JPS6117472B2

JPS6117472B2 -

Info

Publication number: JPS6117472B2
Application number: JP14109078A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Aida
Original assignee: Godo Shusei KK
Current assignee: Godo Shusei KK
Priority date: 1978-11-17
Filing date: 1978-11-17
Publication date: 1986-05-07
Also published as: JPS5568295A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はユビキノン生産能を有するシウドモナ
ス属菌株の培養液を中性乃至アルカリ性PH或にお
いて、80℃以上沸とうに到る範囲の温度に加熱す
る前、または加熱中乃至加熱後の熱時に、有機カ
チオン系凝集剤、無機凝集剤または柿渋を添加し
て菌体を凝集させて、これを適当な網目の上に移
して菌体を分離、乾燥後有機溶剤でユビキノンを
抽出精製することを特徴とするシウドモナス属菌
株培養液からのユビキノンの製造方法に関するも
のである。ユビキノン生産能を有するシウドモナス属菌株
を培養するとユビキノンは菌体内に産生される
が、この菌体内ユビキノンの量は、他の醗酵生産
物の場合の蓄積量に比べて少量であるため、これ
を工業的に収率よく得るためには培養液から菌体
を効率よく、廉価で簡易な操作でしかも迅速に収
得することが第一の要諦である。また得られた菌体からユビキノンを抽出するに
要する溶剤の種類および量を可及的に少なくする
ことが好ましい。従来、微生物特にシウドモナス属菌体を回収す
る方法としては、種々検討されているが、低廉か
つ効率の良い方法は見出されておらず、例えば現
在利用されている高性能な遠心分離機、減圧また
は加圧式濾過機による方法では、設備費、運転費
が高額となり、また培養液のPHを4.0以下で低速
遠心分離する方法では非常に菌体回収率が低い。培養液に種々の凝集剤を添加する方法では、回
収率は比較的良好であるが、その添加量が多くコ
スト高となり、目詰まりが起こるなど濾過性も劣
悪なものが多く工業的実用化は望めない。本発明者は工業的に実施し得る有利な方法を検
討した結果、培養液のPHを調整し、加熱して熱時
に、または加熱開始前あるいは中途で有機カチオ
ン系乃至無機の培養液または柿渋を添加、混合す
ると、常温時添加に比べて非常に少量の凝集剤に
より菌体はほとんど瞬時的に凝集し、低速遠心分
離は勿論、濾過助剤なしで容易に濾過集菌できる
ばかりでなく、無圧濾過も可能となることを見出
した。すなわち、上記の方法による菌体フロツクは用
いる凝集剤によつてその大きさ、強度に差がある
が、これらは適当な網目（材質は、ステンレスス
チール乃至合成樹脂製が望ましい）上に移して容
易に分離でき、適当な厚さに調整後そのまゝ通風
乾燥することが可能である。かくして得られた湿菌体または乾燥菌体からユ
ビキノンの抽出精製を行ない得られた結晶はユビ
キノンであることを確認し、またその回収率は従
来の集菌、抽出方法によるものと同等以上である
ことを見出し、本発明を完成した。ユビキノン生産能を有するシウドモナス属菌株
の培養液から菌体を得る方法として従来知られて
いる通り有機カチオン系またはアニオン系凝集剤
を用いると、それ等の種類および量によつて凝集
の形態および凝集に要する時間に差はあるが、菌
体の凝集沈澱現象が認められる。しかし一般に多
量（培養液あたり0.5〜1.0％）を必要とし、沈澱
速度が遅く（12〜24時間）しかもフロツクの大き
さは不十分で軟弱であり、コスト的にも現場作業
上にも問題が多い。例外としてキトサンはほとん
ど瞬時的に凝集が起こり、フロツクも大きいが比
重が軽く、浮上する特徴がある。しかし添加量が
多い点では例外でない。しかしながら、各種の検討を重ねた結果、培養
液のPHを3.0〜9.0に、好ましくは7.0〜8.5に調節
し、煮沸水浴中に入れて60〜100℃、好ましくは
85〜95℃に３〜４分間加熱し、すぐ熱時にカチオ
ン系凝集剤または柿渋を添加混合すると、その添
加量は常温での添加量の10分の１乃至それ以下の
量により、直ちに凝集が起こり、一旦凝集した菌
体は冷却後も元に戻らず、凝集菌体以外の透明液
区分には、顕微鏡的にも菌体はほとんど見当らな
い。この菌体凝集操作に際し、凝集剤を添加後加熱
した場合も前述と同様の効果がある。例えば凝集
剤を添加後煮沸すると３〜５分間でフロツクを生
じ、それ以上長時間煮沸しても凝集剤添加量はほ
とんど変らない。しかし加熱した後冷却してから
凝集剤を添加した場合は凝集効果が劣り、最適条
件の場合に比し、多量の凝集剤を必要とする。また、前述のようにキトサン添加の場合は、常
温では凝集菌体が浮上するが、塩化カルシウムを
少量加えてから加熱添加すると容易に沈降するよ
うになる。一方、加熱培養液にアニオン系凝集剤を添加し
た場合は、細かい菌体懸濁物が多量生ずるが長時
間経過しても沈降せず、カチオン系凝集剤とは異
なる傾向を示す。適正な条件下でフロツクを生じた培養液は、
2000×ｇ、10分間で容易に遠心分離され、また濾
過助剤なしで低圧濾過される。また、得られる凝集菌体の大きさは、凝集剤の
ちがいにより多少異なるが、直径が大体0.2〜1.0
ｍ／ｍ以上であること、およびフロツクが壊われ
難い点を利用して、直径0.2〜1.0ｍ／ｍの網目上
に移し、容易に固液分離が可能であり、そのまゝ
或いはローラーで水切り後、メタノールで加熱抽
出するか、或いはその網ごと通風乾燥後抽出操作
を行なうことができる。通風乾燥後の抽出について通常収量の低いこと
が指摘されているが、直接非極性溶剤（例えば、
ｎ−ヘキサン）では抽出せず、少量の極性溶剤
（例えば、メタノール）に懸濁してから非極性溶
剤で抽出すると回収率は良好となり、使用メタノ
ールは10分の１以下で足りる。また湿菌体からそ
のまゝメタノールで加熱抽出した場合は、一且遠
心分離または濾過などにより、メタノール層と抽
出残渣を分別してからｎ−ヘキサン抽出しないと
一般にメタノール層とｎ−ヘキサン層の分離が非
常に困難であるが、本発明による乾燥菌体からの
抽出においては、メタノール層と抽出残渣を分別
することなく、ｎ−ヘキサンを添加しても、ユビ
キノンは容易にｎ−ヘキサン層に移り、メタノー
ルと抽出残渣混合液とを簡単に分別できる特徴が
ある。かくして得られた抽出液からシリカゲルクロマ
トグラフイーにより、ユビキノン区分を分別し、
再結晶を繰り返した結果、得られた物質は紫外線
および赤外線吸収スペクトル、クラヴエン、テス
ト（Craven test）、マススペクトルなどの分析
の結果、ユビキノンであることが確認され、収率
も常法による場合と同等である。本発明に使用する凝集剤としては、各種の市販
品の中、アクリルアミド、またはアクリルエステ
ル系のものは、効果に若千の差はあるが使用可能
であり、キトサンまたは無機凝集剤（塩化カルシ
ウム、硫酸アルミニウムなど）あるいは、柿渋も
本発明の凝集剤として使用が可能である。次に実施例を示すが、本発明はこれに限定され
るものではない。実施例１グルコース２％、ポリペプトン１％、酵母エキ
ス１％、食塩0.2％、PH7.0の培地にシウドモナ
ス・シユイルキリエンシス（Pseudomonas
Schuylkilliensis）IAM−1092を48時間培養し、
（30L容ジヤーフアーメンタ、15L仕込、
250rpm、1VVm、30℃）この培地100mlを、それ
ぞれPH４，５，６，７，８，９に調整し、85℃、
３分間加熱後、0.5％キトサン液を加え、PHが所
定の値より低下する場合は10％水酸化ナトリウム
液で所定PHまで補正して、凝集効果を比較検討し
た。その結果、キトサン添加量を0.1％に固定した
場合は第１表のとおりであつた。

