JPS6111590B2

JPS6111590B2 -

Info

Publication number: JPS6111590B2
Application number: JP58110301A
Authority: JP
Inventors: Torie Jatsuku; Shiruban Andore; Kuroodo Gooche Jan; Toramie Berunaaru
Original assignee: NASHIONARU ERUFU AKITEENU PURODEYUKUSHION SOC
Current assignee: NASHIONARU ERUFU AKITEENU PURODEYUKUSHION SOC
Priority date: 1980-09-19
Filing date: 1983-06-21
Publication date: 1986-04-03
Also published as: JPS5786289A; JPS5966882A; BE890377A; ZA816455B; JPS5849232B2; FR2490672A1; FR2490672B1

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はミクロエマルジヨンを用いた微生物の
培養方法に関し、より詳細には熱力学的に安定
で、分散媒が疎水性媒体によつて構成されてい
る、栄養物質水溶液のミクロエマルジヨンの微生
物分野への応用、特に微生物の疎水性媒体におけ
る培養に関する。種々の微生物、特にバクテリアや菌類の培養を
利用する工業的操作は現時点において特に興味の
あることである。種々の食品工業、薬剤の製造、精製等が、かか
る操作にもとづいてなされている。最も多くの場合、微生物の培養を利用する工業
的操作は二つの段階から構成される。第一段階では当該微生物の培養が適当な栄養媒
体中で行われ、十分に多数の微生物が生育する。第二段階では、この多数の微生物が、この微生
物の作用を受けさせようとしている物質と接触状
態におかれる。かかる見地からすれば、容器中における操作は
特別な困難さがなく、予備的な培養、すなわち微
生物の増殖が場合に応じて別の容器中で、または
第２の操作がなされる容器と同一の容器中で行わ
れる。これに対して、微生物の増殖が自然界で行われ
るときには、広大な面積の土地や水中で行われ、
たとえば海洋、海岸、流水または湖水面上の炭化
水素油の微生物学的分解による除去のように微生
物の予備的な増殖には種々の困難がある。事実、当該微生物の増殖を達成するには栄養物
質、すなわちＣ、Ｎ、およびＰ、ならびに微量元
素の供給源を与えて培養する必要がある。炭素の水素化物、硝酸塩、またはアンモニア性
の塩、およびリン酸塩のような標準的な供給源が
水溶液である場合には、これら供給源は処理すべ
き広大な表面層には滞留することができず、対象
とする微生物の強力な増殖をはかることができな
い。これらの栄養物質は水中や地中に分散してしま
い、水中や地中の微生物によつて利用されてしま
う。かかる欠点を除くために、現在に至までに種々
の方法が採用されてきた。これらのうちの一つは米国特許第1959127号明
細書に開示されているように、窒素性化合物およ
び固体リン酸塩をパラフインで包んだ粒子とし、
この形状で微生物に利用されるようにしたもので
ある。この方法の変形の、米国特許第3883397号明細
書によれば、パラフインの代りに脂肪酸を親油性
被覆化合物として用いている。しかしながら、これらの方法は、微生物を微生
物が求める栄養物に直ちに到達させるものではな
い。脂肪質の被覆物質は外部の窒素およびリンの非
存在下では侵入、すなわち分解することが困難で
ある。また、バクテリアまたは菌類の作用自体がおそ
く、数週間または数ケ月を要する。他の提案された解決策は、フランス特許公開第
2172796号明細書に記載のように窒素およびリン
の供給源として非水溶性で炭化水素に可溶性の化
合物、とくにリン−アミノ−リピドを用いる方法
である。しかしながら、油に可溶性の窒素化合物は、窒
