JPS6075326A - ポリイオン性マイクロ封入 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は半透膜の中に心材を封入することに関する。よ
り詳細には、本発明は生育（マｔａｂｌｅ　）細胞を包
含するｐＨ，温度又はイオン強度感応性の心材をマイク
ルカプセル内に封入する方法に関する。本明細書中に開
示する封入方法は心材をそこなうことなく半透膜の形成
を可能にする。本発明は、また、アミノ化ポリマー内層
がアニオン性ポリマー外層にイオン結合したカプセルに
関する。

従来の技術 心材をマイクロ封入する数多くのプロセスが開発されて
きたが、これらのプロセスのほとんどは、封入に苛酷な
条件が必要なために、ｐＨ，温度又はイオン強度−感応
性物質、例えば生育細胞に対して用いることができない
。米国特許４，５５２，８８３号は、生育組織又は細胞
を半透膜の中にうまく封入する最初の方法と考えられる
ものを開示している。該特許方法では、ゲル性物質、好
ましくけアルギン酸ナトリウム等のアニオンガムの一時
カプセルを組織或は細胞の回りに形成し、一時カプセル
の表面層を橋かけさせて耐久性半透膜を形成する。特に
は、ガムと心材との混合物をゲル化溶液、好ましくはカ
ルシウム溶液に露呈させて一時カプセルを作る。生成し
た一時カプセルをポリカチオン物質の溶液と反応させて
耐久膜を形成する。カプセルの内部はアニオンガムが液
体になる条件を再確立して、すなわちカプセルをリン酸
塩級衝塩水中に置くことによってイオン環境を変えて再
液化することができる。カプセルの内部を再液化するこ
とによって膜を横切る栄養分の移動が可能になって細胞
の増殖を促進させる。該方法では、封入プロセスに用い
る温度、イオン強度、ｐＨの範囲を苛酷にする必要がな
いから、心材をそこなったり或は細胞の生育力を妨げた
りしない。

よって、本発明の目的は生育細胞或はその他の脆い物質
を半透膜の中に封入する方法を提供することである。別
の目的は、ｐＨ，イオン強度、装填又は温度感応性であ
るために公知の方法を用いてはカプセルに包むのが難か
しい心材を封入する方法を提供することである。本発明
のそれ以上の目的は半透膜から成る改良されたカプセル
を提供することである。本発明のこれやあれやの目的及
び特徴は以下の説明から明らかになると思う。

発明の要約 問題点を解決するための手段 本発明は、　Ｔ１１様において、酵素、抗体、ホルモン
或は生育細胞、例えば組織培養又は遺伝学的に変性した
細胞等の心材を半透膜の中に封入する方法を特徴とする
。心材を、カチオン基を含有する多糖、好ましくはポリ
グルタミン酸積ン）を含有するアミノ化多糖を溶渭した
水性培地中に懸濁さする。懸濁液の液滴を、液滴を二価
又は多価のアニオン、例えばＰＯ４″″、ＨＰＯ４″″
又はＳ０４　塩の溶液を露呈さゼでゲル化する。一時マ
トリックスの表面層をアニオン性、好ましくはマ（リツ
クスのカチオン基と反応するカルボキシル基を含有する
ポリマーにより橋かけさせて耐久膜を形成する。ポリ−
Ｌ−グルタミン酸及びポリーＬ−アスパラギン酸は酸或
は塩のどちらかとして好適なアニオン性ポリマーである
。カプセルヲ低分子量ポリカチオン、例えばスペルマシ
ン、スペルミンは尿素の溶液に露呈させてカプセルの内
部を再溶解させることができる。内部を再液化すること
により、カプセル外の流体とカプセル内容積との間の物
質移動が促進される。

