JPS6117521A - 新規な生物学的に活性な物質、その製造及びそれを含有する組成物 - Google Patents
新規な生物学的に活性な物質、その製造及びそれを含有する組成物Info
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- JPS6117521A JPS6117521A JP60130074A JP13007485A JPS6117521A JP S6117521 A JPS6117521 A JP S6117521A JP 60130074 A JP60130074 A JP 60130074A JP 13007485 A JP13007485 A JP 13007485A JP S6117521 A JPS6117521 A JP S6117521A
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- Japan
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- immunostimulatory
- immunostimulatory substance
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- elution
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/75—Fibrinogen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/01—Hydrolysed proteins; Derivatives thereof
- A61K38/012—Hydrolysed proteins; Derivatives thereof from animals
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はウシフィブリ／−ダン（ｂｏｖｉｎｅ ｆｉｂ
ｒｉｎｏｇｅｎ）の酵素による加水分解物（ｅｎｚｙｍ
ａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓ）の分別により得
られた生物学的に活性な物質、それらの製造、及びそれ
らを含有する組成物に関する。
ｒｉｎｏｇｅｎ）の酵素による加水分解物（ｅｎｚｙｍ
ａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓ）の分別により得
られた生物学的に活性な物質、それらの製造、及びそれ
らを含有する組成物に関する。
本発明は、ウシフィブリノーゲンから、そのジスルフィ
ド結合を還元し、続いて、このようにして遊離されたメ
ルカプト基をアルキル化し、得られた生成物を酵素によ
り部分的に加水分解し、水溶性の加水分解生成物をそれ
らの分子量に従って分別し、そして免疫刺激特性（ｉａ
＋ｍｕｎｏｓｔｉｗｕｌａｎｔｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）
を有する７ラクシタン（１つ又は複数）を分離すること
により得られる新規な免疫刺激性物質（ｉｍｎ＋ｕｎｏ
ｓｔｉｍｕｌａｎｔ ５ｕｂｓｔａｎｃｅＳ）を提供す
る。
ド結合を還元し、続いて、このようにして遊離されたメ
ルカプト基をアルキル化し、得られた生成物を酵素によ
り部分的に加水分解し、水溶性の加水分解生成物をそれ
らの分子量に従って分別し、そして免疫刺激特性（ｉａ
＋ｍｕｎｏｓｔｉｗｕｌａｎｔｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）
を有する７ラクシタン（１つ又は複数）を分離すること
により得られる新規な免疫刺激性物質（ｉｍｎ＋ｕｎｏ
ｓｔｉｍｕｌａｎｔ ５ｕｂｓｔａｎｃｅＳ）を提供す
る。
これらの新規物質は、特に抗体生産を促進する免疫学的
試薬である。５００乃至７，５００の平均分子量を有す
る物質が特に有用な性質を有している。
試薬である。５００乃至７，５００の平均分子量を有す
る物質が特に有用な性質を有している。
この新規な免疫刺激性物質の製造においては、ウシフィ
ブリノーゲンを、好ましくはメルカプトエタノールを使
用して、先ず還元してジスルフィド結合を分解し、そし
て生成物のメルカプト基を、好ましくはヨードアセタミ
ドを使用して、アルキル化により酸化に対して保護する
６ 酵素による加水分解は、好ましくは、トリプシン、キモ
トリプシン又は他の同様な酵素、またはそれらの混合物
により行なわれる。
ブリノーゲンを、好ましくはメルカプトエタノールを使
用して、先ず還元してジスルフィド結合を分解し、そし
て生成物のメルカプト基を、好ましくはヨードアセタミ
ドを使用して、アルキル化により酸化に対して保護する
６ 酵素による加水分解は、好ましくは、トリプシン、キモ