素含有量が通常極めて低く、かかる環境下では海
水中の石油系炭化水素の生物学的分解に２〜３ケ
月を要する。フランス特許公開第2230401号明細書にはアミ
ド、有機アンモニウム塩およびリン−アミノ−リ
ピドの石油系溶媒溶液を用い、この溶液を水中に
乳濁させることが示されている。得られた乳濁液は水面上の油を生物学的に分解
するために、水面に浮遊する炭化水素油上に噴霧
される。しかしこの方法は乳濁水を多量に必要とし、か
つ数週間後に結果が得られるにすぎない。本発明は水に可溶性の栄養物を疎水性有機層に
供給するための、新規な疎水性媒体中で微生物を
培養する方法を提供するものである。炭化水素でもありうるこの有機層が水面に浮遊
したり、または地面あるいは構造材料からなる支
持体上に分散したりすると、本発明によつて供給
された栄養物質は主として疎水層中にとどまり、
もしも微生物が存在すれば微生物を急速に増殖せ
しめる。本発明による疎水性媒体中で微生物を培養する
方法は、水が油中に分散したタイプのミクロエマ
ルジヨンを形成することにあり、このエマルジヨ
ンの内部相は栄養物質の水溶液であり、このエマ
ルジヨンの外部相は水と非混和性の液体であり、
このミクロエマルジヨンを分解されるべき疎水層
に添加することにある。このミクロエマルジヨンは、もしも処理される
べき媒体が微生物を含まないか、または十分な微
生物を含まないときは、適当な微生物の供給源を
含むことができる。当該分野において知られているように、ミクロ
エマルジヨンはこのエマルジヨンの形成に供され
た少なくとも一つの界面活性剤および補助剤を含
むことが理解されるべきである。従つて従来技術のように、栄養物質は固体状態
で、水と混和しうる溶媒中の溶液で、または水性
のミクロエマルジヨンで利用されるのではなく、
生物学的に分解されるべき疎水性層と混和しうる
液体中に微粒子状で分散した水溶液の形状、すな
わち、微粒子で分散した、いわゆる逆転水滴の形
状で利用される。この水滴の直径は80〜600Aの範囲であり、特
に100〜200Aである。この予期せざる形状によつて、従来の方法では
数週間または数ケ月を要した生物学的分解が数日
間で達成される。本発明によるミクロエマルジヨンにおける窒素
源としては、水溶性でかつ微生物によつて同化さ
れうる種々の化合物が用いられる。これら化合物は、たとえば硝酸、硫酸、およ
び／またはリン酸のアンモニウム塩、尿素、タン
パク質、ペプトンなどである。尿素は窒素の最も豊富な供給源であり、かつ水
に極めて可溶性なので特に好ましく、高濃度の水
溶液を得ることができる。たとえば、10〜60重量％の尿素を含む水溶液を
用いることができ、すなわち水100部あたり11〜
150部の尿素が含まれる。リンもまた通常の場合のように、すなわち、ア
ルカリ金属またはアンモニウムリン酸塩または亜
リン酸塩の水溶液として供給される。本発明の実施例によれば、リンは界面活性剤、
たとえば高級アルキルリン酸塩またはレシチンの
ような形状で与えられる。したがつて、リンの供給源およびミクロエマル
ジヨンの界面活性剤が同一分子である。微生物の培養を含む種々の工業的操作において
は、バクテリアの生育に最も好ましい値にPHを調
整することが必要である。一般に、このPHは中性の近傍であるべきであ
り、もしも媒体が酸性化されるべきときには、リ
ンの供給源としてリン酸を、またはもしも媒体が
塩基によつて中和されるべきときには窒素源とし
てアンモニアを添加することが可能である。下記するように、微生物による炭化水素のバク
テリア分解の場合には、リンの必要量は窒素のそ
れよりもいちじるしく少ない。重量で表現すれば、Ｐ／Ｎ比は0.02〜0.2の範
囲であり、好ましくは0.05〜0.15の範囲である。微生物生育の見地からすれば、もつとも好まし
いＰ／Ｎ比は0.05にできるだけ近い値である。ミ
クロエマルジヨンの外部相を形成する水と非混和
性、好ましくは油混和性の液体、または分解され
るべき疎水層が炭素源として微生物により利用さ
れるときには、ミクロエマルジヨン中に他の同化