本発明は、別の態機においては、生育細胞を半透膜の中
に封入する方法を特徴とする。細胞をアミノ化グルコ多
糖を含有し、細胞の生育力に適合した水性培地中に懸濁
させる。懸濁液の液滴をゲル化溶液に露呈させ”Ｃ保形
性、水不溶性の一時マトリックスを形成する。ゲル化溶
液は二又は多価アニオン、例えばリン酸塩、−価（ｍｏ
ｎｏｈｙｄｒｉｃ）リン酸塩又は硫酸塩の水溶液である
。カプセルを複数のカルボキシル基を含有するポリマー
、例えばポリグルタミン酸又はポリアスパラギン酸に露
呈させて一時マトリックスの表面層を耐久的に橋かけさ
せる。カプセルを低分子１７Ｎポリカチオン、例えばス
ペルマシン、スペルミン又は尿素の溶液にｂｉ呈させる
ことによって、カプセルの内部を実質的に沈殿剤の存在
しない反応で再液化させる。

再液化は内部ゲルから多価アニオンを取り除くことによ
って生じる。ｌ１４１織増殖培地中の咄乳類組繊細胞及
び増殖培地中の遺伝学的に変性したＷ、核或は真核細胞
をこの方法によって封入することができる。封入手順が
混和であるから、封入することができる。封入手順が温
和であるから、封入された細胞はそこなわれずかつカプ
セル内の増殖及び生殖を含む通常の新陳代ｔｌ’Ｍプロ
セスを受けることができる。

本発明は、それ以上の態様において、カプセル内の閉釧
容積を定める膜を有するカプセルを特徴とする。膜はポ
リアミノ化ポリマー、好ましくはアミ／化多砧、最も好
ましくはアミノ化グルコ多糖の内層をポリアニオン°跣
ポリマー、好ましくはポリグルタミン酸又はボリアスバ
フギ酸等のポリカルボキシル化ポリマーの外？ｌにイオ
ン的に橋かけさせて有して水不溶性耐久カプセルを形成
する。

細胞、好ましくは真核、菌又は遺伝学的に変性した細胞
を細胞内容積中に配置する。ことができる。

細胞を細胞内容積中に配置する場合には、ポリアニオン
性及びポリアミノ化ポリマーは生理学的に細胞と適合す
べきである。

好適な実施態様の説明 本発明は心材、例えば天然産或は遺伝学的に変性した生
育真核又は原核の細胞又は組織培養を半透膜の中に封入
する方法を提供する。また、本発明は新しい型の多層カ
プセルをも提供する。

カチオン基を含有する多糖又はグルコ多糖を多価アニオ
ンに反応させて心材又は生育細胞の回りにゲル又は一時
マトリックスを形成する。生成した一時マトリックスの
表面層を、心材を封入する耐久膜を形成するアニオン、
好ましくはカルボキシル基を含有するポリマーによって
イオン的に橋かけさせる。カプセルを低分子がポリカチ
オンの溶液に一露呈させてカプセルの内部を再液化させ
ることができる。

心材、例えば酵素、ホルモン、抗体或は生育細胞を、ゲ
ル性、カチオン基含有ポリマーを含有する水性培地中に
懸濁させる。好ましいゲル性ポリマーはアミノ化グルコ
多糖であり、最も好ましくはキトサン（ポリ−ローグル
コサミン）である。

キトサンは無背椎動物の外骨格の主成形材料であるキチ
ン（ポリーＤ−Ｎ−ア七チルグルコサミン）を酸加水分
解させて形成する。キトサンは長鎖のアミノ化ポリマー
で、はとんどの細胞と生理学的に適合し得る。キトサン
は水に極めてわずかしか溶けないが、希酢酸には容易に
溶解し得る。

キトサンの保存溶液はキトサンを（１，５モル濃度の酢
酸に溶解させて作る。酢酸をリン酸塩緩衝液（ＰＢＸ）
に対しくり返し透析させて溶液から取り除く。溶液を３
７°Ｃよりも低温に保つならば、キトサンはこの溶液か
ら析出しない。ＰＢＳ中キトサンｔ−４％の好適な保存
溶液を４℃において長期間保存しても問題無かった。