トリプシン又は他の同様な酵素、またはそれらの混合物
により行なわれる。
次いで、水溶性加水゛分解生成物は、該加水分解物を変
性しない任意の方法を使用して、それらの分子量に従っ
て分別される。例えば、メルカプトエタノール及びヨー
ドアセタミドで処理されそして予備処理されていないト
リプシンで消化されたウシフィブリノーゲンを起源とす
る水溶性フラクションの分子量に従う分別は、以後ＩＶ
（ＭＪＨ１０４）、■（ＭＪＨ１０５）及びＶＩ（ＭＪ
Ｈ１０６）と呼ばれる３つのフラクシヨンを生じ、これ
らは興味ある生物学的活性を有する。
性しない任意の方法を使用して、それらの分子量に従っ
て分別される。例えば、メルカプトエタノール及びヨー
ドアセタミドで処理されそして予備処理されていないト
リプシンで消化されたウシフィブリノーゲンを起源とす
る水溶性フラクションの分子量に従う分別は、以後ＩＶ
（ＭＪＨ１０４）、■（ＭＪＨ１０５）及びＶＩ（ＭＪ
Ｈ１０６）と呼ばれる３つのフラクシヨンを生じ、これ
らは興味ある生物学的活性を有する。
イオン交換カラムによる精製の後、７ラクシヨン“■”
（ＭＪＨ１０５）は３つの活性な７ラクシａン［以後ピ
ーク５（ＭＪＨ１７６，１９７，２００）： ピーク１
０（ＭＪＨ１７９）；ピーク１１（ＭＪＨ１８０）と呼
ぶ］を生じる。
（ＭＪＨ１０５）は３つの活性な７ラクシａン［以後ピ
ーク５（ＭＪＨ１７６，１９７，２００）： ピーク１
０（ＭＪＨ１７９）；ピーク１１（ＭＪＨ１８０）と呼
ぶ］を生じる。
次いで、“ピーク５″７ラクシタンの高性能液体りｏｖ
トゲラフ ＜ −（ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ
ｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）は、以
後４（ＭＪＨ２２８）及び５（ＭＪＨ２２９）と名付け
る、活性生成物を含有する２つのゾーンを与える。これ
らの内の１つ（ゾーン５）は、以後“ＭＪＨ３３５”及
びＭＪ８ ３３６″と呼ばれる物質を生じ、これらの物
質の免疫学的特性はフラクションａＶ”それ自体の免疫
学的特性に比べて改良されている。
トゲラフ ＜ −（ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ
ｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）は、以
後４（ＭＪＨ２２８）及び５（ＭＪＨ２２９）と名付け
る、活性生成物を含有する２つのゾーンを与える。これ
らの内の１つ（ゾーン５）は、以後“ＭＪＨ３３５”及
びＭＪ８ ３３６″と呼ばれる物質を生じ、これらの物
質の免疫学的特性はフラクションａＶ”それ自体の免疫
学的特性に比べて改良されている。
添付図面は、下記実施例に記載の方法を使用して、溶出
液（ｅｌｕａｎｔ）の容量（もしくは７ラクシ層ンの数
）又は保持時間（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）と溶
出液の光学密度の変動を示すグラフとして、本発明の免
疫刺激性物質の分別を例示している。
液（ｅｌｕａｎｔ）の容量（もしくは７ラクシ層ンの数
）又は保持時間（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）と溶
出液の光学密度の変動を示すグラフとして、本発明の免
疫刺激性物質の分別を例示している。
本発明の新規な物質は、抗体生産を促進しそして食作用
（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）の現象を促進する免疫刺
激剤である。
（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）の現象を促進する免疫刺
激剤である。
試験管内において、それらは、生体内で免疫化されたマ
ウスの膵臓細胞による抗ヒツジ赤血球（溶血性の）抗体
分泌［ａｎｔｉ−ｓｈｅｅｐ ｒｅｄ ｃｅｌｌ （ｈ
ａｅｌＩｉｏ−１ｙｔｉｃ） ａｎｔｉｂｏｄｙ ５ｅ
ｃｒｅｔｉｏｎｌの試験において及びマウスＩＩ膜マク
ロ７アージ（ｍｏｕｓｅ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｍａｃ
ｒｏｐｈａｇｅｓ）によるオプソニンで処理されたヒツ
ジ赤血球（ｏｐｓｏｎｉｚｅｄ ５ｈｅｅｐ ｒｅｄ
ｃｅｌｌｓ）の食作用の試験において０．１乃至１０μ
ｇ／ｍｌの濃度で特異的に活性であることが証明された
。
ウスの膵臓細胞による抗ヒツジ赤血球（溶血性の）抗体
分泌［ａｎｔｉ−ｓｈｅｅｐ ｒｅｄ ｃｅｌｌ （ｈ
ａｅｌＩｉｏ−１ｙｔｉｃ） ａｎｔｉｂｏｄｙ ５ｅ
ｃｒｅｔｉｏｎｌの試験において及びマウスＩＩ膜マク
ロ７アージ（ｍｏｕｓｅ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｍａｃ
ｒｏｐｈａｇｅｓ）によるオプソニンで処理されたヒツ
ジ赤血球（ｏｐｓｏｎｉｚｅｄ ５ｈｅｅｐ ｒｅｄ
ｃｅｌｌｓ）の食作用の試験において０．１乃至１０μ
ｇ／ｍｌの濃度で特異的に活性であることが証明された
。
下記実施例により本発明をいかに実施することができる
かを示す。
かを示す。
実施例
ウシフィブリノーゲンの 元 びアルキルフィブリ／−
ダン（５００１１１ｇ）を、８Ｍ尿素の存在下に、ＩＭ
ＨＣＩでｐＨ８に調節された０、ＩＭ）リス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン緩衝液（２５ｃｃ）に溶解する
。この蛋白質の最終濃度は２０ ＩＩｇ／ ｃｃである
。
ダン（５００１１１ｇ）を、８Ｍ尿素の存在下に、ＩＭ
ＨＣＩでｐＨ８に調節された０、ＩＭ）リス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン緩衝液（２５ｃｃ）に溶解する
。この蛋白質の最終濃度は２０ ＩＩｇ／ ｃｃである
。
メルカプトエタノール（０，２ｃｃ）をこの還元剤対上
記蛋白質のモル比ｚ、ｏｏｏ対１を使用して上記蛋白質
溶液に加える。還元は窒素の雰囲気下に３７℃で３時間
行なわれる。遊離したシスティン残基は、媒体のｐＨを
ＩＭＮａＯＨ（数滴）を加えることにより８に保持しな
がら、ヨードアセタミド（４１０ｍｇ）によるアルキル
化により安定化される。
記蛋白質のモル比ｚ、ｏｏｏ対１を使用して上記蛋白質
溶液に加える。還元は窒素の雰囲気下に３７℃で３時間
行なわれる。遊離したシスティン残基は、媒体のｐＨを
ＩＭＮａＯＨ（数滴）を加えることにより８に保持しな
がら、ヨードアセタミド（４１０ｍｇ）によるアルキル
化により安定化される。
アセトン／塩酸（３９： １容量）混合物（１０容量）
の添加により上記蛋白質は４℃で１２時間後に沈澱する
。１５，０００ ｒｐｍで３０分間の遠心分離は沈澱が
分離することを可能にする。沈澱を上記した混合物で３
回及びエーテルで３回洗浄する。沈澱を水に再懸濁させ
、透析し、そしてダイア７０（Ｄｉ−ａｆｌｏ）１Ｍ１
０（八ｍ１ｃｏｎ）ｌｉで濃縮し、そして透析された生
成物を凍結乾燥する。
の添加により上記蛋白質は４℃で１２時間後に沈澱する
。１５，０００ ｒｐｍで３０分間の遠心分離は沈澱が
分離することを可能にする。沈澱を上記した混合物で３
回及びエーテルで３回洗浄する。沈澱を水に再懸濁させ
、透析し、そしてダイア７０（Ｄｉ−ａｆｌｏ）１Ｍ１
０（八ｍ１ｃｏｎ）ｌｉで濃縮し、そして透析された生
成物を凍結乾燥する。
上記還元されそしてアルキル化されたフィブリノーゲン
を、最終のフイブリノーダン濃度が１鵡ｇ／ｃｃの領域
にあるように、０．１Ｍ水酸化ナトリウム！＃液に溶解
する。得られる溶液をｐＨ８の０．０３３Ｍリン酸塩緩
衝液（２リツトル）に対して２日間透析にかける。緩衝
剤溶液は５回取り替える。
を、最終のフイブリノーダン濃度が１鵡ｇ／ｃｃの領域
にあるように、０．１Ｍ水酸化ナトリウム！＃液に溶解
する。得られる溶液をｐＨ８の０．０３３Ｍリン酸塩緩
衝液（２リツトル）に対して２日間透析にかける。緩衝
剤溶液は５回取り替える。
このようにして可溶性フイブリノーゲンを含有するｐＨ
８の溶液が得られる。この溶液を、酵素／基質比が１．
：１００の領域にあるようにして、予備処理されていな
いトリプシンの作用に付す。酵素による加水分解は３７
℃で２４時間続けられ、半分の量の酵素が反応の開始時
に加えられそして残りが加水分解の開始後４時間目に加
えられる。
８の溶液が得られる。この溶液を、酵素／基質比が１．
：１００の領域にあるようにして、予備処理されていな
いトリプシンの作用に付す。酵素による加水分解は３７
℃で２４時間続けられ、半分の量の酵素が反応の開始時
に加えられそして残りが加水分解の開始後４時間目に加
えられる。
反応混合物を１３＋ＯＯＯｒｐｍで１時間遠心分離し、
上澄み液を乾ｖＩ！させ、次いで３０％濃度の酢酸溶液
（３０ｅｅ）の中に取り込む。混合物を１３ｔＯ００ｒ
ｐｍで３０分間遠番分離にかける。
上澄み液を乾ｖＩ！させ、次いで３０％濃度の酢酸溶液
（３０ｅｅ）の中に取り込む。混合物を１３ｔＯ００ｒ
ｐｍで３０分間遠番分離にかける。
透明な上澄み液をセファデックス（５ｅｐｈａｃｌｅｘ
）Ｇ−５０（高さ１２３ ｃｍ、直径４．５ ｃｍ）の
カラムでろ過し、３０％濃度の酢酸で溶出し、そして２
．７ｃｃの７ラクシ薔ンを集める。
）Ｇ−５０（高さ１２３ ｃｍ、直径４．５ ｃｍ）の
カラムでろ過し、３０％濃度の酢酸で溶出し、そして２
．７ｃｃの７ラクシ薔ンを集める。
このようにして処理しそして２８０ ｒｖにおけるυＶ
吸収によるクロマトグラフィーの結果として、その平均
分子量を決定するフラクションを規定することができる
ゾーンが得られる。ろ過ダイヤグラムは添付図面の第１