されうる炭素化合物を加える必要はもはやない。
もしもミクロエマルジヨンの外部相および分解さ
れるべき層が微生物によつて分解されにくいとき
には、少なくとも初期には栄養溶液中に容易に利
用しうる炭素源、たとえば炭素の可溶性水素化物
を含むことが有効であり、これにより微生物の急
激な増殖の開始が可能になる。総ての培養におけるように、微量元素、とくに
Fe、Mg、Ｋなどの塩が必要であり、極く小量が
栄養物溶液中に従来のように添加される。本発明によるミクロエマルジヨンを得るために
は、界面活性を達成しうる界面活性剤が必要であ
り、当業者であるならば、該当する微生物に対し
て非毒性の種々の界面活性剤の中から適当な化合
物を選択することができる。たとえば、脂肪族アルコールの硫酸塩、スルホ
コハク酸塩、オキシエチレン系ソルビタンエステ
ル、オキシエチレン系のアルコール、酸または
油、サツカローズエステル、アミノ酸、α−アミ
ドアミノ酸、タウリン、サルコシン、ポリグリコ
ール高級アルキルリン酸塩などが用いられる。このリストは限定的ではなく、他の界面活性
剤、特に炭化水素に対して分散剤としての性質を
有するものを利用することができる。好ましく
は、使用される乳化剤の親水性−親油性のバラン
スは10〜17であり、かつ最も好ましくは11〜15で
ある。当該操作が屋外で行われる場合には、環境汚染
を防止するために界面活性剤が生物分解性でなけ
ればならない。界面活性剤と同様に、ミクロエマ
ルジヨンの形成に必要な界面活性助剤についても
広範な選択が可能である。かかる助剤は当該分野において良く知られてお
り、ここにリストアツプすることを必要としな
い。非限定的な方法において、カルバメート、ア
ミドまたはアミン塩のような窒素化合物の使用が
可能であることに注目されるべきである。ミクロエマルジヨンの粘度はアルコール、特に
C₆〜C₁₂アルコール、エーテル、またはポリオー
ル、とくにグリコールのエステルの添加によつて
著しく減少させることができる。このことは細かい操作を著しく容易にする。ミクロエマルジヨンの外部相が生物分解される
べき疎水性液体と混和可能でなければならないと
きには、この液体の性質に応じて選択することが
必要である。最も重要な実際の場合において、分解対象の液
体が石油系炭化水素によつて構成されているとき
には、油混和性の外部相はたとえば脂肪族、また
はナフテン系炭化水素、または、いわゆる鉱物
油、すなわちかかる炭化水素の混合物によつて構
成される。このタイプの外部相はバクテリアによ
つて侵されにくく、十分な適用性に乏しい。従つて、植物性または動物性油の使用が好まし
く、これら油は微生物により利用可能であるので
炭素源としても用いられる。これら油、好ましく
はこれらの相当する脂肪酸は疎水性層、特に原油
の分解に必要な微生物の急速な増殖を可能にす
る。ミクロエマルジヨンの外部相である油混和性液
体と、分散されるべき水溶液の重量比は通常では
0.2以上であるべきである。この比率は選択され
その結果、水溶液が内部相を形成する。界面活性剤および界面活性助剤の選択は油混和
性液体の性質によつて、および水溶液に溶解した
塩の性質に依存してなされる。この選択の基礎は
それ自体知られている微生物の組織化の概念であ
る。本発明の方法は多数の微生物、特に炭化水素を
分解しうる微生物に適用可能である。すなわち本
発明はプシユードモナス（Pseudomonas）、アシ
ネトバクタ（Acinetobacter）、フラボバクテリウ
ム（Flavobacterium）、アルトロバクタ
（Artrobacter）、またはコリネバクテリウム
（Corynebacterium）などのようなバクテリアの
利用に適用できる。微生物は、また菌類であつて
も良い。本発明は屋外で行われる生物学的分解の種々の
操作にとつて極めて興味があるが、また工程中の
物質の疎水性層が用いられる限り、容器中の種々
の製造操作に用いることができる。たとえば、バクテリアおよび／または菌類によ
る炭化水素の生物学的分解による炭化水素からの
