JPS61134667A

JPS61134667A - リンパ球分離用仕切器具および分離器具

Info

Publication number: JPS61134667A
Application number: JP6493785A
Authority: JP
Inventors: アルバート　オーガスト　ルドラー; ワード　カーテイス　スミス
Original assignee: Corning Glass Works
Current assignee: Corning Glass Works
Priority date: 1984-12-04
Filing date: 1985-03-28
Publication date: 1986-06-21
Also published as: EP0184274A2; EP0184274B1; CA1291098C; DE3586089D1; EP0184274A3; JPH0533346B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本出願は１９８３年１０月２１日に出願された米国特許
出願第５４４，１２５号の一部継続出願に基づくもので
あり、本発明はリンパ球を分離するために用いられる器
具に関するものである。

（従来技術）近年、人血からリンパ球を分離および採取するための改
良された手段を開発する研究がかなり行イ５われてきた
。このような研究の原動力となっているのは臓器移植を
求める患者に対する組織適合性決定の必要性である。免
疫抑−１に必要な薬物の種類および山を決定する上でリ
ンパ球機能の測定は小型である。

従来の静脈切開法によって採血し、抗凝血化した人血か
らリンパ球を分離採取する公知の方法の１つは血球の浮
遊密度遠心分離を利用するものである。この際、遠心分
離用の媒体にはニュートン流体を使用するが、しばしば
用いられるのはファルマシア　ファイン　ケミカル社（
Ｐ　ｈａｒｓａｃｉａＦｉｎｅ　　　Ｃｈｅｉｉｃａｌ
ｓ　　ＡＳ、　　ｕｐＤｓａｌａ、　　３ｗｅｄｅｎ　
　）より販売される比重的１，０７７ｇ／ｃｃの液体密
度勾配媒体であるフィコール−バック（１：　１ｃｏｌ
ｌ　−Ｐａｑｕｅ　’　）である。この方法は以下の４
つの一般的な工程、すなわち（ａ＞所定量のフィコール−バック媒体を試験管の底部
に注入する工程、（ｂ）！血もしくは希釈血液からなるサンプルを媒体上
に注意深くピペットで供給する工程、（ｃ）試験管を遠
心機内に配置して血液−媒体混合物を約４００〜５００
Ｇで約３０〜４０分間遠心分離することによって媒体よ
りも大きな比重を有する血液成分、すなわち比重＞　　
１，０７７ｇ／ｃｃの成分が液体を貫通するようにする
工程、および（ｄ）その後に、比重が１．０７７ｇ／ｃ
ｃよりも低い成分であるリンパ球を媒体からピペットで
採取する工程からなる。

この方法にはいくつかの問題点もしくは注意点の内在し
ていることが見出されてきた。例えば、（１）血液ナン
プルのピペッティング中に誤まつてリンパ球が媒体の表
面下に拡散すると、この領域における媒体の比重が低下
してリンパ球の分離に不適なものとなること、（２）遠心分離中に血液中のより軽い相が分離媒体内に
移動すると、４００〜５００Ｇによって発生する浮遊力
ではこれらの相が媒体を貫通して上昇することは不可能
であること、（３）フィコール−パックはい（らか水溶性であり、遠
心力が高くなるとこの水溶性が増大して比重の変化を招
くため、これに対して約４００〜５００Ｇを超える遠心
力を用いることができないこと、および（４）遠心分離の終了後、分離媒体表面からリンパ球を
ピペッティングする際にはフィコール−１バック媒体の
ニュートン特性を考慮してかなりの注意を払わなければ
ならないことが挙げられる。

この方法を改善するために数多くの提案がなされてきた
。これらの提案のうちのいくつかを以下に記載する。

米国特許第３，８５２，１９４号には分離すべき相の中
間に位置する比重を有するシキソトロビックなゲル状物
質を用いて人血中の重いフラクションから軽いフラクシ
ョンを分離する方法が・□記載されている。ゲルおよび
血液サンプルを共に遠心分離するとゲルは軽い相と重い
相との間に障壁を形成するに充分な流れを生ずる。この
障壁上に位置する相は従来の実験至技術によって容易に
採取することが可能である。

この特許は様々なゲル状物質の使用を意図するものであ
り、これらの物質は３つの一般的な条件、すなわち（１）分離すべき相の中間に位置する比重を有すること
、（２）人血の相に対して化学的に不活性であること、お
よび（３）静止時においてほぼ非流性（シキソトロビック）
であることを満足するものである。

