JPS61178661A - エンテロトキシンの定量法 - Google Patents
エンテロトキシンの定量法Info
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- JPS61178661A JPS61178661A JP2057085A JP2057085A JPS61178661A JP S61178661 A JPS61178661 A JP S61178661A JP 2057085 A JP2057085 A JP 2057085A JP 2057085 A JP2057085 A JP 2057085A JP S61178661 A JPS61178661 A JP S61178661A
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明はエンテロトキシンの定量法に関し、特に食品中
に混入したブドウ球菌あるいはセレウス菌の産生ずる毒
素（以下エンテロトキシンと略す）を検出する方法に関
するものである。
に混入したブドウ球菌あるいはセレウス菌の産生ずる毒
素（以下エンテロトキシンと略す）を検出する方法に関
するものである。
特に食品衛生検査上、食中毒を生じせしめたエンテロト
キシン究明を行う際、食品及び患者材料（吐物）中に存
在するエンテロトキシンを正確に定■することにより、
食中毒の診断を行うものである。
キシン究明を行う際、食品及び患者材料（吐物）中に存
在するエンテロトキシンを正確に定■することにより、
食中毒の診断を行うものである。
（従来の技術）
従来からエンテロトキシンの定量法としては次のような
方法が行なわれている。食中毒を生じさせたと推定され
る食品１０ｇを９０ｍ１の生理食塩水あるいはリン酸緩
衝生理食塩水（以下ＰＢＳと略す）にてホモジネートし
、その０．１１をマンニット−食塩−卵黄寒天培地に塗
抹し、３７℃で２４〜４８時間培養を行い、生じたコロ
ニーを計測して、食品１ｇ中の菌数を出す。食品１ｇ中
の菌数が１０個以上の場合、菌による食中毒と推定され
る。次いで、コアグラーゼ産生性を１０倍希釈ウサギプ
ラズマ０．５μｌにブレーンハートインフュージョン培
地（以下ＢＨＩと略す）培養被検菌５１を加え、３〜２
４時間後、プラズマの凝固又は、フィブリンの析出が認
められるかどうか判定し、凝固した場合には黄色ブドウ
球菌と同定される。
方法が行なわれている。食中毒を生じさせたと推定され
る食品１０ｇを９０ｍ１の生理食塩水あるいはリン酸緩
衝生理食塩水（以下ＰＢＳと略す）にてホモジネートし
、その０．１１をマンニット−食塩−卵黄寒天培地に塗
抹し、３７℃で２４〜４８時間培養を行い、生じたコロ
ニーを計測して、食品１ｇ中の菌数を出す。食品１ｇ中
の菌数が１０個以上の場合、菌による食中毒と推定され
る。次いで、コアグラーゼ産生性を１０倍希釈ウサギプ
ラズマ０．５μｌにブレーンハートインフュージョン培
地（以下ＢＨＩと略す）培養被検菌５１を加え、３〜２
４時間後、プラズマの凝固又は、フィブリンの析出が認
められるかどうか判定し、凝固した場合には黄色ブドウ
球菌と同定される。
さらに黄色ブドウ球菌の産生ずるエンテロトキシンを測
定する場合、被検菌を３％ＮＺ−アミン培地又はＢＨＩ
培地で振盪培養し、培養液を遠心後、ミクロスライドゲ
ル内沈降反応法により、一方にエンテロトキシンを動物
に免疫して得た抗血清を入れ、他方に培養遠心上清を倍
数希釈してそれぞれの穴に入れ、４８時間湿箱中で反応
させ、抗血清を入れた穴と各希釈液との間に沈降線、の
有無を判定する。あるいはエンテロトキシンに対する抗
血清をポリエチレン等のラテックスに結合させたものを
用いて培養上清を倍数希釈し、凝集を示す最高希釈倍数
を求め、本方法の最少検出感度によりエンテロトキシン
を求めるラテックス凝集反応が用いられている。
定する場合、被検菌を３％ＮＺ−アミン培地又はＢＨＩ
培地で振盪培養し、培養液を遠心後、ミクロスライドゲ
ル内沈降反応法により、一方にエンテロトキシンを動物
に免疫して得た抗血清を入れ、他方に培養遠心上清を倍
数希釈してそれぞれの穴に入れ、４８時間湿箱中で反応
させ、抗血清を入れた穴と各希釈液との間に沈降線、の
有無を判定する。あるいはエンテロトキシンに対する抗
血清をポリエチレン等のラテックスに結合させたものを
用いて培養上清を倍数希釈し、凝集を示す最高希釈倍数
を求め、本方法の最少検出感度によりエンテロトキシン
を求めるラテックス凝集反応が用いられている。
（発明が解決しようとする問題点）
このように食中毒の原因解明には、食品中の菌の分離、
同定、エンテロトキシン量の定量といった一連の操作は
繁雑で、簡単に行なうことは不可能であった。本発明者
等は、食品中のエンテロトキシン、を直接定量する高感
度で、しかも簡便゛な方法を開発すべく鋭意研究した結
果本発明に到達した。
同定、エンテロトキシン量の定量といった一連の操作は
繁雑で、簡単に行なうことは不可能であった。本発明者
等は、食品中のエンテロトキシン、を直接定量する高感
度で、しかも簡便゛な方法を開発すべく鋭意研究した結
果本発明に到達した。
（問題点を解決するための方法）
すなわち本発明は、エンテロトキシン含有液を抗エンテ
ロトキシン抗体不溶化担体および酵素標識抗エンテロト
キシン抗体と反応させ、結合した酵素標識抗エンテロト
キシン抗体または未結合の酵素標識抗エンテロトキシン
抗体の酵素活性を測定することによりエンテロトキシン
を定量することを特徴とするエンテロトキシンの定量法
である。
ロトキシン抗体不溶化担体および酵素標識抗エンテロト
キシン抗体と反応させ、結合した酵素標識抗エンテロト
キシン抗体または未結合の酵素標識抗エンテロトキシン
抗体の酵素活性を測定することによりエンテロトキシン
を定量することを特徴とするエンテロトキシンの定量法
である。
エンテロトキシンは黄色ブドウ球菌の産生ずる催吐活性
毒素に対して与えられた固有名詞と理解されてきたが、
近年コレラ菌、大組Ｌウェルシュ菌の下痢性毒素もエン
テロトキシンと呼ばれるようになった。そこで、従来よ
りのエンテロトキシンは国名を付してブドウ球菌エンテ
ロトキシンと呼ぶようになった。本発明はこれらの全て
のエンテロトキシンの定量を含有しているものである。
毒素に対して与えられた固有名詞と理解されてきたが、
近年コレラ菌、大組Ｌウェルシュ菌の下痢性毒素もエン
テロトキシンと呼ばれるようになった。そこで、従来よ
りのエンテロトキシンは国名を付してブドウ球菌エンテ
ロトキシンと呼ぶようになった。本発明はこれらの全て
のエンテロトキシンの定量を含有しているものである。
ブドウ球菌食中毒は菌体外毒素により発生する疾患であ
ることが、１９３０年代にＤａｃｋｓ （Ｄａｃｋ 、
Ｇ 、１． 。
ることが、１９３０年代にＤａｃｋｓ （Ｄａｃｋ 、
Ｇ 、１． 。
Ｃａｒｙ、 Ｗ、！、、 Ｗｏｏｌｐｅｒｔ、 ｏ、Ｉ
Ｗｉｇｇｌｎｇ＋ Ｈ，Ｊ、 ： Ｊ。
Ｗｉｇｇｌｎｇ＋ Ｈ，Ｊ、 ： Ｊ。
Ｐｒｅｖ、 ｌｅｄ、、 ４． ｌＧ？、（１９３０）
）によって証明され、このエンテロトキシンが単離精製
された。このブドウ球菌エンテロトキシンにはＡ、Ｂ、
Ｃ，Ｄ及びＥの５つのタイプが存在することも明らかに
されている。これらの５つのタイプは、従来の技術の項
で述べたようなゲル内沈降反応により、特異的沈降パタ
ーンにより区別することが可能であり、５つのタイプの
中にも、共通抗原が存在することも又明らかである。こ
れらのエンテロトキシンの分離、精製法は別冊、蛋白質
、核酸、酵素１１．８９ （１９７Ｂ）に詳細に記載さ
れているように培養上清を出発原料にしてＣＭ−セファ
ローズカラムクロマトグラフイー、セファデックスＧ−
１００゜セファデックスＧ−７５によるゲル濾過を繰返
し行う操作が多く用いられる。
）によって証明され、このエンテロトキシンが単離精製
された。このブドウ球菌エンテロトキシンにはＡ、Ｂ、
Ｃ，Ｄ及びＥの５つのタイプが存在することも明らかに
されている。これらの５つのタイプは、従来の技術の項
で述べたようなゲル内沈降反応により、特異的沈降パタ
ーンにより区別することが可能であり、５つのタイプの
中にも、共通抗原が存在することも又明らかである。こ
れらのエンテロトキシンの分離、精製法は別冊、蛋白質
、核酸、酵素１１．８９ （１９７Ｂ）に詳細に記載さ
れているように培養上清を出発原料にしてＣＭ−セファ
ローズカラムクロマトグラフイー、セファデックスＧ−
１００゜セファデックスＧ−７５によるゲル濾過を繰返
し行う操作が多く用いられる。
本発明に用いられる抗エンテロトキシン抗体は次のよう
にして得ることができる。すなわち、上記のようにして
分離、精製したエンテロトキシンに対する抗血清を得る
には、例えばエンテロトキシン６０μｇ／■ｌ、 ＯＪ
ｍｌとフロイントの完全アジュバント０．１１を等全混
合しウサギ皮下に注射し、さらに６〜７週後に追加免疫
し、最初の免疫より１０〜ｌｌａ目で全採血する。得ら
れたエンテロトキシンに対する抗血清の力価、純度はゲ
ル内沈降反応により検定する。
にして得ることができる。すなわち、上記のようにして
分離、精製したエンテロトキシンに対する抗血清を得る
には、例えばエンテロトキシン６０μｇ／■ｌ、 ＯＪ
ｍｌとフロイントの完全アジュバント０．１１を等全混
合しウサギ皮下に注射し、さらに６〜７週後に追加免疫
し、最初の免疫より１０〜ｌｌａ目で全採血する。得ら
れたエンテロトキシンに対する抗血清の力価、純度はゲ
ル内沈降反応により検定する。
このようにして得られたエンテロトキシンに対する抗血