タンパク質の製造に有利に用いられる。すべての場合において、疎水性層内への水溶性
栄養物の著しい分散が本発明によつて達成され、
微生物の極めて迅速な増殖がなされる。この結果、これらの操作において時間が著しく
短縮される。屋外の水域または地域への適用の中で最も重要
なものは事故によつて分散された炭化水素の生物
学的分解である。上記した理由によつて、水溶性の栄養物質が水
に同伴されるかわりに、処理された層中に留まる
ことは事実であり、本発明は海洋汚染の排除に大
きな価値を有する。また同様な趣旨により浅瀬、貯水槽、地面、容
器などを、これらを汚染する炭化水素堆積物から
清浄化するような操作に適用できる。他の用途としては、栄養物の農業生産物への分
布をふくむ。微生物は通常では処理されるべき媒体中に存在
する。しかしながら、初期の微生物固体数が極め
て低いと判断されるか、または媒体が適当なバク
テリアを含まないときには、時として微生物の接
種が必要である。本発明の実施例においては、窒素性栄養物とし
て尿素が用いられる。この尿素は、界面活性助剤
の役目をはたすことも見出されており従つて他の
界面活性助剤を添加することはもはや必要がな
い。一方、リン酸のアルキルエステルによつて、リ
ンが有利に与えられるが、この化合物は界面活性
剤の作用も与えるので、栄養物質溶液の組成は他
の添加物を用いず、尿素およびリン酸エステルを
用いることができる事実によつて単純化される。
ミクロエマルジヨンの粘度を低下しうる液体の添
加も推賞できる。かかる添加物の種々の例は、すでに述べたとお
りである。本発明の他の実施例においては、エチ
レングリコールのブチルエーテルが優れた結果を
与える。ミクロエマルジヨンの外部相として特に好適な
油混和性液体は、本発明によればラウリン酸、ミ
リステン酸、パルミチン酸、アラキン酸、レイン
酸、ステアリン酸、カプロン酸およびカプリル酸
などのような脂肪酸の一種または複数種のエステ
ルによつて構成される。かかる酸のグリセリドは植物および動物油であ
り、極めて容易に入手可能な工業生産物である。
従つて、アラキン酸、鯨油、菜種油、亜麻仁油、
とうもろこし油、オリーブ油、ゴマ油、およびト
ール油などが用いられる。脂肪酸自体は液体を周辺温度に保持するために
適当な混合物として要求されることが特に好適で
ある。従つて、たとえばカプロン酸、エナンシル
酸、カプリル酸、ラウリル酸、パルミチン酸、オ
レイン酸、リノール酸またはステアリン酸などの
ようなC₆〜C₁₈の脂肪酸を含む脂肪酸類が特に有
用である。常温では液体でない脂肪酸には、炭化水素、た
きえば石油、ガス油を約５％〜50％の割合で添加
することが好適である。脂肪族アルコールすなわ
ちC₆〜C₂₄のアルコールも同様に好適である。水溶液が尿素および、たとえばヘキスト
（Hoechst）社からホスタフアート（Hostaphat）
の商品名で市販されたリン酸ラウリルおよび／ま
たはリン酸オレイルを含む場合には、全ミクロエ
マルジヨン中の好ましい窒素含有量は約４〜10重
量％であり、または最も好ましくは５〜８重量％
である。油混和性液体中の窒素重量比は一般には
0.1〜0.4で、好ましくは0.15〜0.35である。一般的な方法では、本発明における好ましいミ
クロエマルジヨンは10〜30重量％の水、４〜10重
量％の窒素系化合物の形としての同化性窒素、５
〜35重量％のC₁₀〜C₁₈リン酸アルキルまたはエト
キシ化されたフエノールアルキルホスフエート、
０〜20重量％のアルキレングリコールのアルキル
エーテル、および20〜50重量％の脂肪族エステ
ル、酸および／またはアルコールを含む。窒素系化合物は石油またはその誘導体のような
液体炭化水素を、たとえば５〜70重量％で含むこ
とができる。本発明の変形においては、微生物の極めて急激
な作用が得られる改良をふくむ。このことは、この目的のために極めて多量の微
生物を用いることによつて極めて短時間で炭化水
素の生物学的分解を可能にする。最適の栄養物は
尿素であるが、通常では海水中に存在して炭化水
素を生物学的に分解できる一部の微生物が増殖せ
