JPS6110537A - 二官能性化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は下記一般式（１）であられされる（２−ニトロ
ビニル）安息香酸誘導体に関する。

〔式中−〇−Ｚはカルボキシル基の反応性誘導体をあられす。〕

上記一般式〔１〕であられされる（２−ニトロビニル）
安息香酸誘導体は、チオール基を有する物質とアミ７基
を有する物質の結合に利用される二官能性配位子化合物
として有用である。

近年、二種類の異なった物質を結合することにより得ら
れる有用な結合体が知られている。そのような結合体と
しては、たとえば免疫学的測定分野においては、（イ）
ハプテンと呼ばれる低分子物質の抗体を得るための、ハ
プテンとアルブミン、グロブリンの様な高分子物質との
結合体、（０）エンザイムイムノアッセイのための、ハ
プテンや蛋白質の様な抗原性物質又は抗体と酵素との結
合体、ｅ→免疫学的測定を簡易１こ行なうための、固体
と抗原性物質もしくは抗体との結合体などが知られてい
る。また、主として癌治療薬をめざした毒素の７ラグメ
ントと抗体との結合体、さらには固定化酵素を目的とし
た酵素と固征との結合体等が知られている。

従来、これらの結合体を得るため、架橋剤としてグルタ
ルアルデヒドやトルエン−２゜４−ジイソシアネート、
カルボジイミド誘導体等が用いられて来たが、同−物質
内、同一物質間の結合体や凝集体が生じる問題があり、
最近ではこれらの問題を解決するため二官能性架橋剤が
開発されている。二官能性架橋剤とは一分子中に二種類
の基と反応できる官能基を有する架橋剤であって、一般
的にはチオール基と反応するマレイミド基、ピリジルチ
オ基またはヨードアセチル基と、アミノ基と反応するＮ
−ヒドロキシサクシンイミドのエステル基またはイミダ
ゾール基を有する二官能性架橋剤が用いられている。

これら既知の二官能性架橋剤は、最初にアミノ基を有す
る物質と反応せしめ、この後チオール基を有する物質と
反応せしめるのに適した架橋剤である。このような従来
の二官能性架橋剤を用いて、たとえばペプチドと酵素と
の結合体を得る操作は下記の方法となる。

ペプチドのアミノ基と二官能性架橋剤とを反応せしゆ精
製することによりペプチド誘導体を得、一方、酵素にそ
のアミノ基を利用して、後述するチオール基導入試薬を
用いてチオール基を導入することにより酵素誘導体を得
る。このようにして得られるペプチド誘導体と酵素誘導
体を反応せしめることによりペプチドと酵素との結合体
を得ることができる。

しかしながら、このような従来法では酵素を誘導体に導
く必要があるので、酵素が不安定な場合には墾ましくな
い。

これに対して、チオール基と反応した後、アミノ基と反
応できる二官能性架橋剤においては、安定なペプチドの
アミノ基を用いてチオール基導入試薬によりペプチドに
チオール基を導入後、二官能性架橋剤と反応、精製し、
この後直接酵素と反応せしめる事によって結合体を得る
事が出来る。

本発明者らは、一般式（１）であられされる（２−ニト
ロビニル）安息香酸誘導体が、チオール基を有ｒる物質
とアミノ基を有する物質との結合体を得る事ができ、し
かもチオール基を有する物質と反応後、アミ７基を有す
る物質と反応させ得る事ができる二官能性架橋剤として
有用な化合物である事を見い出し本発明にいたった。

一般式（”１）における−〇−Ｚはペプチド合成の分野
でペプチド結合を形成するために通常用いられるカルボ
キシル基の反応性誘導体であり、Ｚとしては例えば２，
４−ジニトロチアゾリジン−２−チオン−３−イル基れ
るが、２，４−ジニトロフェノキシ基、Ｎ−ヒドロキシ
サクシンイミド残基が望ましい。