清を用いて、抗体画分を通常の３３％飽和硫安塩析−Ｄ
ＥＡＥセファローズカラムクロマトグラフィーにより１
ｇ０ｍ分を得る。又別法としてプロティンＡ結合セファ
ローズＣＬ−４Ｂに抗血清を通し、ＰＢＳで洗浄後吸む
されたＩｇＧを、グリシン−塩酸緩衝液ｐＨ２，７を用
いて溶出する。
清を用いて、抗体画分を通常の３３％飽和硫安塩析−Ｄ
ＥＡＥセファローズカラムクロマトグラフィーにより１
ｇ０ｍ分を得る。又別法としてプロティンＡ結合セファ
ローズＣＬ−４Ｂに抗血清を通し、ＰＢＳで洗浄後吸む
されたＩｇＧを、グリシン−塩酸緩衝液ｐＨ２，７を用
いて溶出する。
溶出後、直ちに２Ｍ）リスアミノメタンで中和後、ＰＢ
Ｓに対し一夜透析することによりＩｇＧに精製すること
もできる。さらに動物より得られる抗血清以外でもハイ
ブリドーマ法によるモノクロナール抗体も利用すること
ができる。
Ｓに対し一夜透析することによりＩｇＧに精製すること
もできる。さらに動物より得られる抗血清以外でもハイ
ブリドーマ法によるモノクロナール抗体も利用すること
ができる。
このようにして得た抗エンテロトキシンの１１０画分を
不溶性担体に結合する方法としては物理吸着を利用して
も良く、又通常蛋白質あるいは酵素を不溶化するに用い
られる方法を用いて共存結合させても良い。例えば不溶
性多糖類を用いる場合であれば、不溶性多糖を臭化シア
ン、過ヨーソ酸ナトリウム、エピクロルヒドリンｌ、１
′−力ルボニルジイミダゾール等で活性化して結合反応
を行なわせる。又、固相に適当なスペーサーを導入後、
スペーサーを介して抗エンテロトキシン抗体を結合させ
ても良い。
不溶性担体に結合する方法としては物理吸着を利用して
も良く、又通常蛋白質あるいは酵素を不溶化するに用い
られる方法を用いて共存結合させても良い。例えば不溶
性多糖類を用いる場合であれば、不溶性多糖を臭化シア
ン、過ヨーソ酸ナトリウム、エピクロルヒドリンｌ、１
′−力ルボニルジイミダゾール等で活性化して結合反応
を行なわせる。又、固相に適当なスペーサーを導入後、
スペーサーを介して抗エンテロトキシン抗体を結合させ
ても良い。
本発明で使用する抗エンテロトキシン抗体は、１１０画
分をそのまま用いても良いが、抗原結合部位のみを分離
したものでも良い。即ち、パパイン、ペプシンなどのプ
ロテアーゼで処理して得られるＦａｂ＋ Ｆａｂ’、
Ｆ （ａｂ’） 、部分なども使用することができる。
分をそのまま用いても良いが、抗原結合部位のみを分離
したものでも良い。即ち、パパイン、ペプシンなどのプ
ロテアーゼで処理して得られるＦａｂ＋ Ｆａｂ’、
Ｆ （ａｂ’） 、部分なども使用することができる。
本発明の不活性担体としては、ポリスチレン等のプラス
チック、ガラスあるいはアガロース、デキマトラン、セ
ルロース等の多糖類が使用でき、形態としては、ビーズ
吠、繊維吠、チューブ吠等種々の形態が利用できる。又
、酵素を標識剤として１１０画分に結合させる方法とし
てグルタルアルデヒドを架橋剤として用いる方法（Ａｖ
ｒａｍｅａｓ、Ｓ、；１ｍｍｕｎｏｃｈｅ１ｓｔｒｙ、
８．４３−５２．１９９９）及びペルオキシダーゼを
標識剤として用いる１ｌａｋａｎｅの過ヨーソ酸酸化法
（Ｎａｋａｎｅ、 Ｐ、に、、 ＆ Ｋａｗａｏｌ、
Ａ、； Ｊ、旧５ｔｏｃｈｅｓ＋、 Ｃｙｔｏａｂｅｔ
ａ、 ２２．１０８４−１０９３．１９７４） ＋さら
にβ−ガラクトシダーゼを標識剤とし、マレイミドを架
橋剤として用いる方法（加藤兼房、石川栄治：免疫実験
操作法、ＩＶ、 １９７５ Ｐ１１３））により、標識
酵素と抗体の１１０画分あるいはＦａｂ、Ｆａｂ；Ｆ（
ａｂ’ ）。
チック、ガラスあるいはアガロース、デキマトラン、セ
ルロース等の多糖類が使用でき、形態としては、ビーズ
吠、繊維吠、チューブ吠等種々の形態が利用できる。又
、酵素を標識剤として１１０画分に結合させる方法とし
てグルタルアルデヒドを架橋剤として用いる方法（Ａｖ
ｒａｍｅａｓ、Ｓ、；１ｍｍｕｎｏｃｈｅ１ｓｔｒｙ、
８．４３−５２．１９９９）及びペルオキシダーゼを
標識剤として用いる１ｌａｋａｎｅの過ヨーソ酸酸化法
（Ｎａｋａｎｅ、 Ｐ、に、、 ＆ Ｋａｗａｏｌ、
Ａ、； Ｊ、旧５ｔｏｃｈｅｓ＋、 Ｃｙｔｏａｂｅｔ
ａ、 ２２．１０８４−１０９３．１９７４） ＋さら
にβ−ガラクトシダーゼを標識剤とし、マレイミドを架
橋剤として用いる方法（加藤兼房、石川栄治：免疫実験
操作法、ＩＶ、 １９７５ Ｐ１１３））により、標識
酵素と抗体の１１０画分あるいはＦａｂ、Ｆａｂ；Ｆ（
ａｂ’ ）。
分を結合させることができる。“
ａ！識酵素としては、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラ
クトシダーゼのほかにアルカリホスファターゼ、ゲルコ
ールオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等通常用いられ
る酵素であればいずれでも良いが、特にペルオキシダー
ゼが、測定感度が高いために好ましい。
クトシダーゼのほかにアルカリホスファターゼ、ゲルコ
ールオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等通常用いられ
る酵素であればいずれでも良いが、特にペルオキシダー
ゼが、測定感度が高いために好ましい。
又、酵素基質−発色剤としては、一般に用いられている
ものが使用可能であり、ペルオキシダーゼの場合には、
過酸化水素と０−フェニレンジアミン・２ＨＣ９，過酸
化水素と２，２′−アジノージ−（３−エチレンベンツ
チアゾリンスルホン酸■〕とが、感度の点より用いられ
、又、蛍光基質として過酸化水素と３（ｐ−ヒドロキシ
フェニル）プロピオン酸（ＨＰＰＡと略す）も使用可能
であり、β−Ｄ−ガラクトシダーゼの場合、０−ニトロ
フェニルβ−ローガラクトシドあるいは蛍光基質として
４−メチルウンベリフェリルβ−ローガラクトシドを用
いることができる。さらにアルカリホスファターゼの場
合には、ｐ−ニトロフェノール・リン酸や蛍光基質とし
ての４−メチルウンベリフェリル・リン酸の使用もでき
る。
ものが使用可能であり、ペルオキシダーゼの場合には、
過酸化水素と０−フェニレンジアミン・２ＨＣ９，過酸
化水素と２，２′−アジノージ−（３−エチレンベンツ
チアゾリンスルホン酸■〕とが、感度の点より用いられ
、又、蛍光基質として過酸化水素と３（ｐ−ヒドロキシ
フェニル）プロピオン酸（ＨＰＰＡと略す）も使用可能
であり、β−Ｄ−ガラクトシダーゼの場合、０−ニトロ
フェニルβ−ローガラクトシドあるいは蛍光基質として
４−メチルウンベリフェリルβ−ローガラクトシドを用
いることができる。さらにアルカリホスファターゼの場
合には、ｐ−ニトロフェノール・リン酸や蛍光基質とし
ての４−メチルウンベリフェリル・リン酸の使用もでき
る。
本発明の定量法はエンテロトキシン含有液を抗エンテロ
トキシン抗体不溶化担体および酵素標識抗エンテロトキ
シン抗体と反応させ、結合した酵素標識抗エンテロトキ
シン抗体または未知の酵素標識抗エンテロトキシン抗体
の酵素活性を測定することにより、エンテロトキシン定
量する方法である。
トキシン抗体不溶化担体および酵素標識抗エンテロトキ
シン抗体と反応させ、結合した酵素標識抗エンテロトキ
シン抗体または未知の酵素標識抗エンテロトキシン抗体
の酵素活性を測定することにより、エンテロトキシン定
量する方法である。
具体的には次のような方法がある。
（１） エンテロトキシン含有液を抗エンテロトキシ
ン抗体不溶化担体と反応させ、エンテロトキシン−抗エ
ンテロトキシン抗体不溶化担体複合体を形成しく第１段
反応）、次いで該複合体と酵素標識抗エンテロトキシン
抗体を反応させ（第２段反応）、該複合体と結合した酵
素標識抗エンテロトキシン抗体の酵素活性を測定するこ
とにより、エンテロトキシンを定量する。
ン抗体不溶化担体と反応させ、エンテロトキシン−抗エ
ンテロトキシン抗体不溶化担体複合体を形成しく第１段
反応）、次いで該複合体と酵素標識抗エンテロトキシン
抗体を反応させ（第２段反応）、該複合体と結合した酵
素標識抗エンテロトキシン抗体の酵素活性を測定するこ
とにより、エンテロトキシンを定量する。
■ エンテロトキシン含有液を酵素標識抗エンテロトキ
シン抗体と反応させ、エンテロトキシン−酵素標識抗エ
ンテロトキシン抗体複合体を抗エンテロトキシン抗体不
溶化担体を反応させ（第２段反応）、該担体に結合した
酵素標識抗エンテロトキシン抗体の酵素活性を測定する
ことにより、エンテロトキシンを定量する。
シン抗体と反応させ、エンテロトキシン−酵素標識抗エ
ンテロトキシン抗体複合体を抗エンテロトキシン抗体不
溶化担体を反応させ（第２段反応）、該担体に結合した
酵素標識抗エンテロトキシン抗体の酵素活性を測定する
ことにより、エンテロトキシンを定量する。
（３） エンテロトキシン含を液と酵素標識抗エンテ
ロトキシン抗体複合体と抗エンテロトキシン抗体不溶化
担体とを同時に反応させ、該担体に結合した酵素標識抗
エンテロトキシン抗体の酵素活性を測定することにより
、エンテロトキシンを定量する。
ロトキシン抗体複合体と抗エンテロトキシン抗体不溶化
担体とを同時に反応させ、該担体に結合した酵素標識抗
エンテロトキシン抗体の酵素活性を測定することにより
、エンテロトキシンを定量する。
上記反応は温度４〜４５℃、特に３７℃付近で行なうこ
とが好ましく、反応ＰＨは中性付近、特にｐＨ７〜７．
５付近であることが好ましい。酵素活性測定は酵素の至
適ＰＨ１付近で行なうことが好ましい。