ず、従つて目的とする生物学的分解に寄与しない
ことが見出された。本発明の変形によればこの不
活性（inactive）のままで残る一部の微生物は、
もしも窒素系栄養物質が第１の栄養物質とは実質
的に異なる化学的組成の一種またはそれ以上の窒
素系物質を併用することによつて増殖せしめら
れ、炭化水素の生物学的分解に寄与せしめられ
る。第１の栄養物質が尿素であり、第２の栄養物質
が一種またはそれ以上のアミノ酸で構成されると
きに、とりわけ好ましい結果が得られる。すなわち、炭化水素系物質の微生物学的分解を
目的とする本発明によるミクロエマルジヨンは、
好ましくは化学的観点から実質的に異なる少なく
とも２種類の窒素系化合物の水溶液を含む。すなわち、たとえば、もしも第１の栄養物質が
硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウムまたは硝
酸アンモニウムのような塩であれば、第２の栄養
物質がアミン、アミド、タンパク質、アミノ酸、
または他の非アンモニア系化合物によつて構成さ
れる。栄養物質溶液が尿素を含むときには、第２
の窒素系化合物は、たとえば硫酸アンモニウム、
リン酸アンモニウム、または硝酸アンモニウム、
またはアミノリピドであり、特にアミノ酸であ
る。２種類の窒素系化合物の相対比率は、本発明の
方法が適用される媒体の微生物学的特性に応じて
著るしく変化する。尿素の効果的な比率は窒素で
表すと、全窒素の50〜99％であり、アミノ酸の窒
素は50〜１％である。ある種の水性媒体においては、すぐれた結果を
得るためには、第２の窒素系化合物は約１〜10％
の窒素で十分である。本発明によつて有利に用いられるアミノ酸は自
然界に発見された総てのアミノ酸および合成アミ
ノ酸から選択できる。非限定的例として示せば、
グリシン、アラニン、セリン、システイン、バリ
ン、グルタミン、ロイシン、リジン、アルギニ
ン、プロリン、チロシン、アスパラギン酸および
グルタミン酸などが用いられる。経済的理由から、一連の数種のアミノ酸を通常
含む天然産物から得られる物質を利用するのが有
利である。これは、たとえば砂糖大根から得られ
るワイン、種々の植物のパルプ化によつて得られ
た抽出物、特に玉蜀黍抽出物、酵母抽出物、タン
パク質の加水分解物、酪農副産物などである。本発明によれば、もしも窒素系栄養物質単独で
良好な結果を与えるならば、そして異なる化学的
性質を有する他の窒素系物質を単独で用いたとき
にも同様な結果が得られるならば、二つの物質が
併用されて同化性窒素の全濃度が同一であれば、
炭化水素の微生物による生分解がより良好である
という予期せざる結論を与える。従つて、本発明によるミクロエマルジヨンは、
たとえば海水面に分布された原油の80％以上の生
分解を、栄養物質溶液が尿素またはアミノ産を含
むときは７日間で可能にする。しかしながら、もしも尿素およびアミノ酸が溶
液中に共存し、その全窒素濃度が尿素またはアミ
ノ酸を単独で含む場合と同一であれば、同一の結
果が６日間で得られる。本発明を下記するような一連の非限定的実施例
にもとづき説明する。実施例１〜11 これらそれぞれの試験のために、尿素の50重量
％水溶液の或容積をヘキスト（Hoechst）社から
ホスタフアート（Hostaphat）の商品名で市販さ
れているC₁₂〜C₁₈脂肪族アルコールのリン酸エス
テル混合物により構成された界面活性剤の或量の
存在下に、オレイン酸の或量と混合した。ある試験においては、エチレングリコールのブ
チルエーテルを粘度低下のために添加した。得られたミクロエマルシジヨンの組成、このエ
マルジヨンの安定範囲、およびこれらの粘度をし
めす。実施例４、５、６、８、10および11から、
０℃から40℃以上の範囲において優れた安定性が
得られることが明らかである。粘度については、エチレングリコールのブチル
エーテルの添加なしで極めて粘度が高い（実施例
１および２）ことが見出された。これに対して、
このエーテルの添加によつて極めて許容しうる値
に低下する（実施例３〜11）。