一般式（１）であられされる（２−ニトロビニル）安息
香酸誘導体は、メタまたはバラ置携体が反応性が良く望
ましい。

本発明の（２−ニトロビニル）安息香酸誘導体を二官能
性架橋剤として用いて結合しうる物質としては、例えば
ペプチド、ステロイド、薬物の様なハプテンもしくは蛋
白質からなる抗原、ハプテンの抗体を得るための蛋白質
、合成高分子からなるキャリヤー高分子、抗体、酵素、
殺細胞物質、有機もしくは無機の固体などがあげられる
。

チオール基を有する物質とは、−分子中または固体表面
上に一以上のチオール基を有する上記の物質あるいは上
記の物質にチオール基を導入した誘導体を言う。チオー
ル基を有する物質としてはメルカプトアルブミン、免疫
グロブリンを還元処理して得られる一量体もしくはＦ（
ａｂ’）２　　を還元処理して得られるＦａｂ’、ジフ
テリア毒素、リシンＡの７ラグメントなどがあげられる
。

またチオール基を導入した誘導体は、アミツノ占を有す
る物質からチオール基導入剤を用いて容易に誘導される
。チオール基導入剤としてはアセチルメルカプトコハク
酸等すでに多くの試薬が知られているが、本発明者等の
創製したｐ−メトキシベンジルチオプロピオン酸誘導体
等がある。

アミノ基を有する物質とは、−分子中又は固体表面に一
以上のアミノ基を有する上記の物質あるいは上記の物質
の誘導体を言う。アミノ基を有する物質としてはヒト成
長ホルモン放出因子（ｈＧＲＦ）の様なペプチド；α−
フェトプロティン（ＡＦＰ）、カルシノエンボリティク
アンチゲン（ＣＥＡ）、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨＬの
様な蛋白質あるいは糖蛋白質からなる抗原；アルブミン
、ポリ、［、−＋）ジンの様なキャリヤ高分子；抗体蓚
ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ豐の様な酵
素；アミノ化がラス：ナイロンの加水分解で得られる固
体などがある。

一般式（１）であられされる（２−ニトロビニル）安息
香酸誘導体は対応する（２−ニトロビニル）安息香酸か
ら製造することができる。

（２−ニトロビニル）安息香酸は公知の化合物であり、
たとえばｐ−（２−二トロビニル）安息香酸はｐ−ホル
ミル安息香酸とニトロメタンの反応によって得ることが
出来る。

ｐ−（２−ニトロビニル）安息香酸を通常のカルボキシ
ル基の反応性誘導体を得る方法、たとえばテトラヒドロ
フラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド
等の溶媒中でジシクロへキシルカルボジイミドの様な脱
水剤の存在下、２．４−ジニトロフェノール、杢 Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド、チアゾリン−２−チオ
ン等の誘導剤と反応せしめる事によって本発明のｐ−（
２−ニトロビニル）安息香酸誘導体を得ることができる
。

０−またはｍ−（２−ニトロビニル）安息香酸誘導体も
同様の方法で得ることができる。

反応後は、例えば反応溶液を濃縮し、エタノール等を加
えて粉末を析出させ、口過微粉末をクロロホルム−メタ
ノール、酢酸エチル等の良溶媒に溶解し、エタノール等
の貧溶媒を加えて再結晶を行うことにより精製すること
ができる。

かくして得られた一般式（１）であられされる（２−ニ
トロビニツノ安息香酸誘導体を用いて、チオール基を有
する物質とアミノ基を有する物質との結合を行う望まし
い実施方法は以下の通りである。

（１）中性乃至酸性条件下で（２−ニトロビニダル）安
息香酸誘導体とチオール基を有する物質とを反応せしめ
る。

（２）上記（１）の反応後、中性乃至塩基性条件下でア
ミノ基を有する物質と反応せしめる。

＋１）の反応は、水もしくは緩衝液、ジメチルホルムア
ミド、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド又は
これらの混合溶媒中で行なう、。反応温度は０〜５０℃
、反応時間は反応条件、スケールによるが通常１分〜４
８時間である。

中性乃至酸性条件とはｐ　Ｈ７，０以下望ましくはｐＨ
２〜５であり、この条件ではカルボキシル基の反応性誘
導体が加水分解されることなく反応を行なうことが可能
である。