とが好ましく、反応ＰＨは中性付近、特にｐＨ７〜７．
５付近であることが好ましい。酵素活性測定は酵素の至
適ＰＨ１付近で行なうことが好ましい。
反応時間は特に制限はないが、逐次反応法の（１）およ
び■においては、第１段反応を約３０分〜約２時間ある
いは一夜放置後、第２段反応を約３０分〜約２時間ある
いは一夜放置する。同時反応法の（３）においては、約
１０分〜約５時間反応させる。反応温度、反応ｐａおよ
び反応時間は必要により変化してもよい。
び■においては、第１段反応を約３０分〜約２時間ある
いは一夜放置後、第２段反応を約３０分〜約２時間ある
いは一夜放置する。同時反応法の（３）においては、約
１０分〜約５時間反応させる。反応温度、反応ｐａおよ
び反応時間は必要により変化してもよい。
酵素活性測定は結合した酵素標識抗エンテロトキシン抗
体の酵素活性に代えて未結合の酵素標識抗エンテロトキ
シン抗体の酵素活性を測定してもよい。
体の酵素活性に代えて未結合の酵素標識抗エンテロトキ
シン抗体の酵素活性を測定してもよい。
検体中に存在するエンテロトキシンの息は予め作製した
標識曲線により正確にかつ高感度で測定する。
標識曲線により正確にかつ高感度で測定する。
（発明の効果）
本発明では、微生物の産生したエンテロトキシンを簡便
で、迅速な操作により正確に測定でき、食中毒原因解明
ができる。
で、迅速な操作により正確に測定でき、食中毒原因解明
ができる。
（実施例）
次に実施例により本発明を説明する。
（１） 精製ブドウ球菌エンテロトキシンＡの調製品
用らの方法〔日細誌３Ｇ、８８３．（１９７５）〕によ
り調製した。即ち黄色ブドウ球菌Ｆ Ｒｌ−７２２を用
い３％ＮＺアミンープロティンヒドロラーゼ（以下ＰＨ
Ｐと略す）培地を用い、１６〜１８時間振盪培養し、遠
心分離により培養上清を得、８Ｎ−ＨＣＩでｐＨを５．
７に調製した。４倍量の蒸留水で希釈したものを０．０
ＩＭリン酸緩衝液ｐＨ５，７で平衡化したＣＭ−セファ
デックスによるバッチクロマトを行い、カラムにつめｐ
Ｈ５，７のｏ、０１Ｍリン酸緩衝液で洗浄後、 ｐＨ５
，７の０．０１Ｍリン酸緩衝液とｐＨ７，５の０．１Ｍ
リン酸緩衝液でグラシュエンド溶出した。次いで０．０
２５Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ９，５テ平衡化し
たＤＥＡＥ−セファデックスカラムクロマトにかけ、０
．０２５Ｍグリシン−ＮＡＯＨ緩衝液ｐＨ９，５と０．
２ＮＮ ａ Ｃｌを含む０．０５Ｍグリシン−ＮａＯＨ
緩衝液ｐＨ９，５でグラシュエンド溶出し、セファデッ
クスＧ−７５ゲル濾過後、精製水に対し透析後、凍結乾
熾し、精製ブドウ球菌エンテロトキシンＡとした。
用らの方法〔日細誌３Ｇ、８８３．（１９７５）〕によ
り調製した。即ち黄色ブドウ球菌Ｆ Ｒｌ−７２２を用
い３％ＮＺアミンープロティンヒドロラーゼ（以下ＰＨ
Ｐと略す）培地を用い、１６〜１８時間振盪培養し、遠
心分離により培養上清を得、８Ｎ−ＨＣＩでｐＨを５．
７に調製した。４倍量の蒸留水で希釈したものを０．０
ＩＭリン酸緩衝液ｐＨ５，７で平衡化したＣＭ−セファ
デックスによるバッチクロマトを行い、カラムにつめｐ
Ｈ５，７のｏ、０１Ｍリン酸緩衝液で洗浄後、 ｐＨ５
，７の０．０１Ｍリン酸緩衝液とｐＨ７，５の０．１Ｍ
リン酸緩衝液でグラシュエンド溶出した。次いで０．０
２５Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ９，５テ平衡化し
たＤＥＡＥ−セファデックスカラムクロマトにかけ、０
．０２５Ｍグリシン−ＮＡＯＨ緩衝液ｐＨ９，５と０．
２ＮＮ ａ Ｃｌを含む０．０５Ｍグリシン−ＮａＯＨ
緩衝液ｐＨ９，５でグラシュエンド溶出し、セファデッ
クスＧ−７５ゲル濾過後、精製水に対し透析後、凍結乾
熾し、精製ブドウ球菌エンテロトキシンＡとした。
■ ブドウ球菌エンテロトキシンＡに対する抗血清
ブドウ球菌エンテロトキシンＡにする抗血清は精製ブド
ウ球菌エンテロトキシンＡを初回１０μｇ （０，５ｍ
１）とフロイントの完全アジュバント（０，５ｍ１）を
混ぜ、１膳！のウサギの背部皮下に接種した。７〜９週
目にブースターとしておのおの同量のブドウ球菌エンテ
ロトキシンＡをアジュバンドを加えないで皮下に免疫し
た。力価が最高になった１１〜１３週に採血した。
ウ球菌エンテロトキシンＡを初回１０μｇ （０，５ｍ
１）とフロイントの完全アジュバント（０，５ｍ１）を
混ぜ、１膳！のウサギの背部皮下に接種した。７〜９週
目にブースターとしておのおの同量のブドウ球菌エンテ
ロトキシンＡをアジュバンドを加えないで皮下に免疫し
た。力価が最高になった１１〜１３週に採血した。
（３） 抗ブドウ球菌エンテロトキシンＡ抗血清より
のＩｇＧ画分の調製 得られたブドウ球菌エンテロトキシンＡに対するウサギ
抗血清をプロティンＡ結合セファローズＣＬ−４Ｂ （
ファルマシア製）をつめたカラムに通し、０．０１Ｍ
Ｐ Ｂ Ｓで洗浄し、波長２８０ａｍにおける吸光度が
０．０５０以下になった段階で０．１Ｍグリシン−ＨＣ
ｌ緩衝液ｐ■２．７を通し、プロティンＡ結合セファロ
ーズＣＬ−４Ｂに結合しているＩｇＧ画分を溶出させた
。溶出後、すぐに２Ｍ）リスアミノメタンを用いて中和
し、０゜０１１ Ｐ Ｂ Ｓ （＋）Ｈ７，２）に対し
透析する。透析後精製抗ブドウ球エンテロトキシンＡウ
サギＩｇＧとして使用に供した。
のＩｇＧ画分の調製 得られたブドウ球菌エンテロトキシンＡに対するウサギ
抗血清をプロティンＡ結合セファローズＣＬ−４Ｂ （
ファルマシア製）をつめたカラムに通し、０．０１Ｍ
Ｐ Ｂ Ｓで洗浄し、波長２８０ａｍにおける吸光度が
０．０５０以下になった段階で０．１Ｍグリシン−ＨＣ
ｌ緩衝液ｐ■２．７を通し、プロティンＡ結合セファロ
ーズＣＬ−４Ｂに結合しているＩｇＧ画分を溶出させた
。溶出後、すぐに２Ｍ）リスアミノメタンを用いて中和
し、０゜０１１ Ｐ Ｂ Ｓ （＋）Ｈ７，２）に対し
透析する。透析後精製抗ブドウ球エンテロトキシンＡウ
サギＩｇＧとして使用に供した。
（４） Ｆ（ａｂ’）ｍ フラグメントの調製抗ブド
ウ球菌エンテロトキシンＡウサギＩｇＧにペプシン（ブ
タ腸粘膜由来、シグマ社製）ＩＯＷ／Ｖ％を加え、３７
℃、１６時間処理し、セファデックスＧ−２００ゲル瀘
過によりＦ（ａｂ’ ）ｔ フラグメントを得た。
ウ球菌エンテロトキシンＡウサギＩｇＧにペプシン（ブ
タ腸粘膜由来、シグマ社製）ＩＯＷ／Ｖ％を加え、３７
℃、１６時間処理し、セファデックスＧ−２００ゲル瀘
過によりＦ（ａｂ’ ）ｔ フラグメントを得た。
■ 抗ブドウ球菌エンテロトキシンＡウサギＩｇＧをペ
ルオキシダーゼの結合体の調製過ヨウ素酸塩酸化法（Ｎ
ａｋａｎｅ、 Ｐ、に、、 ＆にａｗａｏｉ＋Ａ、；
Ｊ、 Ｈｌｓｔｏｃｈｅｓ、 Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、 ２
２．１０８４−１０９Ｌ（凰３７４）】により、抗ブド
ウ球菌エンテロトキシンＡウサギＩＫＧと西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ（東洋紡製、グレードＩ−Ｃ）を結合し
、セファデックスＧ−２００ゲル濾過により、ペルオキ
シダーゼ標識抗ブドウ球菌エンテロトキシンＡウサギＩ
ｇＧを得た。
ルオキシダーゼの結合体の調製過ヨウ素酸塩酸化法（Ｎ
ａｋａｎｅ、 Ｐ、に、、 ＆にａｗａｏｉ＋Ａ、；
Ｊ、 Ｈｌｓｔｏｃｈｅｓ、 Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、 ２
２．１０８４−１０９Ｌ（凰３７４）】により、抗ブド
ウ球菌エンテロトキシンＡウサギＩＫＧと西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ（東洋紡製、グレードＩ−Ｃ）を結合し
、セファデックスＧ−２００ゲル濾過により、ペルオキ
シダーゼ標識抗ブドウ球菌エンテロトキシンＡウサギＩ
ｇＧを得た。
■ 抗体結合固相の調製
抗ブドウ球菌エンテロトキシンＡウサギＩｇＧを１／４
インチポリスチレンボールに物理吸着させた。即ち、抗
ブドウ球菌エンテロトキシンＡウサギＩｇＧを０．ＩＭ
炭酸緩衝液ｐａｓ、ｓに２０〜３０ｇｇ／ｍｌに調製し
た液にポリスチレンポールを浸漬し、室温４時間、４℃
、液装置した。０．０１Ｍ Ｐ ＨＳ （１）■７．２
）啓洗浄後、１％牛血清アルブミン（Ｂ Ｓ Ａ ）、
ｏ、ｒ％Ｐ Ｂ Ｓ （ｐＨ７，２）に使用まで保存し
た。
インチポリスチレンボールに物理吸着させた。即ち、抗
ブドウ球菌エンテロトキシンＡウサギＩｇＧを０．ＩＭ
炭酸緩衝液ｐａｓ、ｓに２０〜３０ｇｇ／ｍｌに調製し
た液にポリスチレンポールを浸漬し、室温４時間、４℃
、液装置した。０．０１Ｍ Ｐ ＨＳ （１）■７．２
）啓洗浄後、１％牛血清アルブミン（Ｂ Ｓ Ａ ）、
ｏ、ｒ％Ｐ Ｂ Ｓ （ｐＨ７，２）に使用まで保存し
た。
抗体結合固相は、少なくとも６力月は安定であった。
■ 測 定 操 作
標準ブドウ球菌エンテロトキシンＡは、精製ブドウ球菌
エンテロトキシンＡを、０．０１Ｍ Ｐ Ｂ Ｓに、所
定濃度になるように溶解調製したものを用いた。
エンテロトキシンＡを、０．０１Ｍ Ｐ Ｂ Ｓに、所
定濃度になるように溶解調製したものを用いた。
標準ブドウ球菌エンテロトキシンＡｍ、１００μ！ある
いは、食中毒を生じさせた食品１０ｇを生理食塩水９０
１に溶解ホモジネートシ、遠心分離した。上清１００μ
！を、内径１０ＩＩＩ１１高さ３０龍の試験管が２０個
結合したイムノポールトレー（小野薬品工業社製）の中