【表】

【表】実施例 12〜16 33％のリン酸ラウリルを用いてミクロエマルジ
ヨンを製造した。油混和性液体はオレイン酸であ
り、尿素およびリン酸塩の水溶液の２倍量に等し
い量であつた。水相における尿素の％を変化させ
た。下記の温度はミクロエマルジヨンがなお安定
である最高温度を示す。

【表】

【表】この結果は実際に実効可能で約36℃まで安定な
ミクロエマルジヨンが50％までの範囲の尿素濃度
において得られ、これ以上の尿素濃度では得られ
ないことを示すものである。実施例 17〜19 尿素の50％溶液を用い、エチレングリコールの
モノエチルエーテルの30％を含むリン酸オレイル
を添加して種々の比率のオレイン酸を含む三種の
ミクロエマルジヨンを製造した。これらエマルジヨンの安定範囲は下記のとおり
である。

【表】この結果から約0.65の水溶液／オレイン酸比率
以上および30％の固定された量のエチレングリコ
ールモノエチルエーテルではミルロエマルジヨン
はゲル化の傾向があるので使用が困難である。こ
れに対して、この比率以下では優れた安定性が確
立される。実施例 20 石油系炭化水素の生分解 120℃で２時間、殺菌した30の海水を50の
発酵器に導入した。この海水の水面に75％の飽和
炭化水素と25％の芳香族を含む34゜APIの原油の
30mlを分散した。石油層の厚みは0.5mmであつ
た。この石油層に前述した実施例の一つのミクロエ
マルジヨンの６mlを噴霧した。この媒体に海水から導かれた微生物源を接種し
た。これら微生物源はグロコース水溶液で24時間
培養して得られたものであり、主としてプシユー
ドモナス（Pseudomonas）を含む。この接種の後に、石油試料中の微生物を分析し
た。mlあたり2.5×10³〜４×10⁴の微生物が見出
された。１分あたり400回転する撹拌機で発酵器
の内容物を撹拌し、１時間あたり120の殺菌し
た空気を吹き込みながら好気性培養を行なつた。
この空気吹き込みは海で自然に起る量に実質的に
相当する。40寺間後、更に分析を行なつた。結果
を下記表に示す。７日後、石油の生分解率を残留
する炭化水素を四塩化炭素で抽出し、赤外スペク
トル測定により求めた。前記実施例１、２、３、10および11のミクロエ
マルジヨンについて得られた結果を下記第２表に
示す。

【表】実施例 21 実施例20に記した操作法に従つて実験を行なつ
た。しかし、殺菌しない海水を発酵器中に入れ、
バクテリアの追加接種を行なわなかつた。結果を
下記に示す。