反応終了後は、たとえば、溶媒を留去後適当な溶剤での
洗浄、ゲル沖過、透析等により精製を行う。

（２）の反応は、（１）の生成物とアミノ基を有する物
質とを水、もしくは緩衝液、ジメチルホルムアミド、テ
トラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド又はこれらの
混合溶媒中で反応せしめることにより行う。反応温度は
０〜５０℃、反応時間は反応スケール、反応条件による
が通常２日以内である。

中性乃至塩基性条件とはｐＨ７，Ｑ以上、望ましくはｐ
　Ｈ７，５〜９、又はＮ−メチルモルホリンの共存下で
行う。

反応終了後、精製を行う事により、チオール基を有する
物質とアミノ基を有する物質の結合体を得ることができ
る。

以下実施例および参考例で本説明を説明する。

参考例−ｘｔ　　５−（Ｓ−ｐ−メトキシベンジルチオ
プロビオニル）−チアゾ リジン−２−チオン（ＭｒＰＴＴ） の合成 ８００■の５−ｐ−メトキシベンジルチオプロピオン酸
を５１のＴＨＦに溶解した溶液に１ｒｏｔｔｑのチアゾ
リジン−２−チオンを加え次いでａｏｏｍｑのジシクロ
へキシルカルボジイミドを加えた。室温で１０時間反応
後、反応液を沖過し、加液を濃縮して１．６Ｘ８０ｃｒ
ｎのシリカゲルカラムでクロロホルムを溶出液として精
製した。エバポレーターで溶媒を留去後残渣をクロロホ
ルム−ｎ−へキサンの系で再結晶を行った。

収量２８１）ｖ、収率６５％、融点３９−４０℃ また赤外吸収スペクトルグラムは１６９０ｃｆｎ’（−
Ｃ＝Ｏ）に予期される特性吸収を示した。

ＮＭＲスペクトル分析の結果は次のとおりであった。

ＮＭＲ（ＣＤＣｅｓ　）　　δ ２．７５　８．５０（２Ｈ，ｔ、Ｊ＝６．８Ｈｚ）８．
７０　　（２Ｈ，ｓ） ３．７９　　（３Ｈ，ｓ） ４．５５．１．２７（２Ｈ，ｔ、Ｊ＝７．６Ｈｚ）　　
１６．８４（２）（、ｄ、Ｊ＝８．４Ｈ２）７．２３（
２Ｈ，ｄ、Ｊ＝８．４１（Ｚ）元素分析の結果は次のと
おりであった。

元素分析結果（財） ＨＮ 実測値　　５１．２０　　５．１）　　４．８４計算値
　　５１Ｊ４　　５．２８　　４．２８（ＣＸ４Ｈ１７
ＮＯ２Ｓ、として） 参考例２　　ｈＧＲＦへのチオール基の導入合成ヒト成
長ホルモン放出因子（ｈＧＲＦ−４０）５．６ｍｇと参
加例１で合成されたＭＴＰＴＴ　１０　ｒｎｇを１．５
　ｄのＤＭＦに溶解し室温で４時間反応せしめた。この
とき反応液の色は淡黄色から無色に変化した。

エーテルを加えて粉末を析出せしめ沖過後粉末をＩＭＩ
−リフルオロメタンスルホン酸−チオアニゾールのトリ
フルオロ酢酸液２００μｇに溶解し、ｍ−クレゾールｌ
Ｏμｅを加えて水冷下６０分間反応した。反応後エーテ
ルを加えて粉末を析出せしめ再び同一条件で反応を行っ
た。反応後反応液を用いてエルマン反応を行ったところ
４１２ｎｍでの吸光が認められチオール基が導入された
事が確認された。

実施例ＩＮ−サクシンイミジル−ｐ−（２−二トロビニ
ル）−ベンゾエート の合成 ｐ−（２−ニトロビニル）安息香酸１．０１とＮ−ハイ
ドロキシサクシンイミド０．６６２を１０ｗｌ１のＴＨ
Ｆに溶解した。この溶液にジシクロへキシルカルボジイ
ミド１．１８ｙを水冷下加え室温にて５時間攪拌を行っ
た。