上述したように調製したキトサンを被封入物質と混合し
、溶液又はスラリーを形成した後に液滴又はその他の形
状に形成する。キトサンの最終濃度０．４％（、／マ）
の溶液でもゲル化するが、最適のゲル化は等張の１２５
　ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４中キトサン０、８−１２％（ｖ
／ｖ）で得られる。キトサン／心材懸濁液の液滴は任意
の慣用液滴形成装置によって形成し得る。かかる液滴形
成装置の内の１つを以下に説明する。

懸濁液を収容するチューブを液滴形成装置を保持するス
トッパーに取り付ける。装置は上部空気吸入ノズルを有
する外被とストッパーの中に取り付けた細長い中空体摩
擦とから成る。スラッピングポンプを設置した１０ＣＣ
の注射器の針を外被の頂部にのせる。該針は、例えば内
径０．０１インチ（ｏ、２ｓｍ）のテフロン波器した針
で、外被の長さを貫いて通る。外被の内部は、針の先端
をエアナイフとして作用する空気の一定層流に露呈させ
るように設計する。使用する場合、ステッピングポンプ
を作動させて針の先端から溶液の液滴を漸増して強制的
に出させる。各々のしずくは空気流によって切り離され
ておよそ２．５　ｃｍ落下してゲル化溶液、好ましくは
リン酸水素二ナトリウム溶液の中に入り、そこで負イオ
ンとの反応により直ちにゲル化される。針の先端とゲル
化溶液の表面との間隔は、キトサン／心材懸濁液をして
物理的に最も好都合な形状；球（最小の表面積で最大容
積）をとらせる程の大きさにするのが好ましい。チュー
ブからの空気はストッパー内の開口部を通って流れ出る
。この手順がゲ〃を橋かけしかつ懸濁した心拐及びその
培地を収容する高粘度の保形性保設一時マトリックスを
形成するに至る。一時マトリックスは溶液中に分離相と
して集まり、かつ吸す１することによって分離すること
ができる。

好ましい多価ゲル化溶液は１２５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４
溶液であるが、−塩基性リン酸ナトリウム及び硫酸ナト
リウム溶液もまた容認し得る一時マトリックスを生成し
た。クエンｎタナトリウムは懸濁液をゲル化することが
できるが、最良の結果は一塩基性或は二塩基性リン酸塩
及び硫酸溶液の場合に得られる。アニオンレベルが低す
ぎる（例えば、およそ１００ｍＭよりも低い）場合には
、ゲル化は生じない。

本方法によって形成した一時マトリックスを集め、洗浄
して過剰のゲル化溶液を取り除く。次いで、マトリック
スをポリアニオン性１好ましくはポリカルボキシル化ポ
リマーのコーティング又は橋かけ溶液に露呈させる。好
ましい橋かけ溶液はポリーＬ−アスパラギン酸又はポリ
−Ｌ−グルタミン酸の１％溶液で、工水を塩化ナトリウ
ムにより１：１５に希釈して最終のポリマー濃度＆６Ｘ
４ １０　グ／１００＋ｍを与える。ポリーＬ−アスパラギ
ン酸又はポリーＬ−グルタミンｎの分子鼠は４０００−
１００．０００ダルトン又はそれ以上の範囲になり得る
が、２５．　ＯＤ　Ｄ　−６０，０００ダルトンの範囲
が好ましい。周囲の室温において反応時間５−６分が満
足すべきものであることが分かった。

以下の実施例は本発明を実施するための好例の手順を挙
げるものであって、以下の実施例に制限されない。

実施例１ 前述したように調製した等張のＰＢ８１４−１７ｍＭ（
Ｗ／マ）中キトサン（Ｃ８Ｎ−シグマケミカル社）１４
％の保存溶液を本実験において使用した。異る濃度のＣ
８Ｎについて試験して一時マトリックスの形成に最適な
Ｃ８Ｎ濃度をめた。各々の場合において、Ｃ８Ｎ保存溶
液と子牛胎児血清（Ｆｅ２−７０−ラボラタリーズ）と
から１　ｍｇの試料を生成した。上記の如き液滴形成装
置を用いて以下に説明する通りに液滴を作って溶液中に
導入した。表１は本実験で試験した６つの異るＣ８Ｎ濃
度（ｗ／ｖ　）　ｌ　６％、０．８％、１％について例
示する。