図に示されている。
吸収によるクロマトグラフィーの結果として、その平均
分子量を決定するフラクションを規定することができる
ゾーンが得られる。ろ過ダイヤグラムは添付図面の第１
図に示されている。
生物学的に活性な７ラクシ目ンは下記の通りである：
物質■：７ラクン壺ン１１０５−１３６９ｃｅ；平均分
子ｆｉ７，０００ 物質■：７ラクション１３フ１−１５９３ｃｃ；平均分
子量２，５００ 物質■：フラクション１５９４−１９２２ｃｃ；平均分
子量８００゜ 物質■をＣＭ）リスアクリル（ＣＭ ＴｒｉＳａｃｒｙ
ｌ）（ＩＢＦ登録商り（高さ１１．０ ｃｍ、直径２．
２ ａｍ）のカラムでろ過し、ｐＨ３，５の０．ＯＩＭ
Ｔ ｒｉｓ −１１ｃｌ［）リス（ヒドロキシメチ
ル）アミ／メタン、 Ｈｅ１ｌ緩衝剤溶液で溶出し、そ
して３．１−ｃｃ７ラクシａンを集める。
子ｆｉ７，０００ 物質■：７ラクション１３フ１−１５９３ｃｃ；平均分
子量２，５００ 物質■：フラクション１５９４−１９２２ｃｃ；平均分
子量８００゜ 物質■をＣＭ）リスアクリル（ＣＭ ＴｒｉＳａｃｒｙ
ｌ）（ＩＢＦ登録商り（高さ１１．０ ｃｍ、直径２．
２ ａｍ）のカラムでろ過し、ｐＨ３，５の０．ＯＩＭ
Ｔ ｒｉｓ −１１ｃｌ［）リス（ヒドロキシメチ
ル）アミ／メタン、 Ｈｅ１ｌ緩衝剤溶液で溶出し、そ
して３．１−ｃｃ７ラクシａンを集める。
ろ過ダイヤグラムは第２図に示されており、第２図にお
いては、フラクション番号は横座標として現れそして２
８０ｎＩ１１及び２２０ｎｍにおける光学密度は縦座標
として現れるる １４の７２クシ５ンを集め、その中の
７ラクシヨン４３０−５５８ａｅ、 ８５０−１０４２
ｃｃ及び１０４３−１１５３ｃｃは、それぞれ“ピーク
５”（ＮＪＩｌｌ）６．１９フ、及び２５０） 、“ピ
ーク１０″（ＭＪＨ１）９）及び“ピーク１１”（ＭＪ
Ｉ＋ １８０）と呼ばれる活性物質を生じる。
いては、フラクション番号は横座標として現れそして２
８０ｎＩ１１及び２２０ｎｍにおける光学密度は縦座標
として現れるる １４の７２クシ５ンを集め、その中の
７ラクシヨン４３０−５５８ａｅ、 ８５０−１０４２
ｃｃ及び１０４３−１１５３ｃｃは、それぞれ“ピーク
５”（ＮＪＩｌｌ）６．１９フ、及び２５０） 、“ピ
ーク１０″（ＭＪＨ１）９）及び“ピーク１１”（ＭＪ
Ｉ＋ １８０）と呼ばれる活性物質を生じる。
“ピーク５″７フクシヨンは、長さが３０ｃ饋で直径が
７，８ｅｎ＋であるセミプレパラテイブカラム（ｓｅｍ
ｉ−ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｕＩＩＩｎ） ［
ウォーターズ Ｃ１８−μ−ボンダバクカラム（−＾Ｔ
ＥＲ３Ｃ１８−μ−ｂｏｎｄａｐａｋ ｃｏｌｕｍｎ）
により逆相１１ＰＬｃ（ｒｅｖｅｒｓｅｄ ｐｈａｓｅ
ｌｌｌ’ｌ。
７，８ｅｎ＋であるセミプレパラテイブカラム（ｓｅｍ
ｉ−ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｕＩＩＩｎ） ［
ウォーターズ Ｃ１８−μ−ボンダバクカラム（−＾Ｔ
ＥＲ３Ｃ１８−μ−ｂｏｎｄａｐａｋ ｃｏｌｕｍｎ）
により逆相１１ＰＬｃ（ｒｅｖｅｒｓｅｄ ｐｈａｓｅ
ｌｌｌ’ｌ。
Ｃ）により精製される。溶出速度ｉｃｅ／分で０．５−
ｃｃフラクションを集める。始めに、カラムは０．１％
濃度のトＩＪフルオロ酢酸（ＴＦ＾）（溶出剤Ａ）によ
り緩衝される。
ｃｃフラクションを集める。始めに、カラムは０．１％
濃度のトＩＪフルオロ酢酸（ＴＦ＾）（溶出剤Ａ）によ
り緩衝される。
Ｔ Ｆ Ａ （０，１容量％）及びアセトニトリル（７
０％）を含有する溶出剤（溶出剤Ｂ）を調製する。
０％）を含有する溶出剤（溶出剤Ｂ）を調製する。
“ピーク５″７ラクシヨンを０−１％濃７１ＴＦＡに溶
解する（５００μｍ）６ 溶出はリニアー溶出勾配（ｌｉｎｅａｒ ｅｌｕｔｉｏ
ｎ ｇｒａｄ−ｉｅｎｔ＞を使用して行なわれ、下記表
に従って進行する。
解する（５００μｍ）６ 溶出はリニアー溶出勾配（ｌｉｎｅａｒ ｅｌｕｔｉｏ
ｎ ｇｒａｄ−ｉｅｎｔ＞を使用して行なわれ、下記表
に従って進行する。
時 間 溶出剤Ａ 溶出剤Ｂ
（分）
溶出グイ７グラムは第３図に示されている。溶出の後に
２８０ｎｍ及び２２０ｎｍにおける吸収の測定が続く。
２８０ｎｍ及び２２０ｎｍにおける吸収の測定が続く。
溶出グイアゲラムは５つのゾーンを含み、その最も重要
な７２クシＢンは、それぞれ、３６分乃至４１分及び４
１分乃至５５分の保持時間を有する溶出混合物から生じ
るゾーンＩＶ（ＭＪ８２２Ｂ）及びゾーンＶ（ＭＪＨ２
２９）である。
な７２クシＢンは、それぞれ、３６分乃至４１分及び４
１分乃至５５分の保持時間を有する溶出混合物から生じ
るゾーンＩＶ（ＭＪ８２２Ｂ）及びゾーンＶ（ＭＪＨ２
２９）である。
７ラクシａンＭＪＨ２２８を先に使用した種類と同じ種
類のカラムによるＨ Ｐ Ｌ Ｃにより再び精製し、０