米国特許第３，９２０，５４９号は上記米国特許第３，
８５２．１９４号の開示を改良するものであると考えら
れる。その改良貞はゲル状物質よりも大きな比重を有し
て［エナジャイザ−（ｅｎｅｒｇｉｚｅｒ　）　Ｊと称
される固形素子の使用にある。このエナジャイザーは遠
心分離中に、通常は採血管の底部に位置するゲルに衝撃
を与えることによって管壁に沿ったゲルの上昇運動を促
進させる。このようにしてエナジＶイ晋アーは血液相の
分離を加速し、より清浄な分離をそれらの間に実現する
。

米国特許第４，１９０，５３５号は特にリンパ球、単球
、および血小板を抗凝血化血液から分離する方法に関す
るものである。この方法は以下の３つの一般的な工程、
すなわち（１）比重が約１，０６５〜１．０７７ｇ／　ｃｃであ
って血液成分に対して不活性である水不溶性シキソｉ・
ロビツクゲル状物質を抗凝血化血液サンプル中に入れる
工程、（２）ゲル−血液混合物を、少なくとも１２００Ｇの力
を用いて、ゲルがより重い血球と、リンパ球、中球、お
よび血小板との間に障壁を形成するに充分な長さの時間
遠心分離する工程、Ｊ５よび（３）次いで、リンパ球、
単球、および血小板を障壁の最上部から除去する工程を
含んでいる。

この特許においては、１２００Ｇを超える遠心力におい
て障壁を形成することのできる非ニユートン性の水不溶
性ゲル状物質を用いたためにフィコール−バック媒体を
用いた場合よりも迅速かつ完全な分離が可能であったと
認められている。また、この特許は液体密度勾配媒体の
排除により、２つの液体を混合することなく積層すると
いう時間のかかる工程を省略できることも認めている。

１９８３年９月１日にリチャード、Ｊ、キャロル（Ｒｉ
ｃｈａｒｄ　　Ｊ、　Ｃａｒｒｏｌｌ）　、アルバート
、Ａ。

ルダラー（Ａ　Ｉｂｅｒｔ　Ａ　、Ｌ　ｕｄｅｒｅｒ）
　、およびアン’／二＋、Ｒ，＋Ｆイ＞、ジュニア）　
ＡｎｔｈＯｎｌ／　　Ｒ，Ｚｉｎｅ　、　Ｊｒ、）の名
儀で［老廃血液からのリンパ球および単球の分離（ＳＥ
ＰＡＲＡＴＩＯＮ　　ＯＦＬＹＭＰＨＯＣＹＴＥＳ　　
ＡＮＤ　　ＭＯＮＯＣＹＴＥＳ　　ＦＲＯＭ　　ＡＧＥ
Ｄ　　ＢＬＯＯＤ）Ｊ（７）名称の下に出願された米国
特許出願第５２８，４０１号は顆粒白血球の浮遊密度に
おいて１！察されるシフトを阻止することによって抗凝
血化人血の老廃サンプルからのリンパ球および単球の分
離の品質をｎめることに向けられている。この発明によ
る方法は以下の４つの一般的な工程、すなわち（１）比
較的低分子量であって血液成分と化学的に適合する有機
もしくは無機イオン物質を含有する高張液と抗凝血化血
液サンプルとを混合する工程、（２）上記米国特許第４，１９０，５３５号に記載され
たものに類似した比重１，０６０〜１．０７５ｇ／ｃｃ
の水不溶性シキソトロビツクゲル状物質を血液−高張液
混合物中に供給する工程、（３）ゲル−血液−高張液サンプルを少なくとも１２０
０Ｇ　（７）カニ遠。分離ｔ　６　、：＆　Ｉｃよ７１
、ヶ１，１がリンパ球および単球と、より重い血液との
間に障壁を形成するようにする工程、および（４）次い
で、その障壁の最上部からリンパ球および単球を取り出
す工程を含んでいる。

上述の各先行技術は公知のフィコール−バック媒体技術
の様々な側面を変更および改良するものであるが、いず
れも分離した細胞群のＩｉＧ度に関するこの液体媒体の
特性を同等以上に改良するものではない。細胞の分離に
おいて純度は決定的な因子であるため、上述の先行技術
はすべての適用分野においてフィコール−バック媒体技
術の代用となることができるというものではない。した
がって、液体媒体を用いる細胞分離のより簡単な方法を
得るために研究が続けられてきた。より詳細には、血液
サンプルを液体密度勾配媒体上に、これら２つの液の間
の界面において混合を生ずることなくｍ層するという時
間のかかる工程を排除する方法が求められてきた。この
積層工程においては、積層化を可能としなおかつ界面に
おける動揺を防ぐような速度で試験管内壁に血液サンプ
ルを流し込むためには一般に試験管１本あたり約３分を
要する。この工程は手で行なわれ、通常１サンプルあた
り２本の試験管が用いられるため、１０本の試験管群を
用意するには１時間以上の時間が必要となることもある
。遠心分離工程においては多数の試験管を同時に処理す
ることが可能であるため、その所要時間はさぼど重要で
はない。患者の命液暑ナンブルを遠心管に直接採取すれ
ば、サンプルを採取管から遠心管に移す必要がなくなる
ため、準備工程をざらに単純化することが可能である。