に入れ、正常家兎血清４ Ｖ／Ｖ％を含む、０．０１Ｍ
Ｐ Ｂ Ｓ ＋）１１？、２，２００μｌを追加混合
後、抗体結合ポールを１ヶ入れ、３７℃で、１時間、静
置インキュベートした。
いは、食中毒を生じさせた食品１０ｇを生理食塩水９０
１に溶解ホモジネートシ、遠心分離した。上清１００μ
！を、内径１０ＩＩＩ１１高さ３０龍の試験管が２０個
結合したイムノポールトレー（小野薬品工業社製）の中
に入れ、正常家兎血清４ Ｖ／Ｖ％を含む、０．０１Ｍ
Ｐ Ｂ Ｓ ＋）１１？、２，２００μｌを追加混合
後、抗体結合ポールを１ヶ入れ、３７℃で、１時間、静
置インキュベートした。
１時間後、アスピレータ−を用いて、液を吸引除去し、
Ｏ，ＯＩＭ Ｐ Ｂ Ｓ ｐＨ７，２を用いて３回洗浄
後、０．２５Ｗ／Ｖ％ＢＳＡを含む。０．０１Ｍ Ｐ
ＨＳ ｐＩＮ７．２で適当に希釈した。希釈したもの
（標準ブドウ球菌エンテロトキシンＡ １００ ｎｇ／
ｍｌを用いた場合に吸光度が！、θ付近になるように調
製する。）２５００１加え、３７℃、２時間、インキュ
ベートした。インキュベート終了後、 ０．ＯｆＭ Ｐ
Ｂ ５ｐＨ７，２を用いて３回洗浄後、新たな試験管
ボックス（イムノポール・スピッツボックス）にポール
のみ移し、 ０．０２％ＨｓＯａ、Ｏ−フェニレンジア
ミン・２ＨＣ１（牛丼化学社製）３■／ｍｌ含む、０．
２Ｍクエン酸、０．１関リン酸緩衝液ＰＨ５，７，０，
５１を加え、暗所、室温で１時間反応させた。
Ｏ，ＯＩＭ Ｐ Ｂ Ｓ ｐＨ７，２を用いて３回洗浄
後、０．２５Ｗ／Ｖ％ＢＳＡを含む。０．０１Ｍ Ｐ
ＨＳ ｐＩＮ７．２で適当に希釈した。希釈したもの
（標準ブドウ球菌エンテロトキシンＡ １００ ｎｇ／
ｍｌを用いた場合に吸光度が！、θ付近になるように調
製する。）２５００１加え、３７℃、２時間、インキュ
ベートした。インキュベート終了後、 ０．ＯｆＭ Ｐ
Ｂ ５ｐＨ７，２を用いて３回洗浄後、新たな試験管
ボックス（イムノポール・スピッツボックス）にポール
のみ移し、 ０．０２％ＨｓＯａ、Ｏ−フェニレンジア
ミン・２ＨＣ１（牛丼化学社製）３■／ｍｌ含む、０．
２Ｍクエン酸、０．１関リン酸緩衝液ＰＨ５，７，０，
５１を加え、暗所、室温で１時間反応させた。
１時間後、ＩＮ−硫酸２１を加え酵素反応を停止後、波
長４９２ｎｍでの吸光度を測定した。得られたブドウ球
菌エンテロトキシンＡの標準曲線を第１図に示す。食品
中のブドウ球菌エンテロトキシンＡは、この標準曲線よ
り求められた。又、ブドウ球菌エンテロトキシンの他の
型、即ちＢ％ｃ１Ｄ、Ｈについて、そのエンテロトキシ
ン濃度を１０００ ｎｇ／ｍｌとしたときの交差程度は
、Ｅのみ２０ ｎｇ／ｌ程度検出され２％程度の交差反
応を示した。
長４９２ｎｍでの吸光度を測定した。得られたブドウ球
菌エンテロトキシンＡの標準曲線を第１図に示す。食品
中のブドウ球菌エンテロトキシンＡは、この標準曲線よ
り求められた。又、ブドウ球菌エンテロトキシンの他の
型、即ちＢ％ｃ１Ｄ、Ｈについて、そのエンテロトキシ
ン濃度を１０００ ｎｇ／ｍｌとしたときの交差程度は
、Ｅのみ２０ ｎｇ／ｌ程度検出され２％程度の交差反
応を示した。
実施例 ２
（１） 精製ブドウ球菌エンテロトキシンＢの調製精
製ブドウ球菌エンテロトキシンＢの調製は実施例に示し
たような品用らの方法によって調製した。即ち、黄色ブ
ドウ球菌２４３ （ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａ
ｕｒｅｕｓ２４３ ）株を用い、３％ＮＺ−アミン加え
、３ＩＡＰＨＰ培地を用いて振盪培養し、遠心分離によ
り培養上清を得、６Ｎ−ＨＣｆでｐｎｓ、７に調製後、
蒸留水で５倍に希釈した。次いでＣＭセファデックスバ
ッチ法クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セファデックス
カラムクロマトグラフィーおよびセファデックスＧ−７
５によるゲル濾過を行い、精製水に対し透析後、凍結乾
燥し、精製ブドウ球菌エンテロトキシンＢを得た。
製ブドウ球菌エンテロトキシンＢの調製は実施例に示し
たような品用らの方法によって調製した。即ち、黄色ブ
ドウ球菌２４３ （ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａ
ｕｒｅｕｓ２４３ ）株を用い、３％ＮＺ−アミン加え
、３ＩＡＰＨＰ培地を用いて振盪培養し、遠心分離によ
り培養上清を得、６Ｎ−ＨＣｆでｐｎｓ、７に調製後、
蒸留水で５倍に希釈した。次いでＣＭセファデックスバ
ッチ法クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セファデックス
カラムクロマトグラフィーおよびセファデックスＧ−７
５によるゲル濾過を行い、精製水に対し透析後、凍結乾
燥し、精製ブドウ球菌エンテロトキシンＢを得た。
■ ブドウ球菌エンテロトキシンＢに対する抗血清
実施例１で示したブドウ球菌エンテロトキシンＡに対す
る抗血清作製法と同一の操作を行いエンテロトキシンＢ
に対する抗血清を得た。
る抗血清作製法と同一の操作を行いエンテロトキシンＢ
に対する抗血清を得た。
（３） 抗ブドウ球菌エンテロトキシンＢ抗血清より
のＩｇＧ画分の調製 実施例１で示したブドウ球菌エンテロトキシンＡに対す
る抗血清より糖製抗体を得たと同じ方法で、ブドウ球菌
エンテロトキシンＢに対する精製抗体を得た。
のＩｇＧ画分の調製 実施例１で示したブドウ球菌エンテロトキシンＡに対す
る抗血清より糖製抗体を得たと同じ方法で、ブドウ球菌
エンテロトキシンＢに対する精製抗体を得た。
（２）精製抗ブドウ球菌エンテロトキシンＢウサギＩｇ
Ｇとペルオキシダーゼの結合体の調製実施例１で示した
と同じ過ヨウ素酸塩酸化法により、ペルオキシダーゼ結
合位ブドウ球菌エンテクトキシンＢウサギＩｇＧを得た
。
Ｇとペルオキシダーゼの結合体の調製実施例１で示した
と同じ過ヨウ素酸塩酸化法により、ペルオキシダーゼ結
合位ブドウ球菌エンテクトキシンＢウサギＩｇＧを得た
。
■ 抗体結合固相の調製
実施例１で示した同じ方法で抗体結合固相を得た。
■ 測 定 操 作
実施例１で示したと同じ方法で測定操作を行い、ブドウ
球菌エンテロトキシンＢの標準曲線はエンテロトキシン
Ａに対する標準曲線と類似の標準曲線が得られた。他の
ブドウ球菌エンテロトキシンに対しては、交差反応を示
さなかった。
球菌エンテロトキシンＢの標準曲線はエンテロトキシン
Ａに対する標準曲線と類似の標準曲線が得られた。他の
ブドウ球菌エンテロトキシンに対しては、交差反応を示
さなかった。
実施例 ３゜
（１） ブドウ球菌エンテロトキシンＣの精製黄色ブ
ドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕ
ｓ） ＦＲＩ−３８１を用い、実施例１と同じような方
法で培養し、遠心分離により得た培養上清に精製水を加
え、希釈後、ｐＩＩを５．７にしＣＭ−セファデックス
を加え、エンテロトキシンＣを吸普後、カラムにつめ、
０．０１ｇリン酸緩衝液ＰＩＩ５．７で洗浄後０．０Ｉ
Ｍリン酸緩衝液ｐＨ５，７と０．ＩＭリン酸緩衝液ｐ１
１７．５を用いてグラシュエンド溶出する０次いで、０
．０２５Ｍグリシン緩衝液ｐＨ９，５で平衡化したＤＥ
ＡＥ−セルロースによるクロマトで０．０２５Ｍグリシ
ン緩衝液ｐＨ３，５と０．２ＮＮａＣＩ加え、０．０５
Ｍグリシン緩衝液ｐｎ９．５によるグラシュエンド溶出
し、セファデックスＧ−７５によるゲル濾過後、凍結乾
燥を行うことにより、精製エンテロトキシンＣを得た。
ドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕ
ｓ） ＦＲＩ−３８１を用い、実施例１と同じような方
法で培養し、遠心分離により得た培養上清に精製水を加
え、希釈後、ｐＩＩを５．７にしＣＭ−セファデックス
を加え、エンテロトキシンＣを吸普後、カラムにつめ、
０．０１ｇリン酸緩衝液ＰＩＩ５．７で洗浄後０．０Ｉ
Ｍリン酸緩衝液ｐＨ５，７と０．ＩＭリン酸緩衝液ｐ１
１７．５を用いてグラシュエンド溶出する０次いで、０
．０２５Ｍグリシン緩衝液ｐＨ９，５で平衡化したＤＥ
ＡＥ−セルロースによるクロマトで０．０２５Ｍグリシ
ン緩衝液ｐＨ３，５と０．２ＮＮａＣＩ加え、０．０５
Ｍグリシン緩衝液ｐｎ９．５によるグラシュエンド溶出
し、セファデックスＧ−７５によるゲル濾過後、凍結乾
燥を行うことにより、精製エンテロトキシンＣを得た。
■ 測定材料の調製
ブドウ球菌エンテクトキシンＣに対する抗血清は、実施
例１、実施例２に記載の方法に準じて作製し、又、精製
１ｇ（ｉ画分を得た。又、西洋ワサビペルオキシダーゼ
との結合物も同様に作製した。
例１、実施例２に記載の方法に準じて作製し、又、精製
１ｇ（ｉ画分を得た。又、西洋ワサビペルオキシダーゼ
との結合物も同様に作製した。
■ 測 定 方 法
実施例１に記載の方法でブドウ球菌エンテロトキシンＣ
の測定を行った。エンテロトキシンＡの場合と同様な標
準曲線が得られ、他のエンテロトキシンＡ、Ｂ１Ｄ１Ｅ
との交差もほとんど認めらなかった。
の測定を行った。エンテロトキシンＡの場合と同様な標
準曲線が得られ、他のエンテロトキシンＡ、Ｂ１Ｄ１Ｅ
との交差もほとんど認めらなかった。
実施例 ４
（１） 精製ブドウ球菌エンテロトキシンＤの調製黄
色ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒ
ｅｕｓ）１１５１−７ＮＧを用い、実施例１と同じ方法
