、０．
０１ＭＰ　Ｂ　Ｓ　ＣｐＨ７，２）に対し透析する。透
析後精製抗ブドウ球エンテロトキシンＡウサギＩｇＧと
して使用に供した。 （２）　Ｆ（ａｂ’）ｍ　フラグメントの調製抗ブドウ
球菌エンテロトキシンＡウサギＩｇＧにペプシン（ブタ
腸粘膜由来、シグマ社製）ＩＯＷ／Ｖ％を加え、３７℃
、１６時間処理し、セファデックスＧ−２００ゲル瀘過
によりＦ（ａｂ’　）ｍ　フラグメントを得た。 ■　抗ブドウ球菌エンテロトキシンＡウサギＩｇＧをペ
ルオキシダーゼの結合体の調製過ヨウ素酸塩酸化法（Ｎ
ａｋａｎｅ、　Ｐ、に、＋　＆　Ｋａｖａｏｉ。 Ａ、；　Ｊ、旧ｓｔｏｃｈｅｍ、　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、
　２２．１０８４−１０９Ｌ（１９７４）］により、抗
ブドウ球菌エンテロトキシンＡウサギＩｇＧと西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ（東洋紡製、グレードＩ−Ｇ）を結
合し、セファデックスＧ−２００ゲル濾過により、ペル
オキシダーゼ標識抗ブドウ球菌エンテロトキシンＡウサ
ギＩｇＧを得た。 ■　抗体結合固相の調製 抗ブドウ球菌エンテロトキシンＡウサギＩｇＧを経ｌへ
インチポリスチレンボールに物理的に反応により吸着さ
せた。即ち、抗ブドウ球菌エンテロトキシンＡウサギＩ
ｇＧを０．１Ｍ炭酸緩衝液ＰＨ８，５に２０〜３０μｇ
／ｍｌに調製した液にポリスチレンボールを浸漬し、室
温４時間、４℃、液装置した。 ０．０１Ｍ　Ｐ　Ｂ　Ｓ　（ｐＨ７，２）啓洗浄後、１
％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％　Ｐ　Ｂ　Ｓ
　（ｐＨ７，２）に使用まで保存した。抗体結合固相は
、少なくとも６力月は安定であった。 ■　　測　　定　　操　　作 標準ブドウ球菌エンテロトキシンＡは、精製ブドウ球菌
エンテロトキシンＡを、所定濃度になるように０．０１
１　Ｐ　Ｂ　Ｓに溶解調製したものを用いた。 標準ブドウ球菌エンテロトキシンＡ液、Ｏ，１＊ｌある
いは、食中毒を生じさせた食品１０ｇを生理食塩水９０
＋ｓｌで抽出した上清（０，１＊ｌ）を、内径１０１■
、高さ３０龍の試験管が２０個結合したイムノボールト
レー（小野薬品工業社製）の中に入れ、正常家兎血清４
　Ｖ／Ｖ９４を含む、Ｏ，ａｌＮ　Ｐ　Ｂ　Ｓ　ｐＨ７
，２，０，２１を添加混合後、抗体結合ボールを１個入
れ、３７℃で、１時間、静置し反応させた。１時間後、
アスピレータ−を用いて、トレイ中の溶液を吸引除去し
、　０．０１１　ＰＢＳ　　（ｐＨ７，２）を用いて３
回洗浄後、０．２５Ｗ／Ｖ％ＢＳＡを含む０．０１Ｍ　
Ｐ　Ｂ　Ｓ（ｐＨ７，２）で至適活性濃度に調整した。 酵素標識抗体０．２５ｍ１加え、３７℃、２時間反応さ
せた。反応後、ｏ、０１Ｍ　Ｐ　Ｂ　Ｓ　（ｐＨ７，２
）を用（Ｓで３回洗浄後、新たな試験管ボックス（イム
ノボール・スピッツボックス）にボールのみ移し、０．
０２％Ｈｚ　Ｏ＊　、Ｏ−フェニレンジアミン・２ＨＣ
１（牛丼化学社製）３■／■ｌ含む、０．２Ｍクエン酸
、Ｇ、１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ５、フ、０．５１を加え、
暗所、室温で１時間反応させた。１時間後、ＩＮ−硫酸
２１を加え酵素反応を停止後、波長４９２ｎ■での吸光
度を測定した。得られたブドウ球菌エンテロトキシンＡ
の標準曲線を第１図に示す。食品中のブドウ球菌エンテ
ロトキシンＡは、この標準曲線より求められた。又、ブ
ドウ球菌エンテロトキシンの他の型、即ちＢ、Ｃ％Ｄ％
Ｅに対する交差反応は、Ｅ　２０　ｎｇ／ｍｌに対し２