多くの場合、血液を抗凝血化したり、希釈したり、ある
いは血液成分の物理的および／もしくは化学的特性を変
化させるため、細胞分離に先立って試薬を血液サンプル
に添加することが望ましい。

（発明が解決しようとする問題点）したがって、本発明の主要な目的は独立しであるいは組
み合せで単に積層化の問題の排除もしくは準備時間の短
縮を望む研究者および診断専門者の要求を満たすような
一連の器具を提供することのみならず、また上述のすべ
ての利点を得ることのできる単一の器具を提供すること
である。

（問題点を解決するための手段）最も一般的に本発明は全血サンプルもしくは予め処理し
たその細胞フラクションのより重い相からリンパ球およ
び単球を遠心分離し、この分離された相を物理的に隔離
するためのアセンブリーかうなるものである。本発明の
アセンブリーは４つの稿本的な要素すなわち、（１）開放端および閉鎖端を有する容器（通常は採ｒｆ
ｎｇもしくは遠心管）、（２）当初は前記閉鎖端に隣接して位置する密度勾配媒
体、（３）当初は前記媒体表面上に位置して該媒体をその下
部に封止する仕切プラグ、および（４）前記サンプルお
よび必要に応じて添加される抗凝血剤を収容するのに充
分な体積を有して当初はｆｔＪ記仕切プラグに隣接する
空間からなる。

滅菌製品が必要とされる場合には容器開放端を被覆する
ための閉鎖手段が必要である。病原性物質に汚染される
危険性のある血液のエアロゾル化を防ぐためには遠心分
離中に閉鎖手段を使用することが細心の方法である。従
来の遠心管においてはスクリュートップキャップが通常
は充分なものであり、吸引型採取管においては必要な保
存期間中真空状態を維持するため、一般には密着する弾
ノ】性プラグが用いられる。

第１図は本発明の好ましい実／Ｉｌ！態様を示すもので
ある。本実施態様によれば従来の遠心管１にフィコール
パックのようなアリコート量の＠度勾配媒体２が添加さ
れる。次いで、貫通孔４を有する静止型仕切プラグ３が
遠心管１内に挿入され、媒体２の表面の真上に移動され
る。プラグ３はシェブロン型の封止手段とその周縁に有
する成型ポリプロピレンから形成するか、圧縮リングを
その周縁に有する不活性な弾性もしくは塑性材料から形
成することが好ましい。次いで、所定の密度みよび粘度
を有する疎水性ゲル５を仕切プラグ３の貫通孔４内に注
入して、その下方の媒体２を封止する。ゲル５の下方に
はこのゲル５とほぼ同等の体積の空間９が必要とされる
。その後、アリコート　　　　１量の適当な試薬６、例
えば希釈剤を仕切プラグ３の上方に添加することが可能
である。血液希釈剤の使用は強制的なものではないが、
いくつかの場合においてはより良好な分離を促進するよ
うである。滅菌性を維持するためにＭ７が遠心管１の開
放端に適用される。蓋７と試薬６との間には分離される
べき血液サンプルよりもいくらか大きな体積を有する空
間８が残される。遠心管１の輸送および保存中に密度勾
配媒体２が適切な位置に保持されるようにゲル５が仕切
プラグ３の貫通孔４内に維持され、試薬６が使用される
場合に２つの液体の混合が防止されるようにするために
は非ニユートン性（シキソトロビック）ゲルの使用が好
ましい。しかしながら遠心管１が比較的迅速に使用され
る場合にはニュートン性ゲルを用いることも可能である
。

第２図は最終製品が吸引型採血管である場合の好ましい
実施態様を示すものである。本実施態様においては従来
の採取管１０にアリコート量の液体密度勾配媒体１１が
添加される。仕切プラグ１２は疎水性（シキソトロピッ
ク）ゲル塊のみからなり、液体媒体１１の表面上に押出
され、その下方の媒体を封止する。第１図に示した実施
態様と同様に輸送時および保存時における媒体１１の長
期間封止を突環するためにはシキソトロビックゲルの使
用が好ましい。しかしながら、ニュートン性ゲルをその
場で採取管１０内に挿入することも当然可能であり、極
めて満足できる結果を沼くものである。ゲルは採取管１
０の壁部に密着するに充分な粘着性を有している。ゲル
の比重は液体媒体１１よりもいくらか高いため、遠心中
にゲルは管１０内を下降して液体媒体１１と入れ替わる
。抗凝血剤、例えばリチウムヘパリン、ナトリウムヘパ
リン、もしくはＥＤＴＡを含む適当な試薬１３がプラグ
１２上方に添加される。試薬１３と閉鎖手段１５との間
の空ｌ１１１４は真空をもたらずものであり、その体積
は患者から管１０内に血液サンプルを直接採取するのに
充分なものである。閉鎖手段１５は特殊なブチルラバー
から製造したストッパーとすることが好ましい。