反応後洲過しｐ液をエバポレーターにて１）／Ｎ縮しエ
タノールを加え結晶を析出させた。

この結晶をクロロホルム−メタノール（ｌＯ：ｌ）に溶
解しエタノールを加えることにより結晶を析出させた。

この再結晶操作を２回行、った。収量０．４９ｆ、収率
８３％（−Ｃ＝Ｃ−）　　に予期される特性吸収を示し
た。

Ｎ　Ｍ　、Ｆ＜スペクトル分析の結果は次のとおりであ
った。

ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ、　　中　）　　　δ２．９２（
４Ｈ，Ｓ） ８．１ｉ１）（２Ｈ，ｄ、Ｊ＝８Ｈｚ）８．１９（２Ｈ
，ｄ、Ｊ＝８Ｈｚ） ８．２５（ＬＨ，ｄ、Ｊ＝１８Ｈｚ） ８．８９（ＩＨ，ｄ、Ｊ＝１３Ｈｚ） 元素分析の結果は次のとおりであった。

元素分析結果（％） ＣＨＮ 実測値　　５８．８７　　８．４４　　９．５６計算値
　　５８．８０　　　Ｂ、４７　　９．６５（Ｃ１３Ｈ
ＩＯＮ２０６として） 実施例２　Ｎ−サクシンイミジル−ｍ−（２−二トロビ
ニル）−ベンゾエート の合成 ｍ−（２−ニトロビニル）−安息香酸を用いて実施例１
と同様に反応、結晶の析出を行ない、得られた結晶を酢
酸エチルに溶解してエタノールで再結晶を行った。収率
８３％。融点２０７−２０９℃ また赤外吸収スペクトル分析ムは１７９（ｈ＋−１およ
び１７２０ｃｍ　　（ＣＯ、Ｃ０ＯＲ）　１６　ｆ３０
ｃｍ　’（−Ｃ＝Ｃ−）　　に予期される吸収が得られ
た。

Ｎ　Ｍ　Ｒスペクトル分析の結果は次のとおりであった
。

ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ ２．９８（４Ｈ，Ｓ） ７、’１７−８．５７（４Ｈ，ｍ） ８．２９（ＩＨ＊ｄ、Ｊ＝１８．８Ｈｚ）８．８９（Ｉ
Ｈ，ｄ、Ｊ＝１８．８Ｈｚ）元素分析の結果は次のとお
りであった。

元素分析結果（％） ＣＨＮ 実測値　　５４，０５　　８．５５　　９．４１計算値
　　５１８０　　８．４７　　９．６５（Ｃ１３Ｈ１゜
Ｎ２０６として） 実施例３　２．４−ジニトロフェニル−ｐ−（２−ニト
ロビニル）−ベンジェ ートの合成 ｐ−（２−ニトロビニル）安息香酸５００■と２，４−
ジニトロフェノール５２４ｑを１５＊ｔのＤＭＦに溶解
した。この溶液にジシクロへキシルカルボジイミド８０
１ｒＮｉを水冷下加え室温で５時間攪拌した後反応液を
漏湯し、漏液をエバポレーターにて濃縮しエタノールを
加え粉末を析出させた。

粉末をＤＭＦ−クロロホルムの系で再結晶した。

収量６２５η　収率６７％　融点２１２−２１８℃ 元素分析の結果は次のとおりであった。

元素分析結果（％） ＨＮ 実測値　　５０．４Ｂ　　　２．５４　　１）．６９計
算値　　５０．１５　　２．５８　　１）．７０（Ｃ，
ＩＩＨ，Ｎ３０８として） 参考例８ ■　実施例１で得られたＮ−サクシンイミジルーｐ−（
２−ニトロビニル）−ベンゾエート５００■を５　ｍｌ
のＴＨＦに溶解しこの溶液と２２５μ４のメルカプトプ
ロピオン酸を２　ｔｓｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
８，０）に溶解した水溶液とを混合して室温で８０分間
攪拌した。反応液をＴＬＣで分析したところＮ−サクシ
ンイミジルーｐ−（２−ニトロビニル）−ベンゾエート
は消失していた。有機層を分離し水で洗浄後濃縮した。