．５−ｃｃ７ラクシヨンを集める、溶出速度は１ ｃｃ
／分である。
類のカラムによるＨ Ｐ Ｌ Ｃにより再び精製し、０
．５−ｃｃ７ラクシヨンを集める、溶出速度は１ ｃｃ
／分である。
上記のものと同じ溶出剤を使用する。
溶出は双曲線溶出勾配（ｈｙｐｅｒｂｏｌｉｃ ｅｌｕ
ｔｉｏｎ ｇｒａｄ−ｉｅｎｔ）７番（ウォーターズ）
を使用して行なわれ、下記表に従って進行する。
ｔｉｏｎ ｇｒａｄ−ｉｅｎｔ）７番（ウォーターズ）
を使用して行なわれ、下記表に従って進行する。
時 間 溶出剤Ａ 溶出剤Ｂ
（分〕
ｏ ｉｏｏ 。
ｉ ０． ９０ １０溶出ダイヤグラ
ムは第４図において示される。
ムは第４図において示される。
溶出ダイヤグラムは１３のピークを含む。
５１乃至５４分（ピーク７）、５４乃至５６分（ピーク
８）、６１乃至６３分（ピーク１１）、６３分乃至６６
分（ピーク１２）に溶出された７ラクシａンは、それぞ
れ、活性物質ＭＪＨ２５７、ＭＪＨ２５８、Ｍ Ｊ Ｈ
２６１及びＭＪＨ２６２を含有する。
８）、６１乃至６３分（ピーク１１）、６３分乃至６６
分（ピーク１２）に溶出された７ラクシａンは、それぞ
れ、活性物質ＭＪＨ２５７、ＭＪＨ２５８、Ｍ Ｊ Ｈ
２６１及びＭＪＨ２６２を含有する。
７−７クシコンＭ、ＪＪＩ２２９を上記に使用したカラ
ムと同じ種類のカラムでＨＰＬＣにより再び精製し、０
．５−ｃｃ７ラクンヨンを集める。溶出速度は１００７
１１１７分である。
ムと同じ種類のカラムでＨＰＬＣにより再び精製し、０
．５−ｃｃ７ラクンヨンを集める。溶出速度は１００７
１１１７分である。
上記と同じ溶出剤を使用する。
溶出は双曲線溶出勾配〔ウォーターズ勾配７（ＷＡＴＥ
Ｒ８ｇｒａｄｉｅｎｔ？）］を使用して行なわれ、ＭＪ
Ｈ２２８に対しで使用された上記表に従って進行する。
Ｒ８ｇｒａｄｉｅｎｔ？）］を使用して行なわれ、ＭＪ
Ｈ２２８に対しで使用された上記表に従って進行する。
溶出ダイヤグラムを第５図に示す。
溶出ダイヤグラムは１２の７２クシタンを含有する。６
０乃至６５分、６５乃至６８分、６８乃至７４分に溶出
された７ラクシヨンは、それぞれ、物質ＭＪＨ２５３、
ＭＪＨ２５４及びＭ Ｊ Ｈ２５５を含有する。
０乃至６５分、６５乃至６８分、６８乃至７４分に溶出
された７ラクシヨンは、それぞれ、物質ＭＪＨ２５３、
ＭＪＨ２５４及びＭ Ｊ Ｈ２５５を含有する。
生成物ＭＪＨ２５４を含有する７ラクシヨンを再゛び上
記に使用したカラムと同じ種類のカラムによるＨ、ＰＬ
Ｏにより精製し、０．５−ｃｃ７ラクシａンを集める。
記に使用したカラムと同じ種類のカラムによるＨ、ＰＬ
Ｏにより精製し、０．５−ｃｃ７ラクシａンを集める。
溶出速度はｌｃｃ／分である。
上記し同じ溶出剤を使用する。
溶出は下記表に従って進行して行なわれる。
時 間 溶出剤Ａ 溶出剤Ｂ 勾 配（分）
３０ ６０ ４０ イック２テイツク７０
０ １００ リニアー溶出ダイヤグラム
は３つの主要なゾーンを含有する。
０ １００ リニアー溶出ダイヤグラム
は３つの主要なゾーンを含有する。
１５乃至２０分、２０乃至２４分、４６乃至６０分に溶
出された７２クシヨンは、それぞれ、物質ＭＪＨ２９９
、Ｍ Ｊ Ｈ３０１及びＭＪＨ３０５を含有する。
出された７２クシヨンは、それぞれ、物質ＭＪＨ２９９
、Ｍ Ｊ Ｈ３０１及びＭＪＨ３０５を含有する。
７ラクシａンＭ Ｊ ｌ−Ｉ ２９９を再び上記したカ
ラムと同じ種類のカラムによるＨＰＬＣにより精製し、
０．５−ｅｃ７ラクシ５ンを集める。溶出速度は１ ｃ
ｃ／分である。
ラムと同じ種類のカラムによるＨＰＬＣにより精製し、
０．５−ｅｃ７ラクシ５ンを集める。溶出速度は１ ｃ
ｃ／分である。
上記と同じ溶出剤を使用する。
溶出は下記表に従って進行して行なわれる。
時 間 溶出剤Ａ 溶出剤Ｂ 勾 配（分）
３０ ８０ ２０ イック２チツク７５
６０ ４０ リニアー５２乃至５３
分及び５４乃至５７分に溶出されたフラクションは、そ
れぞれ、活性物！ＭＪＨ３３５及びＭＪＨ３３６を含有
する。
６０ ４０ リニアー５２乃至５３
分及び５４乃至５７分に溶出されたフラクションは、そ
れぞれ、活性物！ＭＪＨ３３５及びＭＪＨ３３６を含有
する。
本発明は、本発明に従う物質を適合性であり（ｃｏｍｐ
ａｔｉｂｌｅ）且つ製薬学的に許容し得る１種又はそれ
より多くの希釈剤又はアジュバンドと組合せて含有する
治療に使用することができる製薬学的組成物も提供する
。
ａｔｉｂｌｅ）且つ製薬学的に許容し得る１種又はそれ
より多くの希釈剤又はアジュバンドと組合せて含有する
治療に使用することができる製薬学的組成物も提供する
。
これらの組成物は、ワクチンアジュバンド（Ｖａｅ−ｃ
ｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔｓ） （たとえば血球凝集性
サブユニッ） （ｈａｅｍａＢＩｕｔｉｎａｔｉＢ ５