本実施Ｂ様においては遠心分離中に仕切プラグが管底に
移動して液体勾配媒体と入れ替わる。この作用によれば
、先の分離工程によって予め濃厚にされた細胞懸濁液を
分離することが可能である。

このような場合の例としては「軟層（Ｂ　ｕｆｆｙ　　
Ｃｏａｔｓ）　Ｊの分離があげられる。この場合には全
血が遠心されるか単にそのまま静置される。この結果、
白血球群は「軟層」すなわち淡黄色層を赤面球塊最上部
の上に形成する。この白血球層は単核細胞を分離するた
めに除去し、希釈し、遠心分離し、勾配密度媒体上に隔
離することができる。この方法は同数の細胞を処理する
ために必要とされる分離管の数を削減する手段として行
なわれる。

この方法によれば極めて高価な液体媒体を小量しか用い
なくとも高濃度の白血球を分離することが可能である。

本実施態様に基づく方法によれば、仕切プラグが管内で
静止状態に保たれる上述の第１の実施態様とは異なり、
液体媒体と入れ替わる鼻血球塊の必要とされないことは
明白である。

血液サンプルからのリンパ球の分離は以下の３つの一般
的な段階、すなわち（ａ　）　　従来の技術を用いて血液サンプルを管内に
アリコートもしくは採取する段階、（ｂ）　　管を揺動もしくは攪拌して血液と必要な試薬
とを混合する段階、および（ｃ）　　密度勾配媒体法を用い、標準的な技術により
、単核細胞（リンパ球および単球）をより重い血液相か
ら分離するために遠心分離する工程を含んでいる。

第１の実施態様においては管の回転開始に伴って発生す
る遠心力によってゲルシールが仕切りプラグ下方の空間
に移動する。液体媒体が圧縮不可能なものであり、ゲル
の移動できる空間が供給されていなければプラグの貫通
孔を未封止とすることは不可能である。第１図において
、この空間は貫通孔と同等の小さな寸法を有して人工的
に設けられている。

ゲルの移動によって貫通孔が開放され、赤血球は液体媒
体内に下降し、媒体よりも密度が高いために媒体を貫通
孔経由で仕切プラグの上方へ押し　　　　　　１上げる
。全血中の細胞の体積は約４０％であるため、８−の全
血が一般的に置き換える密度勾配媒体の典型的なアリコ
ート量は３ｄである。本実施態様においで希釈剤を使用
する場合には液体媒体が少なくとも操作可能な最低の高
さだけ仕切プラグの上から突出するに充分な最の鼻血球
塊を用いるように注意しなければならない。

第１の実施態様における操作機構の要点は血液サンプル
と液体媒体との間の相互作用を制限し、かつ制御する仕
切プラグの開口に存する。すなわら、ゲルは予め媒体お
よび試薬を収容した管を形成する上で好ましい手段では
あるが、本実施態様はゲルを用いなくても製造すること
ができる。さらに、本実施態様においては、遠心管の標
準寸法に適合する仕切挿入物すなわちプラグを用いるこ
とができるため、使用者は特定の適用に必要な液体媒体
の量を調節することが可能となる。また、本実施Ｂ様は
例えば管壁から内側に突出するリング状隆起部もしくは
管内のくびれ部のような管と一体に成形した仕切プラグ
を有する分離管をも含有する。上述の各個は特定の適用
において好都合となりうるちのである。

また、予あ液体を収容してから輸送することが望ましい
場合には仕切プラグの貫通孔を閉鎖するために別の器具
を用いることも可能である。このためには開封機構の確
実な動作を必要とすることが明らかである。遠心力によ
って作動する剛性および半期性封止手段については材料
の耐性および弾性特性を綿密に制御することが欠かばな
い。付属的な別法の１つは、貫通孔を封止するために棒
状部材を用いることである。この棒状部材は管の開口端
の蓋まで上方に伸びて把握手段を有しており、蓋を外す
と棒状部材が手で取り出せるようになっている。この別
法の変更例においては棒状部材が蓋に着脱自在に設けら
れており、蓋を管から外すと棒状部材も外されるように
なっている。そして、遠心分離のために蓋を管に再び配
置する前に棒状部材は蓋から外される。しかしながら、
これらの別法においては滅菌管が汚染されないように構
成しなければならない。一般には手動によらない方法が
好ましい。