濃縮液にエタノールを加えて粉末を析出せしめた。得ら
れた粉末をＴＨ＋−エタノールの系で再結晶した。

収量５６８Ｎ！、収率８２％　融点１５１Ｌ５４Ｃ ＮＭＲスペクトル分析の結果は次のとおりであった。

ＮＭＲ（ｐＭｓＯ−δ６）δ ２．６５−２．７８（４Ｈ，ｍ） ２．９０　（４Ｈ、Ｓ） ４．８５　（ｌＨ＝　Ｑ　、Ｊｔ＝９Ｈｚ　）５．２０
（ＬＨｌｑ、Ｊｔ　＝１４Ｈ２，Ｊ２＝７Ｈ２）５．２
９（ＩＨ，ｑ、Ｊ１＝１４Ｈｚ、Ｊ、＝９Ｈｚ）７．７
６（２）Ｉ、ｄ、Ｊ＝８．８Ｈ７）８．０９　（２Ｈ，
ｄ　、　Ｊ＝８．８Ｈｚ　）元素分析の結果は次のとお
りであった。

元素分析結果（％） ＣＨＮ 実測値　　４８．７５　　４．０８　　７．１２計算値
　　４８．４８　　４．０７　　７．０７（Ｃ１６ＨＩ
６ＮｚＯａＳとして） 以上の結果から下記の構造体である事が確招された。

Ｓ　−ＣＨ２−ＣＨ，−ＣＯＯＨ ■　■で得られた生成物２００■を４　ｖｒｌのＴＨＦ
に溶解し、この溶液と６７ｗ１ｉのアラニンを２　ｍｌ
の０．１　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，５）に溶解し
た水溶液とを混合し室温で２時間攪拌した。水層を分離
しセファデックス’Ｇ−２５（７丁・レーシャ社製）の
２．８Ｘ１３５σのカラムを用い０．５　Ｎ酢酸液を溶
出液としてゲルρ過を行った。

ＵＶ２９５ｎｍでの吸光度測定により検出して目的の分
画を分取後、凍結乾燥を行い生成物を得た。

収：ｄ６０■　収率３２％　融点４４−４６　℃ Ｎ　１’ｖＩ　Ｒスペクトル分析の結果は次のとおりで
あった。

ＮＭＲ（ＤＩＶＩＳＯ−ｄ、　）　　δ１．３９　（８
Ｈ、ｄ　、　Ｊ＝７．２Ｈｚ　）２．５６−２．７７（
４Ｈ，ｍ、） ４．４１　（ｉ　Ｈ、ｄｏｕｂｌｅｔ　ｏｆ　ｑｕａｒ
ｔｅｔ。

Ｊ＝７．２Ｈｚ　、　７．２Ｈｚ　） ４．７４（ＩＨ，ｔ、Ｊ＝８．２Ｈｚ）５．１９　（２
Ｈ、ｄ　、　Ｊ＝８．２Ｈｚ　）７．５５（２Ｈ，ｄ、
Ｊ＝８．１Ｈｚ）７．８５（２Ｆ（、ｄ、Ｊ＝８．１Ｈ
ｚ）８．６７　（ＩＨ、ｄ　、　Ｊ＝７．２Ｈｚ　）元
素分析の結果は次のとおりであった。

元素分析結果（％） ＣＨＮ 実測値　　４７．９９　　４．８９　　　’１．２’Ｔ
計算値　　４７．４８　　５，０５　　７．３８（Ｃ１
５Ｈ１８Ｎ２０７Ｓ−０，５Ｈ２０として）以上の結果
から、下記の構造の結合体が得られたことが確請された
。

Ｓ　−ＣＨ２−ＣＨ，−ＣＯＯＨ Ｃ０−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯＯＨ 蕃 ＣＨ。