【表】また、PH４，５，６で加熱し、キトサン添加後
それぞれPH４，５，６に調整した場合には、培地
当りキトサン添加量を0.5〜１％にしても、凝集
は不完全で、粘ちような溶液になるにとどまる
が、それぞれのPHで加熱後直ちにPHを7.6に調整
した場合は、PHが高い程、少ないキトサン量で凝
集が起こる。PH７，８，９で加熱後キトサンを添
加する場合については、７で加熱し、キトサン添
加後PH7.5に調整するのが、最も少量の添加量で
完全凝集が起こり、培養液当り0.1％であつた。
PH８の場合がこれに次いで効果的であり、いずれ
の場合も凝集菌体の周囲の液は透明となり、顕微
鏡観察で菌体はほとんど存在しなかつた。実施例２グルコース１％、コーン・ステイープ・リカー
８％の培地に、シウドモナス・デイミヌータ
（Pseudomonas diminuta）IAM−1513を接種
し、30Lジヤーフアーメンタに15L仕込、
150rpm、1vvm、30℃、48時間培養で12mg／Ｌの
ユビキンを蓄積せしめた。この培養液をPH8.0で
種々の温度に加熱した後、塩化カルシウムおよび
キトサンを添加する場合について検討した結果、
塩化カルシウムについては、80℃以上の加熱後の
添加でないと、著しい効果はみとめられなかつ
た。すなわち塩化カルシウムの添加は、室温、40
℃，60℃では、100mlの培養液に対して、４×
10^-1Mの塩化カルシウムを５ml添加した場合、細
かい沈澱がゆつくり生ずるが１夜経過後も透明な
上澄液は得られず、濾過助剤として、ダイカライ
トパーライト4109を２％添加して、ようやく透明
液が得られた。しかし80℃および95℃に３分間加
熱した後５ml添加し撹拌するとほとんど瞬時的に
大きなフロツクが形成され透明液が得られ、70メ
ツシユの篩上に移すと98％の菌体が篩上に残留し
た。また、3000rpm、10分間の遠心分離で完全に集
菌できた。一方キトサンの場合は、完全凝集し透
明液が得られる添加量は、室温、40℃、60℃３分
間保持で培養液当り、0.9〜1.0％であり、加熱時
間を長くしても効果がなかつたが、80℃、90℃で
３分間保つた後添加すると0.1％であつた。