表１ １　α５７　０．４３　０．８％ ２　０．４２　α５８　０．６％ ５　（１７２α２８　１０％ ２種類のゲル化緩衝液、１１０ｍＭのクエン酸ナトリウ
ム（シグマ）及び１２５ｒｎＭのリン酸水素二ナトリウ
ム（シグマ）を調製した。全ての場合において、これら
の緩衝溶液を用いて形成した一時マトリックスは容認し
得るものであったが、クエン酸ナトリウム級衝液は試料
番号１の不適当なゲル化を生じた。リン酸水素二ナトリ
ウム緩衝液中では全ての試料が容認し得る一時マトリッ
クスを形成したが、試料３が最良のゲル化を与えた。

ポリーＬ−アスパラギン酸（分子Ｓｉｔ　４　Ｑ、　０
００ダルトン−シグマ）の１％溶液を塩化ナトリウム（
シグマ）１５０ｍＭで１：１５に希釈して６．６Ｘ１０
　ｆ／１００ゴの溶液を形成した。試料３から作った一
時マトリックスをゲル化緩衝液から取り出し、等張ＰＢ
Ｓでくり返し洗浄し、ポリーＬ−アスパラギン酸溶液中
に再Ｑｍさせた。ポリ−１、−アスパラギン酸溶液中室
温で６１１）経過した後に、橋かけ反応が完了し、耐久
膜を形成した。

カプセルは実質的に球形で、１自径約５８０−４８０ミ
クロンであった。小さな尾状物を有するカプセルがいく
つかあった。この方法により形成したカプセルは粘着性
でなくかつ凝集する（　ｃｌｕｍｐｉｎｇ　）傾向を有
していなかった。カプセルの多孔度を経静的にめたとこ
ろ約８０．　ＯＯＯダルトンであった。本実施例は、本
発明の方法を用いて容認し得るカプセルを形成すること
ができることを示す。

実施例２ 細胞の生育力が封入プロセスによってそこなわれないこ
とを示すために本実施例を行った。本実験に使用した細
胞培養は、懸濁培養中で容易に増殖するマウス赤面白血
病系であるフレンドエリトロリューケミツク（Ｆｒ１ｅ
ｎｄ　Ｅｒｙｔｈｒｏｌａｕｋｅｍｉｅ）細胞系（ＦＥ
Ｌ７４５　）であった。

Ｆ　Ｅ　Ｌ７４５細胞の培養を５分間遠心分離して生成
シタヘレットを子牛胎児血清（７０−ラボラタリーズ）
中にスラリーとして再懸濁させた。１４％キトサンの保
存溶液を前述した通りに調製しかつ細胞培養溶液と混合
して最終のキトサン濃度１％（ｖｒ／ｖ　’）及び細胞
濃度約５　Ｘ　１０’細胞／ｍｙ、を与えた。キトサン
−細胞混合物を液滴形成装置（前述した）の中に強制的
に通して生成した液体微小球を前述した１　２５　ｍ　
Ｍ　（ｗ／マ）のリン酸塩イオン溶液に接触させること
によって一次マトリックスを作った。生成した一時マト
リックスを等張ＰＢＳでくり返し洗浄し、塩化ナトリウ
ム１５０ｍＭ中ポリ−Ｌ−アスパラギン酸（分子ｉ４０
，０００ダルトン）６．６Ｘ１０　ｆ／１００ｍ／（ｖ
／ｖ）の溶液に再懸濁させた。ポリーＬ−アスパラギン
酸の溶液中室温で６分経過した後に、生成したカプセル
を１０％の子牛胎児血清及び抗生物質を含有する培地Ｒ
ＰＭＩ−１１５４０（フローラボラタリーズ）で２回洗
浄した。マイク四カプセルを培地を有する組織培養フラ
スコの中に入れ、５％のＣＯ２雰囲気において５７℃で
培養した。