本発明の第２の実施態様においては遠心分離時にゲルが
管壁から引き離されて管底に移動する。

この作用は充分漸進的なものであるため、液体密度勾配
媒体は血液サンプルと殆ど混合することなく、この血液
サンプルの下層に移動する。この実施態様における２つ
の主要な利点は「軟Ｍ１に対して用いることができると
いう点、およびアセンブリー化する前に液体媒体および
ゲルを共に除気することによって吸引型採血管を現存の
吸引装置で減圧および止栓することができる点である。

すなわち、このような装置は典型的に減圧時に管の最上
部もしくはその上方に位置するストッパーを有している
ため、減圧時には仕切プラグもしくは貫通孔シーリング
を操作する余地がない。

また、本発明の第１の実施態様は「軟！ｉＪサンプルに
対して使用できるように変更することも可能である。こ
の変更例においては赤血球の役割をする試薬（第１図の
「６」）を用いて管底の液体媒体を移動させている。し
かしながら、この試薬の重い相は液体媒体の上昇運動を
妨げるような付加的なシーリング圧を貫通孔に与えるよ
うなものであってはならない。使用可能な試薬の１つは
多量の重い粒子、最も望ましくはガラス微粒を含有し、
移動されるべき液体媒体と少なくとも同等体積の塊を有
し、媒体および血液成分に対して不活性な希釈剤からな
る。ガラス粒子は大きな表面積を右しているため、血小
板を活性化する等の有害な効果を血液中に発現すること
がある。ガラス微粒にシリコーンコーティングを塗布す
ると血液成分と媒体との間の反応を防止することができ
る。

不活性粒子（ガラス微粒）は流体として作用し、かつ仕
切プラグ貫通孔上方でブリッジング作用を起こさないよ
うに充分小さなものでなければならない。微粒が球形で
あると試薬の粘度も殆ど上昇しない。ガラス粒子をコー
ティングすると、血液とガラスとが接触する場所におい
て通常生ずるような血液の化学的活性化が防止されるた
め、ゲルと共に静止型プラグが使用される場合あるいは
剛性プラグが貫通孔を封止するために使用されるｌＪ１
合にはこの方法を用いることができる。

さらに、本発明のもう１つの実施態様においては一体型
の多孔性フオーム材料から形成される静止型もしくは可
動型仕切プラグが使用される。この場合にはウレタンフ
オームが特に有効であり、フオーム中には赤血球の付着
が全一く認められなかつだ。

静止型仕切プラグを使用する場合はその直径を遠心管の
それよりも大きくして管に挿入した際に遠心分離によっ
て仕切が移動しないよう充分に圧縮されるようにする。

選択されるフオームの孔は密度勾配媒体の上に位置した
際にフオームが表面張力運動によることなく媒体を所定
の位置に保持できるような細かさのものとする。すなわ
ち、全血もしくは希釈血液サンプルが遠心管に注入され
る際には媒体および血液のいかなる混合も許容されない
。しかしながら、遠心分離中には赤血球がフオーム仕切
を下降し、この仕切を通過して上昇す−る勾配媒体と入
れ替るようにしなければならない。取り扱い、輸送、気
圧変化等によって誤まって仕切を通過して上昇する小石
の媒体は管をしばら（直立させておくと毛管作用によっ
てフオームを通過して元へ戻る。

圧縮力下で外さなければならない剛性弾性材料で製造し
た仕切すなわち圧縮不可能なものとは異なってフオーム
は圧縮可能である。フオーム材料のばね定数は比較的低
く、圧縮よりもマトリックスの屈曲に起因してより直線
的である。したがって、仕切の直径は大幅に変化させる
ことが可能であり、アセンブリーが容易となる。ざらに
、プラスチックスおよびゴムに対して用いるものよりも
極めて安価な道具を用いてボディをフオームシートから
打扱くことが可能である。

可動型仕切プラグは好ましくは乾燥した遠心管内に予め
収納しておくこともできる。仕切の直径は遠心管のそれ
よりも若干小さくなっているため、密度勾配媒体が管内
に注入されると仕切は浮上する。２種類の浮上機構が考
えられている。第１の８１構は媒体よりも若干密度の低
いフオームを使用するものであり、第２の機構は媒体よ
りも若干密度の高いもを使用するものである。

第１の機構を使用する場合、孔の細かさは遠心分離中に
赤血球のいくつかが孔内に捕捉されるようなりのとする
。捕捉された赤血球はフオームの児ｈｒ　＋ｊ上の重さ
を増大させ、赤血球が密度媒体を１を切から上界させる
につれてフオームを下降させる。