【表】実施例 22 実施例20の操作法に従つて実験を行なつた。しかしながら、海水のかわりに海水中の種々の
鉱物成分、すなわち30ppmの微量元素、特に
鉄、マグネシウムおよびカリウムを添加した天然
水を用いた。実施例11の６mlのエマルジヨンを噴
霧し培養したバクテリアを接種した。７日後に残留する炭化水素を四塩化炭素で抽出
し、赤外スペクトルの測定によつて石油の生分解
率を測定した。生分解率は90％であつた。実施例 23〜24 海岸において、深さ２ｍ、それぞれが３ｍ×３
ｍの水平面を有する四つの部屋に区分された容器
中でアラビヤ原油の生分解を行なつた。各部屋は分離または相互に連結することがで
き、かつすべて海水を収容することができる。ハイドロエゼクタポンプによつて水のゆるやか
な撹拌と、容器中の空気の更新を行なつた。各部屋に15.6m³の海水と上記石油の４とを導
入し、水面上に0.45mm厚さの層を形成した。部屋の一つをコントロールに用いた。すなわち、この部屋の海水および石油は他の部
屋と同様に撹拌したが、何の添加もしなかつた。
試験の末期に本発明による添加物によつてもたら
された生分解の評価を考慮に入れるために、自然
の微生物源による石油の損失を測定した。他の三
つの部屋それぞれについて、下記重量％組成の栄
養物溶液のミクロエマルジヨンの0.4を導入し
た。尿素……17.0 清浄水……20.8 ブチルグリコール……10.8 リン酸ラウリル……21.1 オレイン酸……30.3 試験開始時の、タンク中の海水中のバクテリア
数はmlあたり10²であつた。７日後に各部屋から
消滅した石油量を測定した。下記第３表は二つの
異なる温度における初期石油量の消失率を示すも
のである。

【表】上記第３表から明らかなよううに、比較的低温
の12℃においても本発明の処理によつて７日後に
得られた生分解は顕著である。微生物培養源を利
用しない従来のほとんどすべての方法に対して、
上記結果は海水中に存在する微生物だけを利用し
て得られたものである。実施例 25 30mlの海水を50mlの発酵器中に導入した。この海水の水面に75％の飽和炭化水素および25
％の芳香族を含む34゜API原油の30mlを分散させ
た。このようにして形成させた0.5mmの厚みを有
する石油層に下記のような重量組成を有する６ml
のミクロエマルジヨンを噴霧した。

【表】

【表】石油中のバクテリアの分析結果では、mlあたり
10²のバクテリアが存在した。１分あたり400回転
する撹拌器で発酵器の内容物を撹拌し、１時間あ
たり120の殺菌空気を吹き込みながら好気性培
養を行なつた。この空気吹き込みは海で自然に起
る量に実質的に相当する。 48時間後に、新らたな分析を行なつた。この結果、mlあたり2.5×10⁸のバクテリアの存
在が示された。７日後、残留炭化水素を四塩化炭
素で抽出し、赤外スペクトルの測定によつて石油
の生分解率をもとめた。この分解率は83％であつた。実施例 26 実施例25と同一の操作を行なつた。ただし、ミ
クロエマルジヨン中の尿素の一部をアミノ酸の
DL−バリンで置換した。ミクロエマルジヨンの
重量組成は下記のとおりである。

【表】バクテリア分析の結果、開始時のバクテリア数
は10²であり、48時間後は10⁹であつた。石油の生分解率は、６日後で約84％であつた。実施例25との比較から、アミノ酸の添加によつ
て尿素単独の場合の48時間後のバクテリア数2.5
×10⁸の代りに10⁹のバクテリア数が得られること
が明らかである。生分解率は実施例５の83％と同
一程度（84％）であつたが、実施例25よりはより
速い６日で得られ、一方、尿素単独の実施例25で
は７日間を必要とした。実施例 27 実施例25および26の操作にしたがい、かつ尿素
の一部を一連のアミノ酸、主としてアラニン、ア
ルギニン、グルタミン酸およびロイシンを含む玉
蜀黍抽出水溶液にかえたミクロエマルジヨンを用
いた。より小量含まれる他のアミノ酸はプロリ
ン、イソロイシン、スレオニン、バリン、フエニ
ルアラニン、メチオニンおよひびシスチンであ
る。この抽出物中の全窒素含有量は１％であつ
た。ミクロエマルジヨンは下記重量組成を有す
る。