＃１ＦＩＪ４　　　　　　　　　。

実施厨１合成されたＮ−サクハジルー ｐ−（２−二トロビニル）−ベンゾエート１００■を２
　ｍｌのＤＭＦに溶解し、この溶液にシスティンの塩酸
塩６０ηを２　ｍｌの水に溶解した溶液を加え、ｐＨ１
，５に調整し室温で３０分間反応した。反応液のＵＶｍ
ａｘは３０３　ｎｍから２８０ｎｍに変化しＴＬＣで分
析の結果出発物質は消失していた。次にエバポレーター
で溶媒を除去後残渣に水を加え粉末を析出せしめた。得
られた粉末をＤＭＦに溶解しアラニン１５Ｂ■を含有す
る水溶液と３５μｅ　のＮ−メチルモルホリンを加えて
反応した。室温で一晩反応後反応溶液を濃縮し、濃縮液
をセファデックス■Ｇ−２５（ファルマシャ社製）の２
．３Ｘ１８５ｃｒｎのカラムを用い０．５Ｎの酢酸液を
溶出液としてゲル漏逸を行った。

ＵＶ３ＱＱｎｍでの吸光度測定により検出して目的とす
る分画を分取し、凍結乾燥を行ない生成物を得た。

収量２３６ｑ　収率１７．８％　融点 １５１）：（ｄｅｃ） さらに６ＮＨＣ６で加水分解後のアミノ酸分析によりア
ラニン：システィン＝１：０．８８であることがわかっ
た。

ＮＭＲスペクトル分析の結果は次のとおりである。

ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）　　δ １．８８（３Ｈ，ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ）２．９０（２Ｈ
，ｄ　、Ｊ＝５．２Ｈｚ）８．５０−８．４４（ＬＨ，
ｍ） ４．４０　（ＬＨ、ｄｏｕｂｌｅｔ　ｏｆ　ｑｕａｒｔ
ｅｔ。

Ｊ＝７．２Ｈｚ　、　７．２Ｈｚ　） ８．６７（ＩＨ，ｄ、Ｊ＝７．２Ｈ７）元素分析の結果
は次のとおりであった。

元素分析結果（％） ＨＮ 実測値　　４４．９１　　５．０６　　９．９５計算値
　　４４．６６　　５．２５　　１０．４２（Ｃ５ａＨ
ｓｅＮｓ　Ｏｙ　Ｓ　−Ｈ２０として）以上の結果から
下記の構造の結合体カイ得られたことが確認された。

Ｃ０−Ｎｆ（−ＣＨ２−ＣＯＯＨ ＣＨ３ 参考例５ 実施例２で得られたＮ−サクシンイミジルーＩｎ−（２
−二トロビニル）−ベンゾニー１３４０Ｗりを４ゴのＴ
　ＨＦに溶解し、この溶液と１０２μｅ　のメルカプト
プロピオン酸を２　ｔｔｔｌの０．１Ｍリン酸緩衝液ｐ
Ｈ８，０に溶解した水溶液とを混合して室温で８０分間
反応した。有機層を分離後水で洗浄し、この有機Ｉｔ・
）を２０９　’Ｑのアラニンをｏ、　ｔ　Ｍリン酸緩衝
液ｐ　Ｈ７，５に溶解した水溶液と１）１合し室温で２
時間攪拌した。反応液をセフ　ｙ　５’　ッ９　Ｚ■Ｇ
　−２５（７７／、？、ヤ社製）２．１３Ｘ１８０ｃｍ
のカラムで溶出液として０．５　Ｎ酢酸水溶液を用いて
ゲル口過を行った。ＵＶａ　ｇ　ｏ　ｎｍでの吸光度測
定により検出して目的の分画を分取し凍結乾燥を行って
生成物を得た。