第２の機構を用いる場合、フオームの孔はすべての赤血
球が通過するようなものとする。仕切は媒体が管内に注
入される際に小さな気泡を捕捉するため、しばらくの間
は媒体上に浮遊する。遠心分離中にこれらの気泡は排除
され、仕切は管底に移動する。気泡の脱離に伴って血液
サンプルと密度媒体との間の混合の生ずる危険性がある
ため、過剰な量の気泡が存在しないように注意しなけれ
ばならない。

両機構において浮遊仕切は血液サンプルの添加が回転も
しくは傾斜を招かないような充分な長さのものでなけれ
ばならない。仕切の直径は自由運動が可能であり、一方
、その周縁で血液サンプルと密度媒体との間の混合が生
ずるほど小さくないことが必要である。最も好ましくは
、血液が急速に仕切から密度媒体に下降して血液との混
合を招く媒体の上昇を生ずることがないよう充分に遅い
流速で血液サンプルをピペットから仕切の中心に導入す
る。

また、静止型もしくは可動型仕切プラグは密度勾配媒体
の全潰を収容することができるような長さおよび体積の
孔を有するものとして形成することび可能である。この
ような仕切は媒体の必要聞を削減し、取扱い時および輸
送時においてより良好に媒体を保持する。さらに輸送中
に「液体ハンｖ　−（ｌｉｑｕｉｄ　ｈａｎｕｗｅｒ　
）　Ｊが仕切を移動させる傾向も少なくなる。また、仕
切は密度媒体と血液との間の界面となるフオーム体積を
決定する。

（好ましい実施例）。

滅菌し、シリコーン処理したガラスもしくはポリプロピ
レン製遠心管の底に密度勾配媒体フィコール−パックを
入れた後、中央に貫通孔を有するシリコーンオイル処理
したブチルラバープラグを　　　　　１媒体表面に接触
するように配置した。また、その周縁にシェブロンシー
ルを有するボリプＯピレン１Ｆ切プラグも使用した。前
述の米国特許第４，１９０．５３５号の記載に基づいて
ジメチルポリシロキサンと、メチル化によってゲルに疎
水性を付与するメチル化シリカとから形成され、さらに
比重を１．０８５となるような充填剤を含んでおり、血
液成分に対して化学的に不活性であり、水不溶性のシキ
ソトロピックゲルをプラグの貫通孔に注入し、その下方
のフィコール−パック媒体を封止した。仕切プラグの下
方には気泡を残し、遠心分離時にゲルが運動できるよう
にした。混合を防止するため、気泡は置換すべきゲルと
ほぼ同体積になるようにし、媒体がプラグの貫通孔内に
おいて血液と接触するようにした。試薬添加をシミュレ
ートするため、水溶液をゲルと接触させたが数ケ月間経
ってもゲルの特性は殆ど変化しなかった。１０ｄのガラ
ス遠心管および５０ｍのブスチック遠心管を様々な口径
の貫通孔を備えた仕切プラグと共に用意した。

こうして得られたアセンブーは貫通孔を開口した状態お
よびシキソトロビックゲルで封止した状態の双方で試験
した。層流技術を用いることなくピペットでヒトの全血
サンプルを充填時間１０秒以内に管内に注入した。直ち
に管を非冷却型テーブルトップ遠心機内に入れ、約４０
０Ｇで約３０分間遠心して平衡を得た。

１０ｍの遠心管はフィコール−パック勾配媒体をその底
部に配置し、上述の疎水性ゲル２１ｄ、を下方の媒体に
接触するように配置してこの媒体を封止した。また、い
くつかの管に対しては比重のより高いゲルも用いた□。

貫通孔未封止の管においては血液と液体媒体との間に混
合は起こらなかった。貫通孔をゲルで封ｌ二した管にお
いては遠心中にゲルが管底に下降し、媒体が貫通孔声道
って上昇して血液サンプルの下に位置したことが認めら
れた。ゲルのみを仕切として用いた管においては遠心に
よってゲルが管底に移動して液体媒体と入れ替わった。

容管においてフィコール−バック媒体はプラグ上方に透
明なカラムを形成した。単核血球は媒体の上の古典的な
位置にあることが認められた。血漿フラクションおよび
血小板は遠心管の最上部に位置していた。

次いで媒体最上部表面のリンパ球および単球を乱さない
ようにして血漿フラクションをフィコール−バック媒体
の少し上方に注意深く（ピペットで）移動させた。リン
パ球および単球を含有する媒体層を取出した後、これら
の細胞を洗浄し、等張緩衝溶液中で還元した。その侵、
固定細胞のヘマトキシリンおよびエオシン染色法を用い
る従来の方法で単核細胞含有率を測定した。これらの分
離を標準的なフィコール−バック媒体分離法と比較した
。純度、生存率、および収量に関する結果はほぼ同等で
あった。