で培養し、遠心分離により得た培養上清を１０倍に濃縮
後、ｐｉを５．７に調製し、実施例１と同じ方法でブド
ウ球菌エンテロトキシンＤを精製した。
色ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒ
ｅｕｓ）１１５１−７ＮＧを用い、実施例１と同じ方法
で培養し、遠心分離により得た培養上清を１０倍に濃縮
後、ｐｉを５．７に調製し、実施例１と同じ方法でブド
ウ球菌エンテロトキシンＤを精製した。
■ 測定材料の調製
実施例１に記載の方法で、測定材料を調製した。
即ち、抗血清よりの精製１ｇＧ１西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ結合１ｇＧ等を調製した。
ダーゼ結合１ｇＧ等を調製した。
■ 測 定 方 法
実施例１に記載の方法に準じて、ブドウ球菌エンテロト
キシンＤの測定を行ったところ、実施例１と同様な結果
が得られた、 実施例 ５゜ 品用らの方法〔品用邦汎１国田信治、阪ロ玄二：日細誌
３２．８２９ （１９７〕）〕に従ってブドウ球菌エン
テロトキシンＥの精製を行い、実施例１に記載の方法に
従って抗血清、精製１ｇＧ、西洋ワサビペルオキシダー
ゼ結合１ｇＧを得、実施例１に記載の方法でブドウ球菌
エンテロトキシンＥの測定を行ったところ、実施例１と
同様な結果が得られ、ブドウ球菌エンテロトキシンＡと
一部交差反応のあることが認められたが、その測定値に
しめる割合はわずかで実用上は問題にならなかった。
キシンＤの測定を行ったところ、実施例１と同様な結果
が得られた、 実施例 ５゜ 品用らの方法〔品用邦汎１国田信治、阪ロ玄二：日細誌
３２．８２９ （１９７〕）〕に従ってブドウ球菌エン
テロトキシンＥの精製を行い、実施例１に記載の方法に
従って抗血清、精製１ｇＧ、西洋ワサビペルオキシダー
ゼ結合１ｇＧを得、実施例１に記載の方法でブドウ球菌
エンテロトキシンＥの測定を行ったところ、実施例１と
同様な結果が得られ、ブドウ球菌エンテロトキシンＡと
一部交差反応のあることが認められたが、その測定値に
しめる割合はわずかで実用上は問題にならなかった。
第１図は実施例１における標準曲線を示す。
特許出願人 東洋紡績株式会社
手続補正書（自発）
昭和６０午２月１９日
特許庁長官 志 賀 学 殿
１、 事件の表示
昭和６０年特許願第 号
（昭和６０年２月５日提出）
λ 発明の名称
エンテロトキシンの定量法
ａ 補正をする者
事件との関係 特許出願人
大阪市北区堂島浜二丁目２番８号
４、 補正の対象
明細書の「発明の詳細な説明」の欄
＆ 補正の内容
（１） 明細書の所定箇所を別紙正誤表の通り訂正する
。 （２） 明細書第２３頁第１１行目と第１２行目との間
に、次の実施例６を挿入する。 「実施例６ セレウス苗によるエンテロトキシンの検出（１） セ
レウス菌によるエンテロトキシン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｃｅｒｅｕｓエンテロトキシ／、以下Ｂ、Ｃ。 エンテロトキシンと略す）の精製 九 食中毒由来セレウス菌を１％ブドウ糖加Ｂｒａｉｔ−Ｈ
ｅａｒｔ−１ｎｓｕｓｉｏｎ（旧ｒｃｏ社製）培地で３
２℃、６時間振とう培養し、遠心上清を得、品用らの方
法［大阪府立公衛研所報 ９，１３１ （１９７８）］
に従って精製した。 （２） 抗血清の作製 ｎ、ｃ、エンテロトキシンを６０μｇ／■ｔ、０．０ｍ
ｌとフロインドの完全アジ、バンド０．８ｉ＋ ｔを等
全混合し、ウサギ皮下に免疫した。６〜７週後にｎ、ｃ
、エンテロトキシンを３０μｇｌｕｔ 、１ ａｆｔ
を追加免疫し、最初の注射より１１週０に全採血を行い
、抗血清を作製した。 （３） 測定材料の調製 実施例１に記αの方法で測定材料を調製した。 即ち、抗血清よりの精製１ｇＧ画分、抗体結合ポール、
西洋ワサビペルオキシダーゼ結合１ｇＧ等を調製した。 （４） 測定方法 実施例１に記載の方法に準じて、Ｂ、Ｃ，エンテロトキ
シンの測定を行ったところ、実施例１と同じような結果
が得られた。」 ａ 添付書類 訂正された明細書 第３．４頁 〃 第６．７．８頁 〃 第１３．１４．１５． １８．１７．１８頁 正 誤 表 に食品中に混入したブドウ球菌あるいはセレウス菌の産
生ずる毒素（以下エンテロトキシンと略す）を検出する
方法に関するものである。 特に食品衛生検査上、食中毒を生じせしめたエンテロト
キシン究明を行う際、食品及び患者材料（吐物）中に存
在するエンテロトキシンを正確に定量することにより、
食中毒の診断を行うものである。 （従来の技術） 従来からエンテロトキシンの定量法としては次のような
方法が行なわれている。食中毒を生じさせたと推定され
る食品１０ｇを９０ｍ１の生理食塩水あるいはリン酸緩
衝生理食塩水（以下ＰＢＳと略す）にてホモジナイズ後
、その０．１ｍｌをマンニット−食塩−卵黄寒天培地に
塗抹し、３７℃で２４〜４８時間培養を行い、生じたコ
ロニーを計測して、食品１ｇ中の菌数を求める０食品１
ｇ中の菌数が１０個以上の場合、本国による食中毒と推
定される０次いで、コアグラーゼ産生性を５〜７倍希釈
ウサギプラズマ０．５ｍｌにブレーンハートインフュー
ジョン培地（以下ＢＨＩと略す）培養被検菌０．５１を
加え、３〜２４時間後、プラズマの凝固又は、フィブリ
ンの析出が認められ場合には黄色ブドウ球菌と同定され
る。 さらに黄色ブドウ球菌の産生ずるエンテロトキシンを測
定する場合、被検菌を３％ＮＺ−アミン培地又はＢＨＩ
培地でｔｉ盪培養し、培養液を遠心後、ミクロスライド
ゲル内沈降反応法を用いる。 その方法は中央の穴にエンテロトキシンを動物に免疫し
て得た抗血清を入れ、周囲の穴に培養遠心上清をそれぞ
れ入れ、４８時時間和中で反応さす。抗血清を入れた穴
と培養上清を入れた穴との間に沈降線の形成有無を確認
して判定する。あるいはエンテロトキシンに対する抗血
清をラテックスに結合させたものを用いて培養上清を倍
数希釈し、凝集を示す最高希釈倍数を求める。本方法の
最少検出感度によりエンテロトキシンを検出するラテッ
クス凝集反応が用いられている。 （発明が解決しようとする問題点） ようになった。そこで、従来からエンテロトキシンと呼
ばれていた毒素は国名を付してブドウ球菌エンテロトキ
シンと呼ぶようになった。本発明はこれらの全てのエン
テロトキシンの定量を含有しているものである。 ブドウ球菌食中毒は菌体外毒素により発生する疾患であ
ることが、１９３０年代にＤａｃｋｓ （Ｄａｃｋ 、
Ｇ 、Ｍ、 。 Ｃａｒｙ、 Ｗ、Ｅ、、 Ｗｏｏｌｐｅｒｔ、 ｏ、、
Ｗｌｇｇｌｔｌｇ、Ｈ，Ｊ、 ： Ｊ。 Ｐｒｅｙ、 Ｍｅｄ、、 ４．１８７．（１９３０））
によって証明され、それ以後このエンテロトキシンが単
離精製され、現在このブドウ球菌エンテロトキシンには
Ａ。 Ｂ、Ｃ，Ｄ及びＥの５つのタイプが存在することも明ら
かにされている。これらの５つのタイプは、従来の技術
の項で述べたようなゲル内沈降反応により、特異的沈降
パターンにより区別することが可能であり、５つのタイ
プの中にも、共通抗原が存在することも又明らかである
。これらのエンテロトキシンの分離、精製法は別冊、蛋
白質、核酸、酵素１１．Ｈ（１９７Ｂ）に詳細に記載さ
れているように培養上清を出発原料にしてＣＭ−セファ
ローズカラム、クロマトグラフィー、セファデックスＧ
−１００，セファデックスＧ−７５によるゲル濾過を繰
返し行う操作が多く用いられる。 本発明に用いられる抗エンテロトキシン抗体は次のよう
にして得ることができる。すなわち、上記のようにして
分離、精製したエンテロトキシンに対する抗血清を得る
には、例えばエンテロトキシン６０μｇ／■Ｌ Ｏ，６
ｍｌとフロイントの完全アジュバント０．１１を等量混
合しウサギ皮下に注射し、さらに６〜７週後に追加免疫
し、最初の免疫より１０〜１１週目で全採血する。得ら
れたエンテロトキシンに対する抗血清の力価、特異性は
ゲル内沈降反応により検定する。 このようにして得られたエンテロトキシンに対する抗血
清から、３３％飽和硫安塩析−ＤＥＡＥセファローズカ
ラムクロマトグラフィーにより抗体ＩｇＧ画分を得る。 又別法としてプロティンＡ結合セファローズＣＬ−４Ｂ
に抗血清を通し、ＰＢＳで洗浄後吸着されたＩｇＧをグ
リシン−塩酸緩衝ＨＤＢ２．７を用いて溶出する。溶出
後、直ちに２Ｍトリスアミノメタンで中和後、ＰＢＳに
対し一夜透析することによりＩｇＧを精製することもで
きる。さらに動物より得られる抗血清以外、例えばハイ
ブリドーマによるモノクロナール抗体も利用することが
できる。 このようにして得た抗エンテロトキシンのＩｇＧ画分を
不溶性担体に結合する方法としては物理吸着を利用して
も良（、又通常蛋白質あるいは酵素を不溶化するに用い
られる方法を用いて共有結合させても良い。例えば不溶
性多糖類を用いる場合であれば、不溶性多糖を臭化シア
ン、過ヨーソ酸ナトリウム、エピクロルヒドリン１．１
’−カルボニルジイミダゾール等で活性化して結合反応
を行なわせる。又、固相に適当なスペーサーを導入後、
スペーサーを介して抗エンテロトキシン抗体を結合させ
ても良い。 本発明で使用する抗エンテロトキシン抗体は、ＩｇＧ画
分をそのまま用いても良いが、抗原結合部位のみを分離
したものでも良い。即ち、パパイン、ペプシンなどのプ
ロテアーゼで処理して得らキシン抗体の酵素活性に代え
て未結合の酵素標識抗エンテロトキシン抗体の酵素活性
を測定してもよい。 検体中に存在するエンテロトキシンの量は予め作製した
標識曲線により正確にかつ迅速に測定する。 （発明の効果） 本発明では、微生物の産生じたエンテロトキシンを簡便