細胞培養の試料を種々の間隔で取り出した。顕微競下の
調査では細胞が増殖しがっ生殖していることを示した。

このことは封入手順後の細胞の生育力を示す。気付くよ
うに、フレンド細胞はゲル培養並びに懸濁培養中で増殖
し得るので再液化工程を用いなかった。しかし、多くの
型の細胞は生殖するのに液体培養を必要とする。細胞の
生育力はカプセル内部の再可溶化によって影響されない
。

カプセルは外部汚染の存在しない小繁殖圏（マイク四エ
ンバイアｐンメント）を提供する。

当業者であれば本明細書中で説明した本発明の範囲内の
方法及び生成物のその他の変更或は実施態様を見出すか
もしれない。従って、その他の実施態様は特許請求の範
囲内にある。

同　風間弘志１１゛） 手続補正書 昭和５９年１１月　６０ 特許庁長官　志　賀　宇　殿 事件の表示　昭和５９年特　願第　１８０８５１、発明
の名称　ポリイオン性マイクロ封入ｈｌｉ正をする省 事件との関係　特許出願人 名称ティモン・バイオチク・インコーポレイテッド代理
人 〒１０３ 住　所　東京都中央区ｌ」本橋３−Ｊ車１１３番１１号
油脂工業会館−一刊ｔｉ＋二より乙噌加すズ、−哨す男
ｖ）ｔ’−””１１ｊ）正の対象 願Ｖｌの出願人の楠 安住状及びその屓文　各１ｉｉ９ 明細団 補正の内容　別紙の通り 明細代の浄諮（内容に変更なしン