【表】この凝集菌体を32メツシユの篩上に移すとほと
んど全部の菌体が篩上に残り、濾過は非常に容易
であつて、回収した菌体の水分は77％であつた。これに対して室温で凝集した菌体は水和度が大
きく、32メツシユの篩上に残るが却つて目詰まり
を生じ、濾過が困難であつた。また、加熱後冷却してから添加すると効果は非
常に低下し、完全凝集が得られなかつたり、必要
添加量が増加した。培養液5Lから本発明の方法で得た凝集菌体110
ｇを50℃で通風乾燥して、ユビキノンQ₁₀の抽出
を検討し次の結果を得た。メタノールを添加し30℃、60分間抽出し、メタ
ノール層からｎ−ヘキサンにユビキノンQ₁₀を抽
出する操作では、乾燥前の菌体の場合メタノール
2500ml、ｎ−ヘキサン2500mlを用い、58.0mgを得
た。一方乾燥菌体の場合はメタノール250ml、ｎ
−ヘキサン1250mlで十分抽出され60.5mgが得られ
た。また、ｎ−ヘキサンで直接抽出した場合は、
50.2mgが得られた。乾操菌体を用いるとメタノー
ル抽出後、メタノール層と菌体残渣を分別するこ
となくｎ−ヘキサンを加えても、ユビキノンQ₁₀
は容易にｎ−ヘキサンで抽出され、両層の分離が
良好であつたが、湿菌体では一旦菌体残渣を分別
除去しないとｎ−ヘキサンを加えても、分離困難
であつた。実施例３実施例１と同一組成の培地で同一条件下で、シ
ウドモナス・デニトリフイカンス
（Pseudomonas denitrificans）IAM−12023を培
養し、実施例１および２と同様の試験を行ない、
それらと同等の結果が得られた。実施例４実施例１と同一組成の培地で醗酵終了した、シ
ウドモナス・ウツドシ（Pseudomonas
Woodsii）の培養液をPH7.5に調整し、そのまま遠
心分離して完全に集菌するには、8000×ｇ、10分
間を必要とするが、85℃、３分間加熱後、４×
10^-1Mの塩化カルシウム液を培養液に対して５％
添加して2500×ｇ、10分間で100％菌体回収がで
きた。常温で添加した場合、同様に遠心分離する
と78％の菌体が回収された。85℃、３分間加熱し
ただけで同様の遠心分離をした場合の菌体回収率
は、87％であり、PH3.5に調整して同様の条件で
遠心分離すると菌体回収率は、74％であつた。実施例５実施例２の醗酵終了培養液100mlをPH7.5に調整
後室温および85〜90℃に３分間それぞれ保つた
後、柿渋を添加した結果、室温添加の場合は、市
販柿渋10〜20mlでは著しい凝集は認められなかつ
たが、85〜90℃に加熱後すぐ添加した場合には、
4.0mlの添加混合により、直ちに著しい凝集が起
こり、フロツクも大で透明な上澄液が得られた。
このようにして得られた凝集菌体から常法によつ
てユビキノン分画を抽出、精製し、得られた黄色
結晶の物理化学的諸性状は、ユビキノンQ₁₀と一
致した。実施例６実施例２の醗酵終了培養液100mlにつき、実施
例４と同様の条件で市販のカチオン系凝集剤、例
えば、サンポリ−K505、K744、セデイプルCF−
900、ダイヤフロツクKP001、KP007、KP201B、
スミフロツクFC−Ｐなどについて検討した結
果、各凝集剤によつて若千の差異はあるが、それ
等の0.2％溶液を100ml加えても著しい凝集は生じ
なかつたが、加熱後十分温度の高いうちに４〜18
mlを添加して撹拌すると、直ちに著しい凝集が生
じ、透明な上澄液が得られた。また、凝集剤を添加して後で加熱しても加熱後
添加した場合と同等またはそれ以上の、凝集効果
がみとめられた。加熱前PH8.5、加熱温度85〜95℃、ダイヤフロ
ツクKP201Bの0.4％溶液を使用した場合の結果を
第３表に示す。

【表】

Claims

【特許請求の範囲】

１ユビキノン生産能を有するシウドモナス属菌
株の培養液を中性乃至アルカリ性において、80℃
以上沸とうに到る範囲の温度に加熱する前、また
は加熱中乃至加熱後の熱時に、有機カチオン系凝
集剤に、無機凝集剤または柿渋を添加することに
より菌体を凝集させ、これを適当な網目上に移し
て、菌体を分離、脱水後有機溶剤でユビキノンを
抽出精製することを特徴とするシウドモナス属菌
株の培養液からのユビキノンの製造方法。