収ｆｔ６８り　収率１６％ ５　Ｎ　−ＨＣｌで分解後アラニンの定量を行ったとこ
ろ回収率８４％であうた。

ＮＭＲスペクトル分析の結果は次のとおりであった。

ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）　　δ １．４２（’ＩＨ，ｄ、Ｊ＝７．４Ｈ７）２．５１−２
．８０　（４Ｈ，ＩＴＩ）４．４４　（ＬＨ、ｄｏｕｂ
ｌｅｔ　　ｏｆ　ｑｕａｒｔｅｔ　　Ｊ＝７．４Ｈｚ　
、　７．４Ｈｚ　） ４．７４（ＬＨ，ｔ、Ｊ＝８．０Ｈ２）５．１９（２Ｈ
，ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ）７．４０−７．９４（４Ｈ，ｍ
） ８．６８（ｌＨ，ｄ、Ｊ＝７．４Ｈｚ）元素分析の結果
は次のとおりであった。

元素分析結果（％） ＣＨＮ 実測値　　４８．４Ｌ　　　４．８８　　７．６４Ｆｉ
ｔ算値　　４８，６４　　４．９０　　７．５６（Ｃ，
、Ｈ，８Ｎ２０□Ｓとして） Ｌ’ｌ、上の結果から下記の構造であることが確認され
た。

５−ＣＨ，−Ｃ）１２−ＣＯＯＨ Ｃｏ−ＮＨ−ＣＨ，−ＣＯＯＨ ＣＨ３ 参考例６ 参考例−１で得られたｈＧＲＦの誘導体のＤＭＦ溶液に
実施例３で得られた２、４−ジニトロフェニル−ｐ−（
２−二トロビニル）−ベンゾエート１０■を１　ｍｌの
ＤＭＦに溶解した液８９μ４を加えた。室温で３０分間
攪拌を行った後、反応液のエルマン反応を行ったところ
４１２ｎｍの吸光度が初期のＯ，Ｑ　８０から０．００
５に変化し反応液中のチオール基が減少した事が確認さ
れた。

反応液にエーテルを加え−Ｃ沈澱を析出せしめ、ニーデ
ルでｌ５１）：争議２　ｔｇｌのＤ　１Ａ　Ｆ−水（１
：ｌ）に溶解した。Ｎ−メチルモルホリンでｐＨを７．
５％こ調整し牛ｔｍ［アルブミン（ＢＳＡ）５．０■を
１　ｍｌの水に溶解した水溶液を加えた。室温で４時間
攪拌後反応液をセフ、そデックス■Ｇ−２５（ファルマ
シャ社製）１．８Ｘ６０ｃｍカラムを用いてＩＮ酢酸水
溶液を溶出液としてゲル濾過を行った。素通り画分を分
取し凍結乾燥を行いｈＧＲＦとＢＳＡ　　の結合体を得
た。収量７．７０〜。ＢＳＡ及び得られた結合体を６Ｎ
塩酸で加水分解後アミノ酸分析を行った。Ｂ５Ａ１５Ａ
に１７個のヒスチジンが存在する事及びｈＧＲＦにはヒ
スチジンが存在しない事からいずれも内部標準としてヒ
スチジンを用いこれを１７とした。この結果を表−１へ
）、（均に示した。（ｉ３）−八）はアルブミン１分子
に結合したｈ　Ｇ　１．＜　Ｆによるアミノ酸の存在撹
を示す。ｈ　Ｇ　ＲＦ−分子中のアミノ酸の存在に、は
既知であり、これを（Ｃ１に示した。

〔（ｌう’　　ｔＡ））　７　（Ｃ＋はアルブミン−分
子に結合した１〕（刀くＦの個数を示す。約８個のｈＧ
ＲＦがアルブミンに結合した事が確認された。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中Ｃ−Ｚはカルボキシル基の反応性誘 導体をあらわす。〕 であらわされる（２−ニトロビニル）安息香酸誘導体。
2. （２）メタまたはパラ置換体である特許請求の範囲第１
   項記載の（２−ニトロビニル）安息香酸誘導体。
3. （３）Ｚで示される基がＮ−ヒドロキシサクシンイミド
   残基 （▲数式、化学式、表等があります▼）または２，４−
   ジニトロフェノ キシ基である特許請求の範囲第１項または第２項記載の
   （２−ニトロビニル）安息香酸誘導体。