で、迅速な操作により正確に測定できる。 （実施例） 次に実施例により本発明を説明する。 （１） ［１ブドウ球菌エンテロトキシンＡの調製品
用らの方法〔日細誌３０．Ｈ３，（１９７５） ）によ
り調製した。即ち黄色ブドウ球菌Ｆ Ｒｌ−７２２を用
い３％ＮＺアミンープロティンヒドロラーゼ（以下ＰＨ
Ｐと略す）培地を用い、１６〜１８時間振盪培養し、遠
心分離により上清と菌体を分離し、この上清と、８Ｎ−
ＨＣＩでｐｌｌを５．７に調製した。４倍量の蒸留水で
希釈したものをＯ，ＯＩＭ！Ｊン酸緩衝液ｐＨ５，７で
平衡化したＣＭ−セファデックスを添加しバッチクロマ
トを行う。毒素吸着樹脂をカラムにつめｌ）［５，７の
０．０！にリン酸緩衝液（ｐＨ５，７）で洗浄後、毒素
溶出はｐｌｌ５ 、フの０．０！Ｍリン酸緩衝液とｐａ
’ｙ 。 ５のＯ，ＩＮリン酸緩衝液によるグラシュエンド溶出を
行った。次いで毒素活性分画を集め０．０２５Ｍグリシ
ン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９，５）で平衡化したＤＥＡ
Ｅ−セファデックスカラムクロマトにかけ、毒素溶出は
０．０２５１１グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９，５
）と０．２ＭＮ ａ Ｃｌを含む０．０５Ｍグリシン−
ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９，５）によるグラシュエンド溶
出を行なう。さらに、セファデックスＧ−７５ゲル濾過
後、精製水に対し透析後、凍結乾燃し、精製ブドウ球菌
エンテロトキシンＡとした。 ■ ブドウ球菌エンテロトキシンＡに対する抗血清 ブドウ球菌エンテロトキシンＡにする抗血清は精製ブド
ウ球菌エンテロトキシンＡを初回１０μｇ （０，５ｍ
１）とフロイントの完全アジュバント（０，５ｍ１）を
混ぜ、１１のウサギの背部皮下に接種した。７〜９３！
ｌ目にブースターとして同量（１０Ｍｇ）のブドウ球菌
エンテロトキシンＡをアジュバントを加えないで皮下に
注射した。力価が最高になった１１〜１３週に採血した
。 ■ 抗ブドウ球菌エンテロトキシンＡ抗血清よりのＩｇ
Ｇ画分の調製 得られたブドウ球菌エンテロトキシンＡに対するウサギ
抗血清をプロティンＡ結合セファローズＣＬ−４Ｂ （
ファルマシア製）カラムに通し、波長２８０ｎ■におけ
る吸光度がｏ、ｏｓｏ以下になるまで０．０１Ｍ Ｐ
Ｂ Ｓで洗浄した。次いでプロティンＡ結合セファロー
ズＣＬ−４Ｂに結合しているＩｇＧ画分を０．１翼グリ
シン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２，７）で溶出した。溶出後
、すぐに２１）リスアミノメタンを用いて中和し、０．
０１ＭＰ Ｂ Ｓ ＣｐＨ７，２）に対し透析する。透
析後精製抗ブドウ球エンテロトキシンＡウサギＩｇＧと
して使用に供した。 （２） Ｆ（ａｂ’）ｍ フラグメントの調製抗ブドウ
球菌エンテロトキシンＡウサギＩｇＧにペプシン（ブタ
腸粘膜由来、シグマ社製）ＩＯＷ／Ｖ％を加え、３７℃
、１６時間処理し、セファデックスＧ−２００ゲル瀘過
によりＦ（ａｂ’ ）ｍ フラグメントを得た。 ■ 抗ブドウ球菌エンテロトキシンＡウサギＩｇＧをペ
ルオキシダーゼの結合体の調製過ヨウ素酸塩酸化法（Ｎ
ａｋａｎｅ、 Ｐ、に、＋ ＆ Ｋａｖａｏｉ。 Ａ、； Ｊ、旧ｓｔｏｃｈｅｍ、 Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、
２２．１０８４−１０９Ｌ（１９７４）］により、抗
ブドウ球菌エンテロトキシンＡウサギＩｇＧと西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ（東洋紡製、グレードＩ−Ｇ）を結
合し、セファデックスＧ−２００ゲル濾過により、ペル
オキシダーゼ標識抗ブドウ球菌エンテロトキシンＡウサ
ギＩｇＧを得た。 ■ 抗体結合固相の調製 抗ブドウ球菌エンテロトキシンＡウサギＩｇＧを経ｌへ
インチポリスチレンボールに物理的に反応により吸着さ
せた。即ち、抗ブドウ球菌エンテロトキシンＡウサギＩ
ｇＧを０．１Ｍ炭酸緩衝液ＰＨ８，５に２０〜３０μｇ
／ｍｌに調製した液にポリスチレンボールを浸漬し、室
温４時間、４℃、液装置した。 ０．０１Ｍ Ｐ Ｂ Ｓ （ｐＨ７，２）啓洗浄後、１
％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ Ｐ Ｂ Ｓ
（ｐＨ７，２）に使用まで保存した。抗体結合固相は
、少なくとも６力月は安定であった。 ■ 測 定 操 作 標準ブドウ球菌エンテロトキシンＡは、精製ブドウ球菌
エンテロトキシンＡを、所定濃度になるように０．０１
１ Ｐ Ｂ Ｓに溶解調製したものを用いた。 標準ブドウ球菌エンテロトキシンＡ液、Ｏ，１＊ｌある
いは、食中毒を生じさせた食品１０ｇを生理食塩水９０
＋ｓｌで抽出した上清（０，１＊ｌ）を、内径１０１■
、高さ３０龍の試験管が２０個結合したイムノボールト
レー（小野薬品工業社製）の中に入れ、正常家兎血清４
Ｖ／Ｖ９４を含む、Ｏ，ａｌＮ Ｐ Ｂ Ｓ ｐＨ７
，２，０，２１を添加混合後、抗体結合ボールを１個入
れ、３７℃で、１時間、静置し反応させた。１時間後、
アスピレータ−を用いて、トレイ中の溶液を吸引除去し
、 ０．０１１ ＰＢＳ （ｐＨ７，２）を用いて３
回洗浄後、０．２５Ｗ／Ｖ％ＢＳＡを含む０．０１Ｍ
Ｐ Ｂ Ｓ（ｐＨ７，２）で至適活性濃度に調整した。 酵素標識抗体０．２５ｍ１加え、３７℃、２時間反応さ
せた。反応後、ｏ、０１Ｍ Ｐ Ｂ Ｓ （ｐＨ７，２
）を用（Ｓで３回洗浄後、新たな試験管ボックス（イム
ノボール・スピッツボックス）にボールのみ移し、０．
０２％Ｈｚ Ｏ＊ 、Ｏ−フェニレンジアミン・２ＨＣ
１（牛丼化学社製）３■／■ｌ含む、０．２Ｍクエン酸
、Ｇ、１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ５、フ、０．５１を加え、
暗所、室温で１時間反応させた。１時間後、ＩＮ−硫酸
２１を加え酵素反応を停止後、波長４９２ｎ■での吸光
度を測定した。得られたブドウ球菌エンテロトキシンＡ
の標準曲線を第１図に示す。食品中のブドウ球菌エンテ
ロトキシンＡは、この標準曲線より求められた。又、ブ
ドウ球菌エンテロトキシンの他の型、即ちＢ、Ｃ％Ｄ％
Ｅに対する交差反応は、Ｅ ２０ ｎｇ／ｍｌに対し２
％程度の交差反応を示した。しかし他の８１Ｃ１Ｄに対
してはエンテロトキシン１．０００ｗ／ｍｌ程度でも反
応は示さなかった。 実施例 ２ 手続補正書（自発） 昭和６０年１１月 ８日 １、事件の表示 昭和６０年特許願第２０５７０号 ２ 発明の名称 エンテロトキシンの定量法 ３、 補正をする者 事件との関係 特許出願人 大阪市北区堂島浜二丁目２番８号 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ＆ 補正の内容 「実施例」を「実施例１」に訂正する。 ■ 同第２０頁第２行目 「糖製抗体」を「精製抗体」に訂正する。 ■ 同第７頁 （昭和８０年２月１９日提出の手続補正書別紙第７頁の
第９行目） ｒｏ、１ｍｆｆ１Ｊをｒｏ、８ｍｆｆ１Ｊに訂正する。 （２）同第１３頁 （昭和６０年２月１９日提出の手続補正書別紙第１３頁
の第１８行目） 「上清と」を「上演を」に訂正する。 ■ 同第１４頁 （昭和６０年２月１９日提出の手続補正書別紙第１４頁
の第２行目） ｒ （ｐＨ５，７） Ｊを削除する。 ■ 同第１６頁 （昭和６０年２月１９日提出の手続補正書別紙第１６頁
の第１５行目） 「物理的に」を「物理的な」に訂正する。 ■ 同第１６頁 （昭和６０年２月１９日提出の手続補正書別紙第１６頁
の第１８行目 「液装置した。」を「−夜装置した。」に訂正する。 ■ 同第１６頁 （昭和８０年２月１９日提出の手続補正書別紙第１６頁
の末行） 「啓」を「で」に訂正する。 （ｇｌ 同第１７頁 （昭和６０年２月１９日提出の手続補正書別紙第１７頁
第１行目） ｒｏ、１％」の次に「アジ化ナトリウム（ＮａＨ，）を
含む０．０１ＭＪを挿入する。 以 上
。 （２） 明細書第２３頁第１１行目と第１２行目との間
に、次の実施例６を挿入する。 「実施例６ セレウス苗によるエンテロトキシンの検出（１） セ
レウス菌によるエンテロトキシン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｃｅｒｅｕｓエンテロトキシ／、以下Ｂ、Ｃ。 エンテロトキシンと略す）の精製 九 食中毒由来セレウス菌を１％ブドウ糖加Ｂｒａｉｔ−Ｈ
ｅａｒｔ−１ｎｓｕｓｉｏｎ（旧ｒｃｏ社製）培地で３
２℃、６時間振とう培養し、遠心上清を得、品用らの方
法［大阪府立公衛研所報 ９，１３１ （１９７８）］
に従って精製した。 （２） 抗血清の作製 ｎ、ｃ、エンテロトキシンを６０μｇ／■ｔ、０．０ｍ
ｌとフロインドの完全アジ、バンド０．８ｉ＋ ｔを等
全混合し、ウサギ皮下に免疫した。６〜７週後にｎ、ｃ
、エンテロトキシンを３０μｇｌｕｔ 、１ ａｆｔ
を追加免疫し、最初の注射より１１週０に全採血を行い
、抗血清を作製した。 （３） 測定材料の調製 実施例１に記αの方法で測定材料を調製した。 即ち、抗血清よりの精製１ｇＧ画分、抗体結合ポール、
西洋ワサビペルオキシダーゼ結合１ｇＧ等を調製した。 （４） 測定方法 実施例１に記載の方法に準じて、Ｂ、Ｃ，エンテロトキ
シンの測定を行ったところ、実施例１と同じような結果