（発明の効果）上述のように、本発明は細胞の純度および回収率を犠牲
にすることなく使用および準備時間を有意に軽減するこ
とのできるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は採血管から血液サンプルを移して用いるための
本発明の一実施態様による非吸引型リンパ球分離管ユニ
ットを示す側断面図、第２図は血液を患者から直接採取することのできる本発
明の一実施態様による吸引型リンパ球分離管ニットを示
す側断面図である。１・・・遠　　心　　管　　２・・・液体密度勾配媒体
３・・・仕切プラグ　　　　４・・・貫　　通　　孔５
・・・ゲ　　　ル　　　　６・・・試　　　　　薬７・
・・Ｍ　　　　　　　　８・・・空　　　　　間９・・
・空　　　間　　　　１０・・・採　　取　　管１１・
・・液体密度勾配媒体　１２・・・仕切プラグ１３・・
・試　　　薬　　　　１４・・・空　　　　　間１５・
・・閉鎖手段眼

Claims

【特許請求の範囲】

（１）液体密度勾配媒体を用いる遠心分離によって全血
のより重い相からリンパ球および単球を分離する能力を
容器に付与するために用いられる静止型の仕切器具であ
って、血液サンプルを前記容器に導入する際にこの血液
サンプルと前記密度勾配媒体との混合が殆ど防止される
ような直径および深さを有するが、遠心分離時には赤血
球および前記密度勾配媒体を貫通させることができるよ
うな貫通孔が設けられていることを特徴とする仕切器具
。
（２）前記容器の構成部分となっていることを特徴とす
る特許請求の範囲第１項記載の仕切器具。
（３）前記容器の内壁もしくはくびれ部分から内側に突
出するリング状隆起部材からなることを特徴とする特許
請求の範囲第２項記載の仕切部材。
（４）貫通孔を有して前記容器内壁と気密的に嵌合する
ように前記容器内に挿入することのできるプラグからな
ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の仕切器
具。
（５）前記プラグが前記容器内に挿入された後、前記貫
通孔が前記液体密度勾配媒体よりも密度の高いゲルによ
って封鎖されるようになつていることを特徴とする特許
請求の範囲第４項記載の仕切器具。
（６）前記プラグが、前記貫通孔に向かう赤血球の動き
を促進するように前記貫通孔に向かって傾斜した上部表
面を有していることを特徴とする特許請求の範囲第４項
記載の仕切器具。
（７）前記プラグが成型ポリプロピレンで形成されてお
り、その周縁に設けられたシェブロン型の封止手段によ
って前記容器内壁と密着可能に嵌合するようになってい
ることを特徴とする特許請求の範囲第４項記載の仕切器
具。
（８）前記プラグが不活性な弾性もしくは塑性材料から
形成され、その周縁に設けられた圧縮リングシールによ
って前記容器内壁と密着可能に嵌合するようになってい
ることを特徴とする特許請求の範囲第４項記載の仕切器
具。
（９）液体密度勾配媒体を用いる遠心分離によって全血
のより重い相からリンパ球および単球を分離する能力を
容器に付与するために用いられる静止型の仕切器具であ
って、前記容器内に挿入した際に圧縮によって前記容器
内壁と密着可能に嵌合するように前記容器の口径よりも
大きな直径を有する一体型の多孔性フォーム材料で形成
されたプラグからなることを特徴とする仕切器具。
（１０）前記プラグが、前記液体勾配媒体の全量を収容
することのできるような長さおよび体積の孔を有してい
ることを特徴とする特許請求の範囲第９項記載の仕切器
具。
（１１）前記プラグがウレタンフォームからなることを
特徴とする特許請求の範囲第９項記載の仕切器具。
（１２）液体密度勾配媒体を用いる遠心分離によって全
血のより重い相からリンパ球および単球を分離する能力
を容器に付与するために用いられる可動型の仕切器具で
あって、血液サンプルを前記容器に導入する際にこの血
液サンプルと前記密度勾配媒体との混合を殆ど防止し、
遠心分離時には前記容器底部に移動して前記密度勾配媒
体と入れ替わって前記密度勾配媒体を前記血液サンプル
と接触させるようになっていることを特徴とする仕切器
具。
（１３）前記液体密度勾配媒体よりも大きな比重を有す
る疎水性ゲル塊からなることを特徴とする特許請求の範
囲第１２項記載の仕切器具。
（１４）前記容器の口径よりも若干小さな直径を有する
一体型の多孔性フォーム材料で形成されたプラグからな
ることを特徴とする特許請求の範囲第１２項記載の仕切
器具。
（１５）前記プラグがウレタンフォームからなることを