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｔ　以下の工程： Ａ、心材をカチオン基から成る多糖を溶解した水性培地
   中に懸濁させ、 Ｂ、懸濁液を該心拐を含有する液滴に形成し、Ｃ９液滴
   をアニオン溶液に露呈させて液滴を離散状の保形性一時
   マトリックスとしてゲル化し、Ｄ、該一時マトリックス
   を該カチオン基と反応性のアニオン基を含有するポリマ
   ーに露呈させることによって一時マトリックスの表面層
   を橋かけさせて該液滴の回りにカプセルを作る から成る心材を半透膜の中に封入する方法。 ２、　カチオン基を含有する前記多糖がアミノ化多糖で
   ある特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、　前記アミノ化多糖がキトサンである特許請求の範
   囲第２項記載の方法。 ４、　前記アニオンをリン酸塩、二塩基性リン酸塩、硫
   酸塩及びこれらの混合物から成る群より選ぶ特ｉｒｒ請
   求の範囲第２項記載の方法。 ＆　前記アニオン溶液を前記アニオンの塩を水溶液中に
   溶解させて調製する特許請求の範囲第４項記載の方法。 ＆　アニオン基を含有する前記ポリマーがカルボキシル
   基から成る特許請求の範囲第２項記載の方法。 ２　カルボキシル基から成る前記ポリマーをポリアスパ
   ラギン酸、ポリグルタミン酸、これらの塩及びこれらの
   混合物から成る群より選ぶ特許請求の範囲第６項記載の
   方法。 ＆　更にゲルを前記カプセルの中で再可溶化させる追加
   の工程から成る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ２　カプセルヲ低分子量のポリカチオンの溶液に露呈さ
   せてゲルを再可溶化させる特許請求の範囲第８項記載の
   方法。 １α前記低分子Ｉポリカチオンをスペルマシン、スペル
   ミン、尿素のカチオン及びこれらの混合物から成る群よ
   り選ぶ特ＦＴ−請求の範囲第９項記載の方法。 １１　ＦｉｉＪ記心材全心材、抗体、ホルモン、生育細
   胞から成る群より選ぶ特許請求の範囲第１項記載の方法
   。 １ｚ　前記生育細胞が組織培養成はこれの単一細胞から
   成りかつ前記水性培地が組織培養基から成る特許請求の
   範囲第１１項記載の方法。 １３、前記生育細胞が遺伝学的に変性した細胞から成る
   特許請求の範囲第１１項記載の方法。 １４、以下の工程： ａ、細胞を該細胞の生育力に適合し得る水性培地中に懸
   濁させ、該培地はアミノ化グルコ多糖を含有し、 ｂ、懸濁液を該細胞を含有する液滴に形成し、Ｃ１液滴
   をゲル化溶液に露呈させて液滴をゲル化しかつ保形性、
   水不溶性の一時マトリックスを形成し、該ゲル化溶液は
   アニオンの水溶液から成り、 ｄ、該一時マトリックスを複数のカルボキシル基を含有
   するポリマーに露呈させることによって一時マトリック
   スの表面層を耐久的に橋がけさせて該液滴の回りに膜を
   作る から成る生育細胞を半透膜の中に封入する方法。 １！５．工程ｄの生成物を実質的に沈殿剤の存在しない
   反応でゲルからアニオンを取り来る低分子量ポリカチオ
   ンの溶液に露呈させることによって前記膜の内部を再液
   化する追加の工程から成る特許請求の範囲第１４項記載
   の方法。 １＆前記ゲル化溶液がリン酸塩、二塩基性リン酸塩、硫
   酸塩及びこれらの混合物から成る群より選ぶアニオンの
   塩の水溶液である０許請求の範囲第１４項記載の方法。 １７枚数のカルボキシル基を含有する＋ｉｌ記ポリマー
   をポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、これらの塩
   及びこれらの混合物から成る群より選ぶ特許請求の範囲
   第１６項記載の方法。 １８、前記低分子量ポリカチオンをスペルマジン、スペ
   ルミンのカチオン及びこれらの混合物がら威る群より選
   ぶ特許請求の範囲第１７項記載の方法。 １９　前記生育細胞が咄乳類の組繊細胞から成り、かつ
   前記水性培地が組織増Ｍ培養から成る特許請求の範囲第
   １１項記載の方法。 ２α前記生育細胞が遺伝的に変性した細胞から成り、か
   つ前記水性培地が増殖培地から成る特許請求の範囲第１
   ８項記載の方法。 ２１　カプセル内の閉鎖容積を定める膜から成り、放膜
   は本質的にポリアミノ化ポリマーから成る内層とポリア
   ニオン性ポリマーから成る外層とから成り、該ポリアミ
   ノ化及びポリアニオン性ポリマーを該ポリアミノ化ポリ
   マーのカチオン性アミン基と該ポリアニオン性ポリマー
   のアニオン基との間のイオンの相互作用によって橋かけ
   させて水不溶性、透過性カプセルを形成することから成
   るカプセル。 ２２、前記ポリアミノ化ポリマーがアミノ化多糖である
   特許請求の範囲第２１項記載のカプセル。 ２３、前記アミノ化多糖がポリアミノ化グルコ多糖であ
   る特許請求の範囲第２２項記載のカプセル。 ２４　前記ポリアニオン性ポリマーがポリカルボキシル
   化ポリマーから成る特許請求の範囲第２１項記載のカプ
   セル。 ２５、前記ポリアニオン性ポリマーがポリアスパラギン
   酸又はその塩である特許請求の範囲第２４項記載のカプ
   セル。 ２６、前記ポリアニオン性ポリマーがポリグルタミン酸
   又はその塩である特許請求の範囲第２４項記載のカプセ
   ル。 ２７　更に細胞を前記カプセル内の容積の中に該細胞用
   培地の中に配置させて成る特許市゛Ｉ求の範囲第２１項
   記載のカプセル。 ２８、前記ポリアミノ化ポリマー及び前記ポリアニオン
   江ポリマーが前記細胞と生理学的に適合し得る特許請求
   の範囲第２７項記載のカプセル。 ２９　前記細胞が真核細胞から成る特に′１゛請求の範
   囲第２７項記載のカプセル。 ３０、前記細胞が遺伝学的に変性した細胞から成る特許
   請求の範囲第２７項記載のカプセル。