が得られた。」 ａ 添付書類 訂正された明細書 第３．４頁 〃 第６．７．８頁 〃 第１３．１４．１５． １８．１７．１８頁 正 誤 表 に食品中に混入したブドウ球菌あるいはセレウス菌の産
生ずる毒素（以下エンテロトキシンと略す）を検出する
方法に関するものである。 特に食品衛生検査上、食中毒を生じせしめたエンテロト
キシン究明を行う際、食品及び患者材料（吐物）中に存
在するエンテロトキシンを正確に定量することにより、
食中毒の診断を行うものである。 （従来の技術） 従来からエンテロトキシンの定量法としては次のような
方法が行なわれている。食中毒を生じさせたと推定され
る食品１０ｇを９０ｍ１の生理食塩水あるいはリン酸緩
衝生理食塩水（以下ＰＢＳと略す）にてホモジナイズ後
、その０．１ｍｌをマンニット−食塩−卵黄寒天培地に
塗抹し、３７℃で２４〜４８時間培養を行い、生じたコ
ロニーを計測して、食品１ｇ中の菌数を求める０食品１
ｇ中の菌数が１０個以上の場合、本国による食中毒と推
定される０次いで、コアグラーゼ産生性を５〜７倍希釈
ウサギプラズマ０．５ｍｌにブレーンハートインフュー
ジョン培地（以下ＢＨＩと略す）培養被検菌０．５１を
加え、３〜２４時間後、プラズマの凝固又は、フィブリ
ンの析出が認められ場合には黄色ブドウ球菌と同定され
る。 さらに黄色ブドウ球菌の産生ずるエンテロトキシンを測
定する場合、被検菌を３％ＮＺ−アミン培地又はＢＨＩ
培地でｔｉ盪培養し、培養液を遠心後、ミクロスライド
ゲル内沈降反応法を用いる。 その方法は中央の穴にエンテロトキシンを動物に免疫し
て得た抗血清を入れ、周囲の穴に培養遠心上清をそれぞ
れ入れ、４８時時間和中で反応さす。抗血清を入れた穴
と培養上清を入れた穴との間に沈降線の形成有無を確認
して判定する。あるいはエンテロトキシンに対する抗血
清をラテックスに結合させたものを用いて培養上清を倍
数希釈し、凝集を示す最高希釈倍数を求める。本方法の
最少検出感度によりエンテロトキシンを検出するラテッ
クス凝集反応が用いられている。 （発明が解決しようとする問題点） ようになった。そこで、従来からエンテロトキシンと呼
ばれていた毒素は国名を付してブドウ球菌エンテロトキ
シンと呼ぶようになった。本発明はこれらの全てのエン
テロトキシンの定量を含有しているものである。 ブドウ球菌食中毒は菌体外毒素により発生する疾患であ
ることが、１９３０年代にＤａｃｋｓ （Ｄａｃｋ 、
Ｇ 、Ｍ、 。 Ｃａｒｙ、 Ｗ、Ｅ、、 Ｗｏｏｌｐｅｒｔ、 ｏ、、
Ｗｌｇｇｌｔｌｇ、Ｈ，Ｊ、 ： Ｊ。 Ｐｒｅｙ、 Ｍｅｄ、、 ４．１８７．（１９３０））
によって証明され、それ以後このエンテロトキシンが単
離精製され、現在このブドウ球菌エンテロトキシンには
Ａ。 Ｂ、Ｃ，Ｄ及びＥの５つのタイプが存在することも明ら
かにされている。これらの５つのタイプは、従来の技術
の項で述べたようなゲル内沈降反応により、特異的沈降
パターンにより区別することが可能であり、５つのタイ
プの中にも、共通抗原が存在することも又明らかである
。これらのエンテロトキシンの分離、精製法は別冊、蛋
白質、核酸、酵素１１．Ｈ（１９７Ｂ）に詳細に記載さ
れているように培養上清を出発原料にしてＣＭ−セファ
ローズカラム、クロマトグラフィー、セファデックスＧ
−１００，セファデックスＧ−７５によるゲル濾過を繰
返し行う操作が多く用いられる。 本発明に用いられる抗エンテロトキシン抗体は次のよう
にして得ることができる。すなわち、上記のようにして
分離、精製したエンテロトキシンに対する抗血清を得る
には、例えばエンテロトキシン６０μｇ／■Ｌ Ｏ，６
ｍｌとフロイントの完全アジュバント０．１１を等量混
合しウサギ皮下に注射し、さらに６〜７週後に追加免疫
し、最初の免疫より１０〜１１週目で全採血する。得ら
れたエンテロトキシンに対する抗血清の力価、特異性は
ゲル内沈降反応により検定する。 このようにして得られたエンテロトキシンに対する抗血
清から、３３％飽和硫安塩析−ＤＥＡＥセファローズカ
ラムクロマトグラフィーにより抗体ＩｇＧ画分を得る。 又別法としてプロティンＡ結合セファローズＣＬ−４Ｂ
に抗血清を通し、ＰＢＳで洗浄後吸着されたＩｇＧをグ
リシン−塩酸緩衝ＨＤＢ２．７を用いて溶出する。溶出
後、直ちに２Ｍトリスアミノメタンで中和後、ＰＢＳに
対し一夜透析することによりＩｇＧを精製することもで
きる。さらに動物より得られる抗血清以外、例えばハイ
ブリドーマによるモノクロナール抗体も利用することが
できる。 このようにして得た抗エンテロトキシンのＩｇＧ画分を
不溶性担体に結合する方法としては物理吸着を利用して
も良（、又通常蛋白質あるいは酵素を不溶化するに用い
られる方法を用いて共有結合させても良い。例えば不溶
性多糖類を用いる場合であれば、不溶性多糖を臭化シア
ン、過ヨーソ酸ナトリウム、エピクロルヒドリン１．１
’−カルボニルジイミダゾール等で活性化して結合反応
を行なわせる。又、固相に適当なスペーサーを導入後、
スペーサーを介して抗エンテロトキシン抗体を結合させ
ても良い。 本発明で使用する抗エンテロトキシン抗体は、ＩｇＧ画
分をそのまま用いても良いが、抗原結合部位のみを分離
したものでも良い。即ち、パパイン、ペプシンなどのプ
ロテアーゼで処理して得らキシン抗体の酵素活性に代え
て未結合の酵素標識抗エンテロトキシン抗体の酵素活性
を測定してもよい。 検体中に存在するエンテロトキシンの量は予め作製した
標識曲線により正確にかつ迅速に測定する。 （発明の効果） 本発明では、微生物の産生じたエンテロトキシンを簡便
で、迅速な操作により正確に測定できる。 （実施例） 次に実施例により本発明を説明する。 （１） ［１ブドウ球菌エンテロトキシンＡの調製品
用らの方法〔日細誌３０．Ｈ３，（１９７５） ）によ
り調製した。即ち黄色ブドウ球菌Ｆ Ｒｌ−７２２を用
い３％ＮＺアミンープロティンヒドロラーゼ（以下ＰＨ
Ｐと略す）培地を用い、１６〜１８時間振盪培養し、遠
心分離により上清と菌体を分離し、この上清と、８Ｎ−
ＨＣＩでｐｌｌを５．７に調製した。４倍量の蒸留水で
希釈したものをＯ，ＯＩＭ！Ｊン酸緩衝液ｐＨ５，７で
平衡化したＣＭ−セファデックスを添加しバッチクロマ
トを行う。毒素吸着樹脂をカラムにつめｌ）［５，７の
０．０！にリン酸緩衝液（ｐＨ５，７）で洗浄後、毒素
溶出はｐｌｌ５ 、フの０．０！Ｍリン酸緩衝液とｐａ
’ｙ 。 ５のＯ，ＩＮリン酸緩衝液によるグラシュエンド溶出を
行った。次いで毒素活性分画を集め０．０２５Ｍグリシ
ン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９，５）で平衡化したＤＥＡ
Ｅ−セファデックスカラムクロマトにかけ、毒素溶出は
０．０２５１１グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９，５
）と０．２ＭＮ ａ Ｃｌを含む０．０５Ｍグリシン−
ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９，５）によるグラシュエンド溶
出を行なう。さらに、セファデックスＧ−７５ゲル濾過
後、精製水に対し透析後、凍結乾燃し、精製ブドウ球菌
エンテロトキシンＡとした。 ■ ブドウ球菌エンテロトキシンＡに対する抗血清 ブドウ球菌エンテロトキシンＡにする抗血清は精製ブド
ウ球菌エンテロトキシンＡを初回１０μｇ （０，５ｍ
１）とフロイントの完全アジュバント（０，５ｍ１）を
混ぜ、１１のウサギの背部皮下に接種した。７〜９３！
ｌ目にブースターとして同量（１０Ｍｇ）のブドウ球菌
エンテロトキシンＡをアジュバントを加えないで皮下に
注射した。力価が最高になった１１〜１３週に採血した
。 ■ 抗ブドウ球菌エンテロトキシンＡ抗血清よりのＩｇ
Ｇ画分の調製 得られたブドウ球菌エンテロトキシンＡに対するウサギ
抗血清をプロティンＡ結合セファローズＣＬ−４Ｂ （
ファルマシア製）カラムに通し、波長２８０ｎ■におけ
る吸光度がｏ、ｏｓｏ以下になるまで０．０１Ｍ Ｐ
Ｂ Ｓで洗浄した。次いでプロティンＡ結合セファロー
ズＣＬ−４Ｂに結合しているＩｇＧ画分を０．１翼グリ
シン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２，７）で溶出した。溶出後
、すぐに２１）リスアミノメタンを用いて中和し、０．
０１ＭＰ Ｂ Ｓ ＣｐＨ７，２）に対し透析する。透
析後精製抗ブドウ球エンテロトキシンＡウサギＩｇＧと
して使用に供した。 （２） Ｆ（ａｂ’）ｍ フラグメントの調製抗ブドウ
球菌エンテロトキシンＡウサギＩｇＧにペプシン（ブタ
腸粘膜由来、シグマ社製）ＩＯＷ／Ｖ％を加え、３７℃
、１６時間処理し、セファデックスＧ−２００ゲル瀘過
によりＦ（ａｂ’ ）ｍ フラグメントを得た。 ■ 抗ブドウ球菌エンテロトキシンＡウサギＩｇＧをペ
ルオキシダーゼの結合体の調製過ヨウ素酸塩酸化法（Ｎ
ａｋａｎｅ、 Ｐ、に、＋ ＆ Ｋａｖａｏｉ。 Ａ、； Ｊ、旧ｓｔｏｃｈｅｍ、 Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、
２２．１０８４−１０９Ｌ（１９７４）］により、抗
ブドウ球菌エンテロトキシンＡウサギＩｇＧと西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ（東洋紡製、グレードＩ−Ｇ）を結
合し、セファデックスＧ−２００ゲル濾過により、ペル
オキシダーゼ標識抗ブドウ球菌エンテロトキシンＡウサ
ギＩｇＧを得た。 ■ 抗体結合固相の調製 抗ブドウ球菌エンテロトキシンＡウサギＩｇＧを経ｌへ