ｕｂ−ｕｎｉｔｓ）がら成る抗インフルエンザワクチン
（ａｎｔｉ−ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖａｃｃｉｎｅ）、
不活性化されたウィルスを有する抗ボリオミエリテイス
ワクチン（ａｎｔｉ−ｐｏ目ｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ｖ
ａｃｃｉｎｅ）、抗マラリャワクチン（ａｎｔｉｍａｌ
ａｒｉａｌ ｖａｃｃｉｎｅ）のための〕として、その
抗体生産又は特異的細胞反応性（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ’
ｃｅｌｌ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）を増加することが所
望されるところの抗原〔ウィルス性、バクテリア性・寄
生の（ｐａｒａｓｉｔｉｅ）、カビの（ｆｕｎｇａｌ）
、腫瘍の）と同時に注射して、使用することができる。
ｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔｓ） （たとえば血球凝集性
サブユニッ） （ｈａｅｍａＢＩｕｔｉｎａｔｉＢ ５
ｕｂ−ｕｎｉｔｓ）がら成る抗インフルエンザワクチン
（ａｎｔｉ−ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖａｃｃｉｎｅ）、
不活性化されたウィルスを有する抗ボリオミエリテイス
ワクチン（ａｎｔｉ−ｐｏ目ｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ｖ
ａｃｃｉｎｅ）、抗マラリャワクチン（ａｎｔｉｍａｌ
ａｒｉａｌ ｖａｃｃｉｎｅ）のための〕として、その
抗体生産又は特異的細胞反応性（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ’
ｃｅｌｌ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）を増加することが所
望されるところの抗原〔ウィルス性、バクテリア性・寄
生の（ｐａｒａｓｉｔｉｅ）、カビの（ｆｕｎｇａｌ）
、腫瘍の）と同時に注射して、使用することができる。
これらの製薬学的組成物は、感染症に対する宿主（人又
は家畜）の抵抗を増加するという観点で又は抗腫瘍免疫
治療（ａｎｔｉ−ｔｕａ＋ｏｕｒ ｉａ＋ｍｕｎｏｔｈ
ｅｒａｐｙ）において、非特異的免疫刺激剤（ｎｏｒｒ
ｓｐｅｃｉｆ ｉｃｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｎＬ＋
＋）として使用することもできる。
は家畜）の抵抗を増加するという観点で又は抗腫瘍免疫
治療（ａｎｔｉ−ｔｕａ＋ｏｕｒ ｉａ＋ｍｕｎｏｔｈ
ｅｒａｐｙ）において、非特異的免疫刺激剤（ｎｏｒｒ
ｓｐｅｃｉｆ ｉｃｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｎＬ＋
＋）として使用することもできる。
アジュバンドとして、該新規物質はその増加したもしく
は改良された免疫応答を得ることが所望されるところの
抗原と共に水性溶液として又は油状エマルジョンとして
或いはリポソーム（ｌｉｐｏｓｏ”ｍｅｓ）の形態で１
．二の抗原の使用される経路によりそして該新規物質が
注射される前に混合される抗原の量の０．０１倍乃至１
０倍の間で変る割合において投与することができる。
は改良された免疫応答を得ることが所望されるところの
抗原と共に水性溶液として又は油状エマルジョンとして
或いはリポソーム（ｌｉｐｏｓｏ”ｍｅｓ）の形態で１
．二の抗原の使用される経路によりそして該新規物質が
注射される前に混合される抗原の量の０．０１倍乃至１
０倍の間で変る割合において投与することができる。
非特異的免疫刺激剤としての用途に対して、該新規物質
は水性溶液において又は油状エマルジョンにおいて或い
はリポソームの形態で静脈内に、筋肉内に、皮下に、鼻
腔内に、及び場合により経口的に又は直腸内に投与する
ことができる。この場合に、投与される本発明に従う物
質の投与量は一般に０．０１＋Ｈ／ｋｇである。人間の
治療においては、−日の投与量は求められる効果に依存
する。それは成人に対して０．５ｍＢ乃至１０ｍＢであ
ることができる。
は水性溶液において又は油状エマルジョンにおいて或い
はリポソームの形態で静脈内に、筋肉内に、皮下に、鼻
腔内に、及び場合により経口的に又は直腸内に投与する
ことができる。この場合に、投与される本発明に従う物
質の投与量は一般に０．０１＋Ｈ／ｋｇである。人間の
治療においては、−日の投与量は求められる効果に依存
する。それは成人に対して０．５ｍＢ乃至１０ｍＢであ
ることができる。
経口投与用の固体組成物は錠剤、丸剤、粉末剤又は顆粒
剤であることができる。