【表】水層の水は、玉蜀黍抽出物の水であつた。水相
の全窒素含有量は６％であつた。開始時のバクテ
リア数は10²であり、48時間後には４×10⁹とな
り、６日後に石油の生分解率は88％に達した。こ
れらの結果と実施例25の比較から尿素へのアミノ
酸添加の望ましいことが明らかである。実施例 28〜37 実施例27に類似するこの一連の試験では、リン
酸ラウリルをリン酸オレイルに代え、かつオレイ
ン酸を下記き表に示すような種々の液体に代え
て、６日後の石油の生分解率を測定した。

【表】

【表】たガス油
リン酸オレイルの代りに、ホスタフアート
（Hostaphat）KL340Nの商標名で市販されてい
る、C₁₂〜C₁₄アルキルモノ、ジ、およびトリ（ア
ルキルテトラグリコールエーテル）−Ｏ−ホスフ
エートの混合物を用いて類似した結果が得られ
た。

Claims

【特許請求の範囲】１疎水性媒体中で微生物を培養する方法におい
て、水とは非混和性であるが前記疎水性媒体とは
混和性の液体中に栄養物質の水溶液をミクロエマ
ルジヨンとなし、この形成されたミクロエマルジ
ヨンを、培養すべき微生物源を含む媒体中に導入
することを特徴とする水溶液中の栄養物質を用い
て疎水性媒体中で微生物を培養する方法。２栄養物質の水溶液が窒素の水溶性化合物およ
びリンの水溶性化合物を含み、水とは非混和性の
液体が前記微生物によつて同化しうる炭素の化合
物から選択された油混和性液体である特許請求の
範囲第１項記載の疎水性媒体中で微生物を培養す
る方法。３ミクロエマルジヨンの内部相を形成する水溶
液が前記微生物によつて同化可能の二つの化学的
に異なる種類の窒素化合物を含む特許請求の範囲
第１項または第２項記載の疎水性媒体中で微生物
を培養する方法。４ミクロエマルジヨンの内部相を形成する水溶
液が尿素とリン酸アルキルまたはリン酸アルケニ
ルを含み、一方、外部相が脂肪酸エステル、脂肪
酸および／またはアルコールの一種または二種以
上によつて構成されている特許請求の範囲第１項
ないし第３項のいづれかに記載の疎水性媒体中で
微生物を培養する方法。５ミクロエマルジヨンの内部相を形成する水溶
液が11〜150重量部の尿素と100重量部の水を含む
特許請求の範囲第１項ないし第４項のいづれかに
記載の疎水性媒体中で微生物を培養する方法。６尿素の水溶液が一種または二種以上のアミノ
酸を含む特許請求の範囲第４項または第５項記載
の疎水性媒体中で微生物を培養する方法。７アミノ酸の比率が99〜90重量部の尿素あたり
１〜10重量部である特許請求の範囲第６項記載の
疎水性媒体中で微生物を培養する方法。８疎水性媒体が水面または地面をおおう炭化水
素によつて構成され、培養された微生物が該炭化
水素を生分解しうる特許請求の範囲第１項ないし
第７項のいづれかに記載の疎水性媒体中で微生物
を培養する方法。９ミクロエマルジヨンが10〜30重量％の水、窒
素化合物の形状の４〜10重量％の同化性の窒素、
５〜35重量％のリン酸C₁₀〜C₁₈アルキルまたはア
ルケニルまたはエトキシ化されたフエノールアル
キルホスフエート、０〜20重量％のアルキレング
リコールアルキルエーテル、および20〜50重量％
の脂肪酸エステル、脂肪酸および／または脂肪族
アルコールを含む特許請求の範囲第１項ないし第
８項のいづれかに記載の疎水性媒体中で微生物を
培養する方法。