インチポリスチレンボールに物理的に反応により吸着さ
せた。即ち、抗ブドウ球菌エンテロトキシンＡウサギＩ
ｇＧを０．１Ｍ炭酸緩衝液ＰＨ８，５に２０〜３０μｇ
／ｍｌに調製した液にポリスチレンボールを浸漬し、室
温４時間、４℃、液装置した。 ０．０１Ｍ Ｐ Ｂ Ｓ （ｐＨ７，２）啓洗浄後、１
％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ Ｐ Ｂ Ｓ
（ｐＨ７，２）に使用まで保存した。抗体結合固相は
、少なくとも６力月は安定であった。 ■ 測 定 操 作 標準ブドウ球菌エンテロトキシンＡは、精製ブドウ球菌
エンテロトキシンＡを、所定濃度になるように０．０１
１ Ｐ Ｂ Ｓに溶解調製したものを用いた。 標準ブドウ球菌エンテロトキシンＡ液、Ｏ，１＊ｌある
いは、食中毒を生じさせた食品１０ｇを生理食塩水９０
＋ｓｌで抽出した上清（０，１＊ｌ）を、内径１０１■
、高さ３０龍の試験管が２０個結合したイムノボールト
レー（小野薬品工業社製）の中に入れ、正常家兎血清４
Ｖ／Ｖ９４を含む、Ｏ，ａｌＮ Ｐ Ｂ Ｓ ｐＨ７
，２，０，２１を添加混合後、抗体結合ボールを１個入
れ、３７℃で、１時間、静置し反応させた。１時間後、
アスピレータ−を用いて、トレイ中の溶液を吸引除去し
、 ０．０１１ ＰＢＳ （ｐＨ７，２）を用いて３
回洗浄後、０．２５Ｗ／Ｖ％ＢＳＡを含む０．０１Ｍ
Ｐ Ｂ Ｓ（ｐＨ７，２）で至適活性濃度に調整した。 酵素標識抗体０．２５ｍ１加え、３７℃、２時間反応さ
せた。反応後、ｏ、０１Ｍ Ｐ Ｂ Ｓ （ｐＨ７，２
）を用（Ｓで３回洗浄後、新たな試験管ボックス（イム
ノボール・スピッツボックス）にボールのみ移し、０．
０２％Ｈｚ Ｏ＊ 、Ｏ−フェニレンジアミン・２ＨＣ
１（牛丼化学社製）３■／■ｌ含む、０．２Ｍクエン酸
、Ｇ、１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ５、フ、０．５１を加え、
暗所、室温で１時間反応させた。１時間後、ＩＮ−硫酸
２１を加え酵素反応を停止後、波長４９２ｎ■での吸光
度を測定した。得られたブドウ球菌エンテロトキシンＡ
の標準曲線を第１図に示す。食品中のブドウ球菌エンテ
ロトキシンＡは、この標準曲線より求められた。又、ブ
ドウ球菌エンテロトキシンの他の型、即ちＢ、Ｃ％Ｄ％
Ｅに対する交差反応は、Ｅ ２０ ｎｇ／ｍｌに対し２
％程度の交差反応を示した。しかし他の８１Ｃ１Ｄに対
してはエンテロトキシン１．０００ｗ／ｍｌ程度でも反
応は示さなかった。 実施例 ２ 手続補正書（自発） 昭和６０年１１月 ８日 １、事件の表示 昭和６０年特許願第２０５７０号 ２ 発明の名称 エンテロトキシンの定量法 ３、 補正をする者 事件との関係 特許出願人 大阪市北区堂島浜二丁目２番８号 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ＆ 補正の内容 「実施例」を「実施例１」に訂正する。 ■ 同第２０頁第２行目 「糖製抗体」を「精製抗体」に訂正する。 ■ 同第７頁 （昭和８０年２月１９日提出の手続補正書別紙第７頁の
第９行目） ｒｏ、１ｍｆｆ１Ｊをｒｏ、８ｍｆｆ１Ｊに訂正する。 （２）同第１３頁 （昭和６０年２月１９日提出の手続補正書別紙第１３頁
の第１８行目） 「上清と」を「上演を」に訂正する。 ■ 同第１４頁 （昭和６０年２月１９日提出の手続補正書別紙第１４頁
の第２行目） ｒ （ｐＨ５，７） Ｊを削除する。 ■ 同第１６頁 （昭和６０年２月１９日提出の手続補正書別紙第１６頁
の第１５行目） 「物理的に」を「物理的な」に訂正する。 ■ 同第１６頁 （昭和６０年２月１９日提出の手続補正書別紙第１６頁
の第１８行目 「液装置した。」を「−夜装置した。」に訂正する。 ■ 同第１６頁 （昭和８０年２月１９日提出の手続補正書別紙第１６頁
の末行） 「啓」を「で」に訂正する。 （ｇｌ 同第１７頁 （昭和６０年２月１９日提出の手続補正書別紙第１７頁
第１行目） ｒｏ、１％」の次に「アジ化ナトリウム（ＮａＨ，）を
含む０．０１ＭＪを挿入する。 以 上
Claims (4)
- （１）エンテロトキシン含有液を抗エンテロトキシン抗
体不溶化担体および酵素標識抗エンテロトキシン抗体と
反応させ、結合した酵素標識抗エンテロトキシン抗体ま
たは未結合の酵素標識抗エンテロトキシン抗体の酵素活
性を測定することにより、エンテロトキシンを定量する
ことを特徴とするエンテロトキシンの定量法。 - （２）エンテロトキシン含有液を抗エンテロトキシン抗
体不溶化担体と反応させ、エンテロトキシン−抗エンテ
ロトキシン抗体不溶化担体複合体を形成し、次いで該複
合体と酵素標識抗エンテロトキシン抗体と反応させ、該
複合体と結合した酵素標識抗エンテロトキシン抗体の酵
素活性を測定することにより、エンテロトキシンを定量
することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のエン
テロトキシンの定量法。 - （３）エンテロトキシン含有液を酵素標識抗エンテロト
キシン抗体と反応させ、エンテロトキシン−酵素標識抗
エンテロトキシン抗体複合体を形成し、次いで該複合体
と抗エンテロトキシン抗体不溶化担体を反応させ、該担
体に結合した酵素標識抗エンテロトキシン抗体の酵素活
性を測定することにより、エンテロトキシンを定量する
ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のエンテロ
トキシンの定量法。 - （４）エンテロトキシン含有液と酵素標識抗エンテロト
キシン抗体複合体と抗エンテロトキシン抗体不溶化担体
とを同時に反応させ、該担体に結合した酵素標識抗エン
テロトキシン抗体の酵素活性を測定することにより、エ
ンテロトキシンを定量することを特徴とする特許請求の
範囲第１項記載のエンテロトキシンの定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2057085A JPS61178661A (ja) | 1985-02-05 | 1985-02-05 | エンテロトキシンの定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2057085A JPS61178661A (ja) | 1985-02-05 | 1985-02-05 | エンテロトキシンの定量法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61178661A true JPS61178661A (ja) | 1986-08-11 |
Family
ID=12030847
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2057085A Pending JPS61178661A (ja) | 1985-02-05 | 1985-02-05 | エンテロトキシンの定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61178661A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6391563A (ja) * | 1986-10-07 | 1988-04-22 | Nitsusui Seiyaku Kk | 細菌由来蛋白特異抗原の検査法 |
| JPH0688824A (ja) * | 1992-09-07 | 1994-03-29 | Toray Ind Inc | 黄色ブドウ球菌感染の検査方法 |
| WO1998029444A1 (en) * | 1996-12-30 | 1998-07-09 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Broad spectrum pyrogenic exotoxins antagonists and vaccines |
| CN102768275A (zh) * | 2012-07-10 | 2012-11-07 | 北京陆桥技术有限责任公司 | 金黄色葡萄球菌肠毒素检测试剂盒及其制备方法和应用 |
-
1985
- 1985-02-05 JP JP2057085A patent/JPS61178661A/ja active Pending
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| .CAN.J.MICROBIOL=1978 * |
| APPL.ENVIRON.MICROBIOL=1977 * |
| J.ASSOC.OFF.ANAL.CHEM=1980 * |
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| US7189398B2 (en) | 1996-12-30 | 2007-03-13 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Broad spectrum pyrogenic exotoxins antagonists and vaccines |
| CN102768275A (zh) * | 2012-07-10 | 2012-11-07 | 北京陆桥技术有限责任公司 | 金黄色葡萄球菌肠毒素检测试剂盒及其制备方法和应用 |
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