剤であることができる。
経口投与用液体組成物は製薬学的に許容し得るエマルジ
ョン、溶液、懸濁液、シロップ又はエリキシルであるこ
とがで終る。
ョン、溶液、懸濁液、シロップ又はエリキシルであるこ
とがで終る。
非経口用又は鼻腔内投与用組成物は無菌の水性溶液又は
懸濁液又はエマルジョンであることができる。
懸濁液又はエマルジョンであることができる。
無菌化は種々の方法で、たとえば、細菌学的フィルタに
より又は無菌化剤を導入することによって行なうことが
できる。照射（βｍｌ）により無菌にされた固体組成物
は、場合により使用時に、無菌の水又は任意の他の注射
可能な無菌の媒体中に溶解することができる。
より又は無菌化剤を導入することによって行なうことが
できる。照射（βｍｌ）により無菌にされた固体組成物
は、場合により使用時に、無菌の水又は任意の他の注射
可能な無菌の媒体中に溶解することができる。
直腸投与用の組成物は坐剤であることができる。
下記する実施例は本発明に従う組成物を例示する。
実施例：
慣用の方法により、下記の組成を有する静脈内に投与す
ることができる液体組成物を調製する。
ることができる液体組成物を調製する。
物質ＭＪ８２５７ １０Ｂ
注射可能な溶液 ５ｃｃ
第１図は実施例に記載された、遠心分離された透明上澄
み液の濾過ダイヤグラムである。 第２図は実施例に記載の物質■の濾過ダイヤグラムであ
る。 第３図は実施例に記載された“ピーク５”７ラクシタン
の溶出ダイヤグラムである。 第４図は実施例に記載されたフラクションＭＪＨ２２８
の溶出ダイヤグラムである。 第５図は実施例に記載されたフラクションＭＪＨ２２９
溶出ダイヤグラムである。
み液の濾過ダイヤグラムである。 第２図は実施例に記載の物質■の濾過ダイヤグラムであ
る。 第３図は実施例に記載された“ピーク５”７ラクシタン
の溶出ダイヤグラムである。 第４図は実施例に記載されたフラクションＭＪＨ２２８
の溶出ダイヤグラムである。 第５図は実施例に記載されたフラクションＭＪＨ２２９
溶出ダイヤグラムである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ウシフィブリノーゲンから、そのジスルフィド結合
を還元し、続いて、このようにして遊離されたメルカプ
ト基をアルキル化し、得られた生成物を酵素により部分
的に加水分解し、水溶性の加水分解生成物をそれらの分
子量に従って分別し、そして免疫刺激特性を有する１つ
又は複数のフラクションを分離することにより得られる
新規な免疫刺激性物質。 ２、酵素による加水分解をトリプシン、キモトリプシン
又はトリプシン及びキモトリプシンの両者により行う特
許請求の範囲第１項記載の免疫刺激性物質。 ３、酵素による加水分解を酵素対基質比的１：１００を
使用して約３７℃で約２４時間行なう特許請求の範囲第
２項記載の免疫刺激性物質。 ４、５００乃至７５００の範囲の平均分子量を有する特
許請求の範囲第１−３項の何れかに記載の免疫刺激性物
質。 ５、約２５００の平均分子量を有する特許請求の範囲第
４項記載の免疫刺激性物質。 ６、加水分解生成物の分別をゲルろ過により行なう特許
請求の範囲第１−５項の何れかに記載の免疫刺激性物質
。 ７、加水分解生成物の分別をセファデックスＧ−５０に
よりろ過し、３０％の水性酢酸で溶出することにより行
なう特許請求の範囲第６項記載の免疫刺激性物質。 ８、分別に続いて高性能液体クロマトグラフィーを行な
う特許請求の範囲第６項記載の免疫刺激性物質。 ９、前記フィブリノーゲンのジスルフィド結合の還元を
メルカプトエタノールにより行い、メルカプト基のアル
キル化をヨードアセタミドにより行なう特許請求の範囲
第１−８項の何れかに記載の免疫刺激性物質。 １０、有効量の特許請求の範囲第１項記載の免疫刺激性
物質を適合性の製薬学的に許容し得る希釈剤又はアジュ
バンドと共に含有して成る製薬学的組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8409560A FR2565984B1 (fr) | 1984-06-19 | 1984-06-19 | Nouvelles substances biologiquement actives, leur procede de preparation a partir du fibrinogene bovin et les compositions qui les contiennent |
| FR8409560 | 1984-06-19 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6117521A true JPS6117521A (ja) | 1986-01-25 |
Family
ID=9305176