特徴とする特許請求の範囲第１４項記載の仕切器具。
（１６）液体密度勾配媒体を用いる遠心分離によって全
血のより重い相からリンパ球および単球を分離する能力
を容器に付与するために用いられる可動型の仕切器具で
あって、血液サンプルを前記容器に導入する際にこの血
液サンプルと前記密度勾配媒体との混合を殆ど防止する
ようになっており、前記容器よりも若干小さな直径と前
記液体密度勾配媒体の全量を収容することのできるよう
な長さおよび体積の孔とを有する一体型の多孔性フォー
ム材料で形成されたプラグからなることを特徴とする仕
切器具。
（１７）前記プラグがウレタンフォームからなることを
特徴とする特許請求の範囲第１６項記載の仕切器具。
（１８）全血サンプルもしくはその予め処理された細胞
フラクションのより重い相からリンパ球および単球を遠
心分離するための器具であって、（ａ）開放端および閉鎖端を有する容器、（ｂ）当初は前記閉鎖端に隣接して位置する液体密度勾
配媒体、（ｃ）前記媒体表面上方に位置し、その下方の該媒体を
封止する仕切手段、および（ｄ）前記サンプルおよび必要に応じて添加される試薬
を収容するに充分な体積を有して当初は前記仕切手段に
隣接する空間からなることを特徴とする器具。
（１９）前記容器の開放端を封鎖するための閉鎖手段を
有することを特徴とする特許請求の範囲第１８項記載の
器具。
（２０）前記閉鎖手段が前記容器開放端を真空シールす
るのに適したものであることを特徴とする特許請求の範
囲第１９項記載の器具。
（２１）前記閉鎖手段が、血液サンプルを採取するのに
適した該サンプルを前記容器に供給するための針によっ
て貫通可能なものであることを特徴とする特許請求の範
囲第１９項記載の器具。
（２２）前記仕切手段の上に当初、試薬が位置すること
を特徴とする特許請求の範囲第１８項記載の器具。
（２３）前記試薬が希釈剤および抗凝血剤のうちの少な
くとも一方からなることを特徴とする特許請求の範囲第
２２項記載の器具。
（２４）前記仕切手段が前記容器の構成部分となってい
ることを特徴とする特許請求の範囲第１８項記載の器具
。
（２５）前記仕切手段が前記容器内に挿入可能なプラグ
からなり、該プラグは前記容器内に挿入した後に静止す
るようになっており、かつ前記容器内に挿入されている
間に空気を通過もしくは循環させるための手段と該プラ
グを適当な位置に配置した直後にその下方の前記媒体を
封止するための手段とを有していることを特徴とする特
許請求の範囲第１８項記載の器具。
（２６）前記プラグが挿入時に前記空気を通過させるこ
とのできるような貫通孔を有しており、該貫通孔は前記
液体密度勾配媒体よりも大きな比重を有する疎水性ゲル
によって直ちに封鎖されるようになっていることを特徴
とする特許請求の範囲第２５項記載の器具。
（２７）前記プラグが、前記貫通孔を封鎖するゲルとほ
ぼ同等の体積の空間を該プラグと前記液体密度勾配媒体
との間に残すようにして挿入されることを特徴とする特
許請求の範囲第２６項記載の器具。
（２８）前記プラグ上方に、血液成分および前記液体密
度勾配媒体に対して不活性で高密度の微粒子が乾燥状態
もしくは懸濁液で含まれていることを特徴とする特許請
求の範囲第２６項記載の器具。
（２９）前記微粒子がガラス微粒であることを特徴とす
る特許請求の範囲第２８項記載の器具。
（３０）前記封鎖を行なうための手段が棒状要素からな
り、その一端は前記プラグの貫通孔を閉鎖し、他端は前
記容器の開放端を封鎖するための閉鎖手段に接近もしく
は接触するように上方に延びていることを特徴とする特
許請求の範囲第２６項記載の器具。
（３１）前記仕切手段が遠心分離中に可動であることを
特徴とする特許請求の範囲第１８項記載の器具。
（３２）前記仕切手段が前記液体密度勾配媒体よりも大
きな比重を有する疎水性ゲルからなることを特徴とする
特許請求の範囲第３１項記載の器具。
（３３）前記仕切手段が、前記容器の口径よりも若干直
径の小さな一体型の多孔性フォーム材料で形成されたプ
ラグからなることを特徴とする特許請求の範囲第３１項
記載の器具。
（３４）前記プラグがウレタンフォームからなることを
特徴とする特許請求の範囲第３３項記載の器具。
（３５）前記仕切手段が、前記容器内に挿入した際に圧
縮によって前記容器内壁と密着可能に嵌合するように前
記容器の口径よりも大きな直径を有する一体型の多孔性
フォーム材料で形成されたプラグからなることを特徴と
する特許請求の範囲第１８項記載の器具。
（３６）前記プラグがウレタンフォームからなることを
特徴とする特許請求の範囲第３５項記載の器具。