％程度の交差反応を示した。しかし他の８１Ｃ１Ｄに対
してはエンテロトキシン１．０００ｗ／ｍｌ程度でも反
応は示さなかった。 実施例　２ 手続補正書（自発） 昭和６０年１１月　８日 １、事件の表示 昭和６０年特許願第２０５７０号 ２　発明の名称 エンテロトキシンの定量法 ３、　補正をする者 事件との関係　　特許出願人 大阪市北区堂島浜二丁目２番８号 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ＆　補正の内容 「実施例」を「実施例１」に訂正する。 ■　同第２０頁第２行目 「糖製抗体」を「精製抗体」に訂正する。 ■　同第７頁 （昭和８０年２月１９日提出の手続補正書別紙第７頁の
第９行目） ｒｏ、１ｍｆｆ１Ｊをｒｏ、８ｍｆｆ１Ｊに訂正する。 （２）同第１３頁 （昭和６０年２月１９日提出の手続補正書別紙第１３頁
の第１８行目） 「上清と」を「上演を」に訂正する。 ■　同第１４頁 （昭和６０年２月１９日提出の手続補正書別紙第１４頁
の第２行目） ｒ　（ｐＨ５，７）　Ｊを削除する。 ■　同第１６頁 （昭和６０年２月１９日提出の手続補正書別紙第１６頁
の第１５行目） 「物理的に」を「物理的な」に訂正する。 ■　同第１６頁 （昭和６０年２月１９日提出の手続補正書別紙第１６頁
の第１８行目 「液装置した。」を「−夜装置した。」に訂正する。 ■　同第１６頁 （昭和８０年２月１９日提出の手続補正書別紙第１６頁
の末行） 「啓」を「で」に訂正する。 （ｇｌ　　同第１７頁 （昭和６０年２月１９日提出の手続補正書別紙第１７頁
第１行目） ｒｏ、１％」の次に「アジ化ナトリウム（ＮａＨ，）を
含む０．０１ＭＪを挿入する。 以　　　　上

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）エンテロトキシン含有液を抗エンテロトキシン抗
   体不溶化担体および酵素標識抗エンテロトキシン抗体と
   反応させ、結合した酵素標識抗エンテロトキシン抗体ま
   たは未結合の酵素標識抗エンテロトキシン抗体の酵素活
   性を測定することにより、エンテロトキシンを定量する
   ことを特徴とするエンテロトキシンの定量法。
2. （２）エンテロトキシン含有液を抗エンテロトキシン抗
   体不溶化担体と反応させ、エンテロトキシン−抗エンテ
   ロトキシン抗体不溶化担体複合体を形成し、次いで該複
   合体と酵素標識抗エンテロトキシン抗体と反応させ、該
   複合体と結合した酵素標識抗エンテロトキシン抗体の酵
   素活性を測定することにより、エンテロトキシンを定量
   することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のエン
   テロトキシンの定量法。
3. （３）エンテロトキシン含有液を酵素標識抗エンテロト
   キシン抗体と反応させ、エンテロトキシン−酵素標識抗
   エンテロトキシン抗体複合体を形成し、次いで該複合体
   と抗エンテロトキシン抗体不溶化担体を反応させ、該担
   体に結合した酵素標識抗エンテロトキシン抗体の酵素活
   性を測定することにより、エンテロトキシンを定量する
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のエンテロ
   トキシンの定量法。
4. （４）エンテロトキシン含有液と酵素標識抗エンテロト
   キシン抗体複合体と抗エンテロトキシン抗体不溶化担体
   とを同時に反応させ、該担体に結合した酵素標識抗エン
   テロトキシン抗体の酵素活性を測定することにより、エ
   ンテロトキシンを定量することを特徴とする特許請求の
   範囲第１項記載のエンテロトキシンの定量法。