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60130074A Pending JPS6117521A (ja) | 1984-06-19 | 1985-06-17 | 新規な生物学的に活性な物質、その製造及びそれを含有する組成物 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4647554A (ja) |
| EP (1) | EP0169115A1 (ja) |
| JP (1) | JPS6117521A (ja) |
| FR (1) | FR2565984B1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2594847B1 (fr) * | 1986-02-25 | 1989-06-02 | Moet Hennessy Rech | Procede de preparation de polypeptides biologiquement actifs, polypeptides obtenus et compositions les contenant |
| JPH04233458A (ja) * | 1990-08-23 | 1992-08-21 | New York Blood Center Inc | 可溶性フィブリン様モノマーを使ったアッセイ |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1362776A (en) * | 1970-07-17 | 1974-08-07 | Wellcome Found | Immunological reagent |
| DE2532151C3 (de) * | 1975-07-18 | 1979-06-13 | Biotest-Serum-Institut Gmbh, 6000 Frankfurt | Antisenim zur quantitativen Bestimmung der Abbauprodukte des Fibrins und Fibrinogen« und Verfahren zu seiner Herstellung |
| US4027013A (en) * | 1976-01-22 | 1977-05-31 | William L. Wilson | Clottable fibrinogen free factor VIII and albumin product and process |
| DE2708780A1 (de) * | 1977-03-01 | 1978-09-07 | Bayer Ag | Neue blutserumpraeparationen, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung als arzneimittel und medizinische hilfsstoffe |
| FR2491334A1 (fr) * | 1980-10-03 | 1982-04-09 | Inst Nat Sante Rech Med | Nouvelles substances biologiquement actives, leur obtention a partir de caseine humaine et compositions les contenant |
| US4442655A (en) * | 1981-06-25 | 1984-04-17 | Serapharm Michael Stroetmann | Fibrinogen-containing dry preparation, manufacture and use thereof |
-
1984
- 1984-06-19 FR FR8409560A patent/FR2565984B1/fr not_active Expired
-
1985
- 1985-06-14 US US06/744,639 patent/US4647554A/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-06-17 JP JP60130074A patent/JPS6117521A/ja active Pending
- 1985-06-18 EP EP85401209A patent/EP0169115A1/fr not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4647554A (en) | 1987-03-03 |
| EP0169115A1 (fr) | 1986-01-22 |
| FR2565984B1 (fr) | 1986-08-29 |
| FR2565984A1 (fr) | 1985-12-20 |
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